Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây mỡ Phú Thọ Magnolia Phuthoensis
Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Viện khoa học và công nghệ việt nam VIệN HóA HọC CáC HợP CHấT THIÊN NHIÊN mai đình trị NGHIÊN CứU THàNH PHầN HóA HọC Và HọAT TíNH SINH HọC CÂY Mỡ PHú THọ MAGNOLIA PHUTHOENSIS CHUYÊN NGàNH: HóA HọC CáC HợP CHấT THIÊN NHIÊN Mã Số: 62. 44. 27. 02 TóM TắT LUậN áN TIếN Sĩ HóA HọC Hà nội - 2009 Công trình đợc hoàn thành tại: Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Ngời hớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh 2. TS Lê Võ Định Tờng Phản biện 1: GS. TSKH Phan Tống Sơn, Trờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội. Phản biện 2: GS. TSKH Đái Duy Ban, Viện Công nghệ Sinh Học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phản biện 3: GS. TS Phạm Thanh Kỳ, Trờng ĐH Dợc Hà Nội. Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào lúc 09 giờ 00 ngày 28 tháng 03 năm 2009 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Th viện Quốc Gia Hà Nội - Th viện Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam DANH MụC CáC CÔNG TRìNH Đã CÔNG Bố CủA TáC GIả LIÊN QUAN ĐếN LUậN áN 1. Mai Đình Trị, Phan Văn Kiệm, Lê Võ Định Tờng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Trần Hồng Quang, Châu Văn Minh (2007), Các hợp chất Lignan và Steroit phân lập từ cây Mỡ Phú Thọ (Manglietia phuthoensis), Tạp chí hóa học và ứng dụng, 7(67), tr. 41-44. 2. Mai Đình Trị, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Hữu Tùng, Trần Hồng Quang, Châu Văn Minh, Nguyễn Văn Bằng và Young Ho Kim (2007), Two new phenyl glycosides from the leaves of Manglietia phuthoensis, Tạp chí khoa học, Số 1, pp. 139-145. 3. Phan Văn Kiệm, Mai Đình Trị, Lê Võ Định Tờng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Châu Văn Minh (2007), A new hydroxylated fatty acid derivative of Manglietia phuthoensis, Journal of Chemistry and Application, 9(69), trang. 32-34. 4. Mai Đình Trị, Phan Văn Kiệm, Lê Võ Định Tờng, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Trần Hồng Quang, Châu Văn Minh và Young Ho Kim (2007), A new diterpene glycoside from the leaves of Manglietia phuthoensis, Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ t, trang. 535-539. 5. Phan Van Kiem, Mai Dinh Tri, Le Vo Dinh Tuong, Nguyen Huu Tung, Nguyen Ngoc Hanh, Tran Hong Quang, Nguyen Xuan Cuong, Chau Van Minh, Eun-Mi Choi, and Young Ho Kim (2008), Chemical Constituents from the Leaves of Manglietia phuthoensis and their Effects on Osteoblastic MC3T3-E1 Cells, Chem Pharm Bull, 56(9), pp.1270-1275. 