NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN GIỐNG HOA LILY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Đỗ Minh Phú, Đoàn Thị Thùy Vân, Đặng Văn Đông, Trịnh Khắc Quang SUMMARY Improving lily sorbone propagation technology by in vitro culture method The present invention belongs to the field of biotechnology, and is tissue culture method to propagating great amount of Sorbone lily seedlings. Sorbone lily scale as explant, after sterilization and cutting into blocks, is inoculated on culture medium with different plant hormones to induce callus and cespitose bud; callus and cespitose bud are proliferated in secondary culture medium until reaching seedling height of 5 cm and forming base bulb; and the seedling is transplanted in grown bulb medium. The created and proliferation budlb culture medium includes MS supplemented NAA 0.01 mg/L and BAP 0.4 mg/L. The grown culture medium includes MS NAA 0.2 mg/L and BAP 0.03 mg/L. The culture conditions include temperature of 25 - 26 deg.C, illuminance of 2000 - 2200 lux, lighting 12 hr/day and pH 5.8. Keywords: Biotechnology, tissue culture, callus, bulb, hormones. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa lily là loại hoa cao cấp, có vẻ đẹp sang trọng, độ bền cao, hương thơm nhẹ nhàng và màu sắc phong phú. Từ lâu, loài hoa này đã khẳng định được thế mạnh trên thị trường thế giới. Và đặc biệt, những năm gần đây, tại Việt Nam hoa lily đã trở thành loại hoa phổ biến trong những ngày lễ, Tết cũng như những sinh hoạt thường nhật của người dân. Hoa lily được nhân giống bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro có nhiều ưu điểm vượt trội. Kỹ thuật này được áp dụng tại các quốc gia và vùng lãnh thổ có ngành sản xuất hoa tiên tiến trên thế giới như Hà Lan, Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc Tuy nhiên, việc áp dụng công nghệ này tại Việt Nam vẫn còn nhiều hạn chế nên giá thành củ giống cao, chất lượng vẫn còn thấp. Mặc dù, những năm gần đây một số cơ quan khoa học như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học - Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Phân Viện Công nghệ sinh học Đà Lạt, Viện Nghiên cứu Rau quả đã và đang nỗ lực nghiên cứu nhân giống lily nhằm tạo ra nhng sn phNm tt nht vi giá thành hp lý, tuy nhiên kt qu t ưc chưa cao. Xut phát t nhng lý do trên, chúng tôi ã tin hành thc hin  tài: “ghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”.  tài nghiên cu ưc thc hin t tháng 10/2007 n tháng 6/2009. Các thí nghim ưc tin hành ti Phòng Thí nghim nuôi cy mô - B môn Công ngh sinh hc và Vưn ươm thí nghim - B môn Hoa cây cnh - Vin N ghiên cu Rau qu. Mục đích nghiên cứu: T  nhng ưu, nhưc im các nghiên cu trưc ó, da trên nn tng ca quy trình “to c trc tip t lát ct vy c - Vin Di truyn N ông nghip”. Chúng tôi ã t ra mc tiêu ca  tài: - La chn quy trình tt nht, ơn gin, d ng dng, có kh năng chuyn giao cho mi i tưng, mi iu kin sn xut - Ti ưu hoá quy trình nhân ging cây hoa lily cho tng i tưng ging có trin vng và thích nghi vi iu kin khí hu ca vùng ng bng sông Hng cũng như các tnh phía Bc. - N âng cao cht lưng c ging, h giá thành sn phNm. N ăng sut ln,  kh năng cung cp ging cho th trưng. II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu Là ging hoa lily Sorbone. ây là ging hoa lily thơm, có màu hng, nhp ni t Hà Lan, ưc Vin N ghiên cu Rau qu tuyn chn và ã ưc B N ông nghiêp và Phát trin nông thôn công nhn ging chính thc tháng 6/2009. 