NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN NHÃN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KĨ THUẬT SSR (MICROSATELLITE) Khuất Hữu Trung 1 , guyễn Trường Khoa 1 , Trần Minh Hoa 1 , gô Hồng Bình 2 , Lê Thị Tươi 3 , guyễn Xuân Viết 3 , Đặng Trọng Lương 1 SUMMARY Studying of genetics diversity of native longans in Vietnam utilizing SSR technique Longan is an important crop in agricultural systems in Vietnam. The information on level of genetic diversity and origin is very important for conservation gene resource, selection and development of commercially important longan. In our study, 10 SSR markers derived from lychee-a close kinship with longan- were used to evaluate genetic diversity of local cultivars of longan. Genomic DA was extracted from 48 samples belong to 22 local cultivars for the PCR amplification of the SSR loci. The PCR products were resolved on denaturing polycrylamide gel. A total of 27 alleles were detected with an average of 2.7 alleles per locus. Polymorphism information content (PIC) value ranges from 0.0 to 0.75, with an average of 0.24. Heterozygosity percentage ranges from 0% to 30% data missing is 15%. Genetic similarity was determined using Jaccard’s similarity coefficient and final dendrogram construction using a UPGMA clustering methods showed that 48 samples were divided into 9 distinguished heterotic groups with genetic similarity from 0.22 to 1.0. All of the information has diversified application in longan study in the future. Keywords: Dimocarpus longan, native, genetic diversity, heterozygosity, SSR makers. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây nhãn (Dimocapus longan Lour.) thuộc họ Sapindaceae là loài cây ăn quả nhiệt đới có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta, nhãn được trồng phổ biến và tập trung tại một số khu vực hình thành các vùng chuyên canh với nhiều giống nhãn nổi tiếng như: Nhãn lồng Hương Chi và nhãn Đường Phèn của Hưng Yên, nhãn cùi của Lào Cai, nhãn tiêu Da Bò của Bà Rịa-Vũng Tàu, nhãn xuồng Cơm Vàng của Tiền Giang Các giống nhãn của Việt Nam chủ yếu được chọn lọc, nhân giống và bảo tồn một cách tự phát, các cá thể có phNm cht tt ưc nhân lên, di thc và ưc t tên ch yu da vào mt s các c im hình thái hoc a im phát sinh. Vì vy, ã gây ra s nhm ln và hiu sai v xut x, ngun gc bn a và mi quan h di truyn gia các ging. ây cũng chính là nguyên nhân làm thu hp a dng di truyn và dn n tình trng xói mòn ngun gen nhãn [2]. Chin lưc bo tn tài nguyên a dng di truyn, nhn dng chính xác các ngun gen phc v công tác lưu gi và ăng kí bn 1 Vin Di truyn N ông nghip; 2 Vin N ghiên cu Rau qu; 3 i hc Sư phm Hà N i. quyn nhng cây trng bn a, c bit là nhng cây có giá tr kinh t cao là rt cn thit. Tuy nhiên,  Vit N am các báo cáo v cây nhãn mi ch tp trung ch yu vào nghiên cu các c tính nông hc và nghiên cu a dng di truyn  mc hình thái [3,4]. Trong báo cáo này chúng tôi s dng 12 mi SSR ã ưc thit k cho cây vi là mt cây ăn qu có quan h di truyn gn vi cây nhãn  nghiên cu a dng di truyn ca tp oàn nhãn bn a ca Vit N am. II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu - Vt liu s dng bao gm 48 mu thuc 22 ging nhãn bản địa của Việt Nam được thu tại vườn tập đoàn của Viện Nghiên cứu Rau quả-Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội; Viện Cây ăn quả miền Nam-Long Định, Tiền Giang; và tại các địa phương đang trồng phổ biến các giống nhãn này (bảng 1). Bảng 1. Danh sách các giống nhãn nghiên cứu TT Tên mẫu Nguồn gốc Địa điểm thu mẫu 1 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 2 Nhãn lồng B14 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 3 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 4 Nhãn cùi (YB-10) Yên Bái Viện Nghiên cứu Rau quả 5 Nhãn cùi (YB-28) Yên Bái Viện Nghiên cứu Rau quả 6 Nhãn cùi (LC-4) Lào Cai Viện Nghiên cứu Rau quả 7 Nhãn cùi (LC-9) Lào Cai Viện Nghiên cứu Rau quả 8 Nhãn cùi (LC11) Lào Cai Viện Nghiên cứu Rau quả 9 Đường Phèn Hưng Yên Hưng Yên Địa phương 10 Nhãn cùi (HTM-1) Hà Tây Viện Nghiên cứu Rau quả 11 Tiêu Da bò Tiền Giang Viện Cây ăn quả miền Nam 12 Xuồng Cơm Vàng Tiền Giang Viện Cây ăn quả miền Nam 13 Nhãn tiêu Lá Bầu Tiền Giang Viện Cây ăn quả miền Nam 14 Nhãn nước N1 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 15 Nhãn thóc T1 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 16 Nhãn lồng B10 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 17 Nhãn cùi B5 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 18 Nhãn lồng B7 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 19 Nhãn lồng DH3 Phú Thọ Viện Nghiên cứu Rau quả 20 Nhãn lồng VT22 Vĩnh Phúc Viện Nghiên cứu Rau quả 21 Nhãn lồng TQ20 Tuyên Quang Viện Nghiên cứu Rau quả 22 Nhãn cùi C2 Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả - 12 cp mi SSR ưc s dng có ký hiu t LMLY1 n LMLY12 (bng 2) do hãng Invitrogen cung cp da vào các thông tin v trình t lp, kích thưc, s alen trên mi locus ã ưc Viruel và Hormaza phát hin  cây vi (Viruel, Hormaza, 2004). Bảng 2. Tên và trình tự các cặp mồi SSR TT Cặp mồi Trình tự mồi xuôi Trình tự mồi ngược 1 LMLY1 TTTGTGTAATTTGTCGTACTT ATGAAAGATGAGAAGAAAAAG 2 LMLY2 AAGATGAGATGAGTGTTTTTAC GAATACTTTTTGACTTGTTCTC 3 LMLY3 GAGTAGATAAAAATGGTAATGG CACCTACACCTCCCTATATT 4 LMLY4 CAAATAACATGAAAAAGATGA ATGTCAATATGTCAGTGTCTCT 5 LMLY5 TGGAGAGGACATGATTACTA AAAGAGAATTGCACAGAAAC 6 LMLY6 AAGGAATAAAGCTATCAATAAA GATCTCTATCTCATCAAACCT 7 LMLY7 ACCTTCTTGAATAGGATAAAG TCAGATGAGATAGATTAGAAAGA 8 LMLY8 ATGATGGTAGAGGTCAAGTT CCCTATGAGAGAGAAAATATAA 9 LMLY9 CATTATCTTCTTTATTACCA CACAAGTATTTTCTCTGC 10 LMLY10 AATAGGGTTTGTGTAATTTGT ATATCAAAGGCGATAGATTC 11 LMLY11 GTTTTCATATTGGACTTATTTT ACTCATATTTCATTCTCTCACT 12 LMLY12 GAAGCTGTCTTACACTCCAC ACAAACCTAGAAACCAAAAG 2. Phương pháp nghiên cứu - Tách chiết AD tổng số: Lá bánh t ca các mu ging ưc thu thp, x lý và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB như mô tả của Cheng et al. (1994). - Chạy PCR: Các phn ng PCR ưc thc hin theo chu trình nhit: 94 0 C (5 phút), 35-37 chu kì [94 0 C (40s); 55 0 C-60 0 C (30s), 72 0 C (30s-1 phút)] và kt thúc  72 0 C (5 phút). - Điện di sản phm PCR và nhuộm: Sn phNm PCR ưc bin tính trưc khi chy in di trên gel polyacrylamide 4,5% và ưc phát hin bng phương pháp nhum bc. - Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: Kt qu ưc thng kê da vào s xut hin hay không xut hin ca các băng ADN; hệ số PIC (Polymorphic Information Content-Chỉ số thông tin đa hình của mồi) được tính theo công thức: PIC = 1- ΣP i 2 (trong đó P i là tần số xuất hiện của alen thứ i). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Excel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Hệ số PIC, số alen và tổng số băng AD thể hiện trên từng mồi Kt qu phân tích 10 mi SSR vi 48 mu thuc 22 ging nhãn ưc trình bày  bng 3. Bảng 3. Hệ số PIC, số alen/locus và tổng số alen của từng mồi SSR TT Cặp mồi Số alen/locus Tổng số alen/mồi PIC 1 LMLY1 2 44 0,05 2 LMLY2 4 46 0,57 3 LMLY3 3 51 0,31 4 LMLY4 - - - 5 LMLY5 1 48 0,00 6 LMLY6 2 54 0,19 7 LMLY7 3 54 0,12 8 LMLY8 - - - 9 LMLY9 1 42 0,00 10 LMLY10 6 24 0,75 11 LMLY11 4 52 0,41 12 LMLY12 1 43 0,00 Tổng 27 458 2,40 Trung bình 2,7 45,8 0,24 (-): không khuch i  c 22 ging nhãn nghiên cu S liu  bng 3 cho thy: Trong s 12 cp mi SSR ca cây vi, có 10 cp mi khuch i  c 22 ging nhãn nghiên cu thu ưc tng s 27 loi alen, trung bình 2,7 alen/locus. Có 3 cp mi (LMLY5, LMLY9 và LMLY12) ch thu ưc các locus ơn hình; 7 cp mi (LMLY1, LMLY2, LMLY3, LMLY6, LMLY7, LMLY10 và LMLY11) cho các locus a hình. Trong ó: 2 mi ch thu ưc 2 alen, 2 mi thu ưc 3 alen, 2 mi thu ưc 4 alen, 1 mi thu ưc 6 alen (bng 3). Tng s alen thu ưc là 458 (trung bình là 45,8 alen/mi). H s a hình (PIC-Polymorphic Information Content) ca 10 mi dao ng t 0 ( các mi ch xut hin băng ơn hình) n 0,75 ( mi LMLY10 có 6 alen th hin); h s PIC trung bình ca c tp oàn là 0,24. 2. Tỷ lệ dị hợp (H%) của các mẫu giống nhãn nghiên cứu T l các locus d hp (H%) cao nht là 25%  mu N32; các mẫu N10, N17, N34, N42, N46 và N47 có mức dị hợp là 20%; 24 mẫu có mức dị hợp từ 11,1% đến 14,3%; 17 mẫu đồng hợp ở cả 10 locus nghiên cứu (mức dị hợp là 0%). Như vậy, phân tích với 10 locus thì tỷ lệ dị hợp trung bình của cả tập đoàn là khá thấp (8,7%). Kết quả trên cũng cho thấy giữa các giống có sự khác nhau về mức độ dị hợp; giữa các mẫu trong cùng một giống cũng có sự khác nhau ở các locus nghiên cứu. Những kết quả này rất hữu ích để so sánh giữa các giống với nhau, nghiên cứu đa dạng di truyền bên trong giống, xác định nguồn gốc các mẫu giống và nhận dạng chính xác những mẫu giống (cá thể ưu việt) trong tập đoàn phục vụ công tác chọn, tạo và nhân giống. Hình 1. Kt qu in di sn phNm PCR ca 48 mu nhãn vi cp mi LMLY7 (marker φX174) Bảng 4. Tỷ lệ dị hợp (H%) của các mẫu giống nhãn dựa trên kết quả phân tích 10 locus SSR TT Kí hiệu Tên giống H% TT Kí hiệu Tên giống H% 1 N1 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) 0 25 N25 Đường Phèn Hưng Yên 14,3 2 N2 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) 0 26 N26 Đường Phèn Hưng Yên 12,5 3 N3 Nhãn lồng (PH-S99-1.1) 0 27 N27 Đường Phèn Hưng Yên 0 4 N4 Nhãn lồng B14 11,1 28 N28 Nhãn cùi (HTM-1) 0 5 N5 Nhãn lồng B14 0 29 N29 Nhãn cùi (HTM-1) 0 6 N6 Nhãn lồng B14 11,1 30 N30 Nhãn cùi (HTM-1) 10 7 N7 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) 0 31 N31 Tiêu Da Bò 