24 glucopyranozit, -Tocopherolquinon, 13(R)-Hydroxy-octadeca- (9Z,11E,15Z)-trien-oic axit metyl este, (+)-Syringaresinol kháng 2 chủng VSVKĐ. Hợp chất (+)-Lariciresinol kháng 3 chủng VSVKĐ. Hợp chất MP5A1(Manglieside F) kháng 4 chủng VSVKĐ. Hợp chất 4,5-Diallyl-2,2-dihydroxy-3-methoxybiphenyl kháng 5 chủng VSVKĐ. Hợp chất 4,5-Diallyl-2,3-dihydroxybiphenyl ete kháng 6 chủng VSVKĐ Kết quả thử hoạt tính chống loãng xơng đến sự biệt hóa của dòng tế bào MC3T3-E1 cho thấy hợp chất 3,4-dihydroxyallylbenzene-3-O-- D-apiofuranosyl-(16)--D-glucopyranozit và hợp chất 5,5- dimethoxylariciresinol- 4-0- -D- glucopyranozit kích thích đáng kể sự phát triển và sự biệt hóa của tế bào nguyên xơng MC3T3-E1. Kiến nghị Để tìm hiểu rõ hơn về hoạt tính sinh học của cây Mỡ Phú Thọ, chúng tôi sẽ tiếp tục thử nghiệm hoạt tính kháng NF-kB của các hợp chất đã phân lập đợc nhằm phát hiện thêm những hoạt tính mới của cây này mà cho đến nay cha có công trình nào nghiên cứu. 1 GIớI THIệU LUậN áN 1. Đặt vấn đề Thế giới thực vật rất phong phú và đa dạng, nó cung cấp cho con ngời nguồn tài nguyên vô cùng qúy giá đặc biệt là những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thứ cấp đợc phân chia thành các nhóm cơ bản nh: tecpenoit, ancaloit, steroit, flavonoit Trong quá trình tiến hóa của mình, hợp chất thứ cấp đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và phát triển của thực vật, góp phần bảo vệ thực vật trớc sự tấn công của động vật ăn cỏ, vi khuẩn, các điều kiện bất lợi của môi trờng Trong đó các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho con ngời, vật nuôi, cây trồng, các thuốc bảo vệ thực vật, các chất kích thích, điều hoà sinh trởng động thực vật và làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm. Do đó việc nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất. Theo tổ chức y tế thế giới ớc tính hiện nay khoảng hơn 80% dân số thế giới sử dụng nguồn dợc liệu để điều trị bệnh tật và chăm sóc sức khỏe. Cho đến năm 2000, ít nhất 100 hợp chất có nguồn gốc từ 100 loài thực vật đợc chiết tách từ thiên nhiên là những loại dợc phẩm quan trọng sử dụng làm thuốc. Trong đó thành công sớm nhất trong việc tìm ra thuốc nguồn dợc liệu là thuốc kháng sốt rét quinin từ cây Cinchona succirubra, thuốc giảm đau morphin từ cây thuốc phiện Papaver somniferum. Gần đây hai hai hợp chất vinblastine và vincristine phân lập từ cây dừa cạn Madagascar Catharanthus roseus và taxol từ loài thông đỏ Taxus đợc ứng dụng trong điều trị ung th rất hiệu quả. Một số dịch chiết của những hợp chất có hàm lợng cao 2 đã đợc tiêu chuẩn hóa và đợc ứng dụng rộng rãi nh: curcumin hàm lợng đến 95% đợc chiết xuất từ loại nghệ vàng Curcuma longa chữa một số bệnh viêm loét dạ dày và đờng tiêu hóa flavonoglycosides (24%) từ cây bạch quả Ginkgo biloba điều trị một số bệnh tim mạch và tuần hoàn não, bacoside (20%) đợc chiết xuất từ cây rau đắng biển Bacopa monneri là sản phẩm làm tăng trí nhớ, silymarin (70%) từ loài Silybum marianum có tác dụng bảo vệ gan Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao đợc thiên nhiên u đãi nên thảm thực vật phát triển rất phong phú và là một kho tài nguyên vô giá, với nguồn dợc liệu quí bao gồm nhiều loại động thực vật dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo thống kê của các nhà khoa học gần đây Việt Nam hiện nay có 10.585 loài, thuộc 