2. ội dung nghiên cứu Các nghiên cu ưc tin hành  3 giai on: Giai đoạn 1: (Khởi động) - nh hưng ca hàm lưng BAP và αN AA n kh năng phát sinh c nh t mô vy c lily. - nh hưng ca nng  ưng n phát sinh c nh t mô vy c lily. Giai đoạn 2: (Sự phát triển củ nhỏ) - nh hưng ca hàm lưng t hp BAP và αN AA n kh năng nuôi ln c lily nh. - nh hưng ca nng  ưng Saccarose, than hot tính, nưc da n tc  sinh trưng ca c ging lily in vitro. Giai đoạn 3: (ngoài vườn ươm) - nh hưng ca giá th n kh năng bt chi ca c ging lily in vitro. - nh hưng ca mt s loi phân bón lá n sinh trưng ca cây giai on sau in vitro. 3. Phương pháp thí nghiệm - La chn và tách các vy c t c lily mu vi kích thưc dài vy t 2-3 cm. - Kh trùng vt mu bng H 2 O 2 hoc HgCl 2 . - Môi trưng nuôi cy: + Môi trưng cơ bn: MS (Murashige and Skoog, 1962) có ci tin v thành phn ưng, agar. + Môi trưng khi ng, to c ban u có b sung t hp BAP (6-Benzylaminopurine) hàm lưng 0,01-0,05 mg/l và αN AA (1-N aphtyl acetic acid) 0,1-0,5 mg/l. + Môi trưng nuôi ln c là môi trưng cơ bn trên vi t hp BAP và αN AA. Hàm lưng thay i cho phù hp vi mc ích nuôi ln c. (BAP: 0,02-1 mg/l; αN AA: 0,1-03 mg/l) Và các cht b sung như: than hot tính, nưc da - Môi trưng ưc iu chnh v pH: 5,8. - N hit  phòng nuôi: 26 0 C ± 2. -  Nm không khí: 45 - 50%. - Toàn b vt mu ưc t trong môi trưng ti sut quá trình nuôi. III. KT QU N GHIÊN CU VÀ THO LUN 1. Kết quả và những đánh giá chủ yếu ở giai đoạn in vitro Ở giai đoạn 1, khi tiến hành tạo vật liệu khởi đầu. Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu cho thấy: tổ hợp BAP với αNAA ở hàm lượng 0,01 mg/l cho kết quả tốt nhất. Bảng 1. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP và αAA đến khả năng phát sinh củ nhỏ Công thức thí nghiệm αNAA (mg/l) BAP (mg/l) Số củ thu được TB/1 mẫu A1 0,01 0,1 0,52 A2 0,2 1,70 A3 0,3 3,01 A4 0,4 3,23 A5 0,5 2,81 Từ kết quả trình bày tại bảng 1 chúng ta nhận thấy, tỷ lệ tạo củ nhỏ tăng dần với hàm lượng của BAP có mặt trong môi trường từ 0,1-0,4 mg/l. Khi tăng hàm lượng BAP vượt ngưỡng 0,4 mg/l, tỷ lệ tạo củ giảm rõ rệt từ 3,32 củ/1mẫu xuống còn 2,81 củ/1mẫu. Từ kết quả này cho chúng ta thấy tác động của tỷ lệ tổ hợp BAP và αNAA lên khả năng tạo củ nhỏ. Khi tỷ lệ này mất cân đối sẽ có tác động gây ức chế đến mẫu nuôi cấy. Với tỷ lệ BAP và αNAA là (0,4: 0,01 mg/l) đã cho chúng ta kết quả tạo củ nhỏ tốt nhất. Tuy nhiên thời gian tạo củ khá lâu từ 40-60 ngày, cũng như tỷ lệ phát sinh củ trên một mẫu còn thấp. Vấn đề đặt ra là cần rút ngắn thời gian tái sinh của mẫu, nâng cao chất lượng của củ tạo ra. Kết quả ở bảng 2 dưới đây cho thấy nếu ta thay đổi hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy sẽ rút ngắn được đáng kể thời gian phát sinh mẫu cũng như tăng tỷ lệ phát sinh củ trên một mẫu nuôi cấy. Từ đó rút ngắn được thời gian cho toàn bộ quá trình nuôi cấy. Bảng 2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến phát sinh củ nhỏ từ mô vảy củ lily Công thức thí nghiệm Saccarose (g/l) Số ngày sau cấy mẫu phát sinh củ nhỏ Số củ TB/mẫu B1 30 55 - 60 2,48 B2 60 50 - 60 3,01 B3 90 40 - 50 3,27 B4 120 35 - 50 3,24 B5 150 40 - 50 3,17 Khi hàm lượng đường tăng dần, thời gian phát sinh củ nhỏ được rút ngắn từ 5 cho đến 20 ngày. Tuy