14,3 8 N8 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) 10,0 32 N32 Tiêu Da Bò 25,0 9 N9 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) 10,0 33 N33 Tiêu Da bò 0 10 N10 Nhãn cùi (YB-10) 20,0 34 N34 Xuồng Cơm Vàng 20,0 11 N11 Nhãn cùi (YB-10) 10,0 35 N35 Xuồng Cơm Vàng 11,1 12 N12 Nhãn cùi (YB-10) 11,1 36 N36 Xuồng Cơm Vàng 12,5 13 N13 Nhãn cùi (YB-28) 11,1 37 N37 Nhãn tiêu Lá Bầu 0 14 N14 Nhãn cùi (YB-28) 11,1 38 N38 Nhãn tiêu Lá Bầu 0 15 N15 Nhãn cùi (YB-28) 11,1 39 N39 Nhãn tiêu Lá Bầu 0 16 N16 Nhãn cùi (LC-4) 10,0 40 N40 Nhãn nước N1 0 17 N17 Nhãn cùi (LC-4) 20,0 41 N41 Nhãn thóc T1 11,1 18 N18 Nhãn cùi (LC-4) 12,5 42 N42 Nhãn lồng B10 20,0 19 N19 Nhãn cùi (LC-9) 0 43 N43 Nhãn cùi B5 10,0 20 N20 Nhãn cùi (LC-9) 0 44 N44 Nhãn lồng B7 11,1 21 N21 Nhãn cùi (LC-9) 11,1 45 N45 Nhãn lồng DH3 12,5 22 N22 Nhãn cùi (LC11) 0 46 N46 Nhãn lồng VT22 20,0 23 N23 Nhãn cùi (LC11) 11,1 47 N47 Nhãn lồng TQ20 20,0 24 N24 Nhãn cùi (LC11) 0 48 N48 Nhãn cùi C2 11,1 Trung bình 8,7 3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tập đoàn nhãn nghiên cứu S liu thu ưc t 10 mi SSR ưc thng kê và phân tích bng phn mm NTSYSpc2.1, từ đó thiết lập được hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ cây quan hệ chủng loại của các mẫu nhãn (hình 2). Dựa vào sơ đồ hình cây cho thấy: Ở mức tương đồng di truyền 57%, 48 mẫu giống nhãn nghiên cứu được chia thành 2 nhóm lớn: Nhóm I: Bao gồm 39 mẫu giống đều thuộc các giống nhãn phân bố ở miền Bắc được chia thành nhóm nhỏ hơn: Nhóm 1.1 có 13 mẫu: N1, N2 và N46 thuộc các giống nhãn lồng N11, N12, N19, N20, N22 và N24 thuộc các giống nhãn cùi; N25 và N26 thuộc giống nhãn Đường Phèn Hưng Yên; N40 thuộc giống nhãn nước; N41 thuộc giống nhãn thóc. Trong đó các nhóm mẫu (N1 và N40), (N2, N20, N24), (N41, N46) và (N11, N12, N25 và N26) có kiều gen tương tự nhau ở cả 10 locus nghiên cứu (Hệ số tương đồng di truyền là 1). Nhóm 1.2 gồm 9 mẫu: N10, N13, N14, N15, N16, N17, N18 và N23 đều thuộc các giống nhãn cùi; N42 thuộc giống nhãn lồng. Trong đó, các mẫu trong các nhóm mẫu (N10, N18), (N13, N14, N15, N16) và (N17, N23) có kiểu gen tương tự nhau ở các locus nghiên cứu (Hệ số tương đồng di truyền là 1). Nhóm 1.3 có 8 mẫu: N3, N5, N6, N7, N8 và N9 thuộc giống nhãn lồng; N28 và N30 thuộc giống nhãn cùi. Nhóm 1.4 có 8 mẫu: N4, N44, N45, N47 (nhãn lồng); N21, N29, N43, N48 (nhãn cùi). Nhóm 1.5 có duy nhất mẫu N27 (giống Đường Phèn Hưng Yên). Nhóm II bao gồm 9 mẫu giống thuộc các giống nhãn phân bố ở miền Nam được chia thành 3 nhóm nhỏ hơn: Nhóm 2.1 có 3 mẫu N31, N32 và N33 đều thuộc giống nhãn tiêu Da Bò. Trong đó N31 và N32 có kiểu gen tương tự nhau và có hệ số tương đồng di truyền với mẫu N33 là 0,83. Nhóm 2.2 có 3 mẫu N34, N35 và N36 đều thuộc giống nhãn xuồng Cơm Vàng, có kiểu gen tương tự nhau ở các locus nghiên cứu (Hệ số tương đồng di truyền là 1). Nhóm 2.3 có 3 mẫu N37, N38 và N39 đều thuộc giống nhãn tiêu Lá Bầu, có kiểu gen tương tự nhau ở các locus nghiên cứu (Hệ số tương đồng di truyền là 1). Hình 2. Sơ đồ quan hệ chủng loại của 48 mẫu nhãn nghiên cứu T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 