2.342 chi, 337 họ, trong đó có 24 họ có từ 100 loài trở lên, trong đó có 3.800 loài thực vật đợc dùng làm thuốc. Cho đến nay, hàng trăm cây thuốc đã đợc các nhà hóa học, dợc học và y học chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Chính vì vậy, xu hớng đi sâu nghiên cứu tìm kiếm những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao dựa trên nền y học cổ truyền để làm thuốc từ dợc liệu trong nớc ngày càng đợc các nhà khoa học quan tâm. Hiện nay, các nhà khoa học đang rất quan tâm đến các hợp chất chống oxi hoá cũng nh các hợp chất có khả năng ức chế, ngăn chặn và tiêu diệt tế bào ung th Mục đích của luận án là giới thiệu kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây mỡ Phú Thọ mà đến nay cha có công trình nào nghiên cứu về nó. Nội dung luận án bao gồm: - Phân lập các hợp chất tinh khiết từ lá cây mỡ Phú Thọ. - Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đợc 23 7 hợp chất mới (theo Dictionary of Natural Product và SciFinder) -13(R)-Hydroxy-octadeca-(9Z,11E,15Z)-trien-oic axit metyl este (MP5A), MP5A1, 3,4-Dihydroxyallylbenzene-3-O--D-allopyranozit (MP2F), 3,4-Dihydroxyallylbenzene-3-O--D-apiofuranosyl-(16)- -D-glucopyranozit (MP6B1), 3,3'-Dimethoxy-4',5,9,9'-tetrahydroxy- 5',8-bilign-7'-ene-4'-O--D-glucopyranozit (MP9C1), 5,5- Dimethoxylariciresinol- 4-0- -D- glucopyranozit (MP3C1), 5- Megastigmene-3,9-diol 3-O--D-allopyranozit (MP7G1) 11 hợp chất đã biết đợc xác định là: - Phytol (MP4A), -Tocopherolquinon (MP4B), -Sitosterol (MP6A), Daucosterol (MP8D), Axit ursolic (MP6B), 4,5-Diallyl-2,3- dihydroxybiphenyl ete (MP3C), 4,5-Diallyl-2,2-dihydroxy-3- methoxybiphenyl (MP3B), (+)-Lariciresinol (MP8B), (+)- Syringaresinol (MP8A), Quercitrin (MP9B), Afzelin (MP9A) Về tác dụng sinh học Đã thử nghiệm hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính kháng oxi hóa và hoạt tính chống loãng xơng. Kết quả cho thấy các hợp chất Quercitrin, 4,5-Diallyl-2,3- dihydroxybiphenyl ete, 4,5-Diallyl-2,2-dihydroxy-3- methoxybiphenyl có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh với giá trị SC 50 tơng ứng là 7,65àg/ml, 4,19àg/ml, 33,39àg /ml. Các hợp chất 3,4-dihydroxyallylbenzene-3-O--D-allopyranozit, 3,4-dihydroxyallylbenzene-3-O--D-apiofuranosyl-(16)--D- glucopyranozit, 5-megastigmene-3,9-diol 3-O--D-allopyranozit, Phytol và Quercitrin có họat tính kháng 1 chủng VSVKĐ. Các hợp chất 5,5-dimethoxylariciresinol-4-0--D- glucopyranozit, 3,3'- dimethoxy-4',5,9,9'-tetrahydroxy-5',8-bilign-7'-ene-4'-O--D- 22 3,0 96,7 3,43 115,3 2,71* 113,0 1,31* 30 89,6 6,22 107,0 1,81* 108,2 2,47* 0,3 111,4 2,95* 117,8 4,64* 108,9 1,12* 3,0 111,7 2,36* 116,7 5,15* 110,8 1,18* MP3C1 30 113,0 3,67* 97,5 2,78 103,3 1,70 0,3 101,9 7,69 116,8 0,57* 107,1 1,51* 3,0 99,5 4,34 113,0 1,11* 109,0 0,43* MP3B 30 74,5 6,03* 66,1 3,02* 85,51 3,01* MP3C 0,3 98,4 4,75 108,2 7,06 109,7 1,07* 3,0 94,6 4,10 129,5 1,88* 113,4 1,49* 30 112,5 12,26 130,5 4,54* 113,6 1,07* 17- estradiol 0,01 106,8 2,19 