nhiên tỷ lệ tạo củ chỉ đạt cao nhất khi hàm lượng đường có trong môi trường là 90 g/l. Điều này cho thấy: hàm lượng đường có tác động rất lớn đến tỷ lệ tạo củ nhỏ. Trong nghiên cứu quy trình ứng dụng sản xuất, bên cạnh các chỉ tiêu về chất lượng, yếu tố thời gian cũng như sản lượng luôn luôn là yêu cầu thiết yếu nhất. Ảnh 1. Củ lily phát sinh từ mô vảy củ Bảng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và αAA đến khả năng phát triển củ lily in vitro Công thức thí nghiệm Số lượng mẫu αNAA (mg/l) BAP (mg/l) Khối lượng củ ban đầu (g) Khối lượng củ sau 60 ngày nuôi (g) C6 50 0,2 0,01 2,0 3,27 C7 50 0,03 1,9 5,13 C8 50 0,05 1,9 4,22 C9 50 0,07 1,8 3,87 C10 50 1,00 1,9 2,94 Từ những kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy BAP kết hợp với 0,2 mg/l αNAA cho kết quả tăng trưởng tốt nhất. Tương tự như nghiên cứu về khả năng tạo củ nhỏ, kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy tỷ lệ của tổ hợp BAP và αNAA tác động rất mạnh lên mẫu nuôi cấy. Với hàm lượng của αNAA là 0,2 mg/l, hàm lượng của BAP tăng dần từ 0,01 -1 mg/l đã cho những kết quả rất khác nhau. Và đạt được kết quả tốt nhất ở công thức C7 với tỷ lệ BAP: αNAA là 0,03 : 0,2 mg/l. Bảng 4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường, nước dừa và than hoạt tính đến sinh trưởng của củ lily in vitro CTTD CTTN Hàm lượng Khối lượng củ ban đầu (g) Khối lượng củ sau 60 ngày nuôi (g) Đường Saccarose (g/l) 90 1,9 5,23 120 1,8 5,54 150 1,9 5,50 Nước dừa (ml/l) 50 1,9 5,61 100 1,8 6,28 150 1,9 6,24 Than hoạt tính (g/l) 0,5 1,9 6,35 1,0 1,8 6,42 1,5 1,8 6,40 Từ kết quả ở bảng 4 cho thấy để tăng chất lượng củ lily in vitro, làm tăng khối lượng củ tốt nhất, hàm lượng của đường có trong môi trường là 120 g/l, hàm lượng của nước dừa là 10 ml/l và than hoạt tính là 1,0 g/l. Ảnh 2. Củ lily in vitro sau 60 ngày nuôi 2. Giai đoạn ra ngôi ngoài vườn ươm Củ đưa từ ống nghiệm ra đất đạt tỷ lệ sống cao sẽ quyết định khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp này vào sản xuất củ giống. Chính vì vậy, chỉ tiêu đầu tiên và quan trọng nhất của khâu này là xác định được giá thể đưa cây từ in vitro ra ex vitro. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng bật chồi và sinh trưởng của cây CTTN Tỷ lệ bật chồi (%) Chiều cao cây (cm) Số lá (cái) Đường kính củ sau thu hoạch vụ đầu (cm) 1 62,3 20,5 1,5 1,5 2 53,2 23,2 2,1 1,6 3 85,4 35,2 3,5 2,3 4 49,4 25,4 1,8 1,5 5 80,7 30,6 3,1 1,9 Ghi chú: 3 khay/công thức, 30 cây/khay. CT1: Trấu hun + đất phù sa; CT2: Sơ dừa + trấu hun; CT3: Sơ dừa nghiền nhỏ. CT4: Đất phù sa; CT5: Sơ dừa + đất phù sa. Kết quả cho thấy công thức 3 và 4 cho kết quả tốt nhất. Đặc biệt là công thức 3 với tỷ lệ bật chồi đạt 85,4%, đường kính củ sau thu hoạch đạt tới 2,3 cm vượt trội so với các công thức khác, đặc biệt các chỉ số về sinh trưởng như chiều cao cây cũng như số lá trên một cây đều đạt chỉ số theo dõi cao nhất. Kết quả này cho thấy, củ lily in vitro trong giai đoạn vườn ươm cần được trồng trong môi trường thoáng, xốp và giàu oxi. Tuy nhiên phi gi Nm và thoát nưc tt.  nâng cao cht lưng cũng như tăng cưng kh năng sinh trưng ca cây. Trong thi gian vưn ươm, ngoài nghiên cu các ch s v giá th, chúng tôi tin hành nghiên cu nh hưng ca mt s loi phân bón lá n sinh trưng và phát trin ca cây. Bảng 6. Ảnh hưởng của phân bón lá đến sinh trưởng