Kết quả phân nhóm cho thấy: Sự khác biệt giữa 2 nhóm lớn là các giống nhãn ở miền Bắc và các giống nhãn ở miền Nam; các mẫu trong cùng một giống có hệ số tương đồng di truyền cao được phân trong cùng một nhóm có thể là do được nhân giống theo phương pháp nhân giống vô tính bằng chiết cành, ghép cành từ những cây có chung một nguồn gốc; các mẫu cùng một giống có hệ số tương đồng thấp được phân ở các nhóm khác nhau có thể do giống có nền di truyền rộng hoặc do sự di thực và gọi tên theo tên địa phương khác nhau. IV. KẾT LUẬN Tập đoàn nhãn bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú, kết quả phân tích với 10 mồi SSR trên 48 mẫu thuộc 22 giống nhãn bản địa của Việt Nam đã thu được 27 loại alen khác nhau (số alen thể hiện/mồi trung bình là 2,7); hệ số PIC dao động từ 0,0 đến 0,75 (trung bình 0,24); tỷ lệ các locus dị hợp của các mẫu nghiên cứu dao động từ 0% đến 25,0%. Ở mức tương đồng 57%, 48 mẫu nhãn được phân thành 8 nhóm khác biệt thuộc 2 nhóm lớn, hầu như các mẫu của mỗi giống đều nằm trong một nhóm riêng và có thể dễ dàng phân biệt với các giống nhãn khác. Kết quả này là cơ sở để xác định các marker phân tử nhận dạng chính xác các giống nhãn bản địa của Việt Nam. Dựa vào sự sai khác giữa các mẫu trong cùng một giống (sự đa dạng di truyền bên trong giống) có thể xác định nguồn gốc phát sinh của các mẫu giống, chọn ra các cá thể ưu việt phục vụ công tác chọn, tạo giống, nhân giống và bảo tồn có hiệu quả các nguồn gen nhãn quý của Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Billote ., Lagoda P.J.L., Risterucci A.M., Baurens F.C., 1999. Microsatellite- enriched libraries: applied methodology for the development of SSR markers in tropical crops. Fruits 54: 277-288. 2 Cheng Y.J., Guo W.W., Yi H.L., Pang X.M., Deng X.X., 2003. An efficient protocol for genomic ADN extraction from Citrus species. Plant Mol. Biol. Reporter 21: 177. 3 Li M., Zheng X., Zhu Y., Wang X., Liang S., Li L. and Wu X., 2006, Development and characterization of SSR markers in lychee (Litchi chinensis). Molecular Ecology otes 6: 1205-1207. 4 Li M.F., Zheng X.Q., 2004. Development of SSR markers in lychee (Litchi chinensis). Yichuan 26: 2911-2916. 5 Viruel M.A., Hormaza J.I., 2004. Development, characterization and variability analysis of microsatellites in lychee (Litchi chinensis Sonn., Sapindaceae). Theoretical Applied Genetics108: 896-902. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 9 gười phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý . NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN NHÃN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KĨ THUẬT SSR (MICROSATELLITE) Khuất Hữu Trung 1 , guyễn Trường Khoa 1 ,. nền di truyền rộng hoặc do sự di thực và gọi tên theo tên địa phương khác nhau. IV. KẾT LUẬN Tập đoàn nhãn bản địa của Việt Nam rất đa dạng và phong phú, kết quả phân tích với 10 mồi SSR. Viện Nghiên cứu Rau quả 3 Nhãn lồng (PH-M99-2.2) Hưng Yên Viện Nghiên cứu Rau quả 4 Nhãn cùi (YB-10) Yên Bái Viện Nghiên cứu Rau quả 5 Nhãn cùi (YB-28) Yên Bái Viện Nghiên cứu Rau quả 6 Nhãn