của cây ngoài vườn ươm CTTN Công thức TN Chiều cao cây (cm) Số lá (cái) Đường kính củ sau thu hoạch vụ đầu (cm) CT1 Đối chứng 35,2 3,5 2,3 CT2 Komix 30,5 3,0 1,8 CT3 Chế phẩm Thiên nông 30,2 3,1 2,1 CT4 Đầu trâu 502 35,2 3,8 2,4 CT5 Atonik 30,6 3,3 1,9 Kết quả thu được, trên bảng 6 cho thy vic s dng các ch phNm phân bón lá có tác ng không ng u  các công thc khác nhau, mt s công thc còn cho thy nh hưng xu n cây trng khi so sánh các ch tiêu vi i chng. Tuy nhiên, phân bón lá “u trâu 502” cho kt qu khá tt, các ch s như s lá, ưng kính c sau thu hoch u cao hơn so vi i chng. Vi công thc này, sinh trưng và phát trin ca cây u vưt tri so vi các công thc khác, c bit là kh năng chu nhit, khi trng vào các tháng có nhit  cao. Ảnh 3. Củ lily giống Sorbone được xử lý trước khi đưa ra vườn ươm T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 IV. KẾT LUẬN Điều kiện tối ưu cho nhân giống hoa lily Sorbone bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro là: - Môi trường cho tạo củ nhỏ lily là: MS + 90 g/l Sacarose + 0,01 g/l NAA + 0,4 mg/l BAP + 6 g/l agar. - Môi trường nuôi lớn củ nhỏ lily là: MS + 120 g/l Sacarose + 0,2 mg/l NAA + 0,03 mg/l BAP + 100 ml/l CW + 1 g/l than + 6 g/l agar. - Nền giá thể tối ưu cho giai đoạn vườn ươm: Sơ dừa nghiền nhỏ. - Phân bón cho cây lily giai đoạn vườn ươm: Phân Đầu trâu 502. TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1. Cao Thị Huyền Trang, Dương Minh ga, Đỗ Minh Phú, Đỗ ăng Vịnh, Hà Thị Thuý, 2006. Nghiên cứu tạo củ trực tiếp từ lát cắt vảy củ lily in vitro, T/C Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 2006/Số 8 2. Dương Tấn hựt, 2006. Hệ thống nuôi cấy bioreactor trong công nghệ sinh học thực vật. Tạp chí Công nghệ sinh học, 4 (3): 265-283. 3. Dương Tấn hựt, Đỗ ăng Vịnh, 2004. Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc gia tăng sự tái sinh chồi và nâng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium longiflorum). Tạp chí Công nghệ sinh học, 2 (4): 487-499. 4. guyễn Thị Phương Thảo, 1999. Nghiên cứu tạo củ giống hoa loa kèn trong ống nghim, Tp chí N ông nghip, Công nghip, Thc phNm 2/1999. 82-84 5. Takateru Ishimori, Yoshiji iimi, Dong-Sheng Han, 2009. In vitroflowering of Lilium rubellum Baker. Scientia Horticulturae, 120, 246-249. 6. Rong-Yan Xu, Yoshiji iimi, Dong-Sheng Han, 2006. Changes in endogenous abscisic acid and soluble sugars levels during dormancy-release in bulbs of Lilium rubellum. Scientia Horticulturae, 111, 68-72. 7. J.M.Van Tuyl, M.P Van Dien, M.G.M. Van Creij, T.C.M.Van Kleinwee, J.Franken and R.J.Bino: Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses. Plance Science, 74 (1991) 115-126. Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd gười phản biện: Trần Duy Quý . NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN GIỐNG HOA LILY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO Đỗ Minh Phú, Đoàn Thị Thùy Vân, Đặng Văn Đông, Trịnh Khắc Quang SUMMARY Improving lily. tôi ã tin hành thc hin  tài: “ghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro .  tài nghiên cu ưc thc hin t tháng 10/2007 n. Nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học - Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Phân Viện Công nghệ sinh học Đà Lạt, Viện Nghiên cứu Rau quả đã và đang nỗ lực nghiên cứu nhân giống lily nhằm tạo ra nhng