113,2 1,50 106,3 1,38* Giá trị đối chứng thành phần collagen, hoạt lực của enzim alkaline phosphatase, và quá trình khoáng hóa tơng ứng là 14,54 0,166 àg, 0,977 0,018 unit/10 6 tế bào, và 0,391 0,006 OD, * P<0,05. Kết quả cho thấy hợp chất MP6B1 và hợp chất MP3C1 gia tăng mạnh hoạt lực của enzim ALP, thành phần collagen và quá trình khoáng hóa. Điều đó cho thấy hợp chất MP6B1 và hợp chất MP3C1 kích thích đáng kể sự phát triển và sự biệt hóa của tế bào nguyên xơng MC3T3-E1 Kết luận và kiến nghị Về hóa học: Từ lá cây Mỡ Phú Thọ bằng các phơng pháp sắc ký đã phân lập đợc 18 hợp chất, trong đó đã xác định đợc 7 hợp chất mới lần đầu tiên đợc phân lập từ thiên nhiên và 11 hợp chất đã biết. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã đợc xác định bằng các phơng pháp hóa lý hiện đại nh: 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, H-H COSY, HSQC, HMQC, ESI-MS, HR-ESI-MS. 3 - Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa, hoạt tính kháng một số vi sinh vật kiểm định và hoạt tính chống loãng xơng của các hợp chất phân lập đợc. 2. Đối tợng nghiên cứu của luận án Lá cây mỡ Phú Thọ đợc thu hái tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc, mẫu cây đợc TS Tô Đức Cờng, Vờn quốc gia Tam Đảo và TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật giám định. 3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây mỡ Phú Thọ Magnolia phuthoensis Dandy ex Gapnep hay còn gọi Manglietia phuthoensis Dandy ex Gapnep. Từ lá cây mỡ Phú Thọ bằng các phơng pháp sắc ký đã phân lập đợc 18 hợp chất, trong đó đã xác định đợc 7 hợp chất mới và 11 hợp chất đã biết 7 hợp chất mới (theo Dictionary of Natural Product và SciFinder) -13(R)-hydroxy-octadeca-(9Z,11E,15Z)-trien-oic axit metyl este (MP5A) - (MP5A1 = Manglieside F) - 3,4-dihydroxyallylbenzene-3-O--D-allopyranozit (Manglieside A=MP2F) - 3,4-dihydroxyallylbenzene-3-O--D-apiofuranosyl-(16)--D- glucopyranozit (Manglieside B = MP6B1) - 3,3'-dimethoxy-4',5,9,9'-tetrahydroxy-5',8-bilign-7'-ene-4'-O--D- glucopyranozit (Manglieside D = MP9C1) - 5,5-dimethoxylariciresinol- 4-0- -D- glucopyranozit (Manglieside E = MP3C1) - 5-megastigmene-3,9-diol 3-O--D-allopyranozit (Manglieside C = MP7G1). 4 Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã đợc xác định bằng các phơng pháp hóa lý nh: 1 H-NMR, 13 C-NMR, H-H COSY, HSQC, HMQC, ESI-MS, HR-ESI-MS 3.2. Lần đầu tiên thử nghiệm hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính kháng oxi hóa và hoạt tính chống loãng xơng Kết quả cho thấy các hợp chất MP9B, MP3C và MP3B có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh với giá trị SC 50 tơng ứng là 7,65àg/ml, 4,19àg/ml, 33,39àg/ml. Các hợp chất MP2F, MP6B1, MP7G1, MP4A và MP9B có họat tính kháng 1 chủng VSVKĐ. Các hợp chất MP3C1, MP4B, MP5A, MP8A kháng 2 chủng VSVKĐ. Hợp chất MP8B kháng 3 chủng VSVKĐ. Hợp chất MP5A1 kháng 4 chủng VSVKĐ. Hợp chất MP3B kháng 5 chủng VSVKĐ. Hợp chất MP3C kháng 6 chủng VSVKĐ. Kết quả thử hoạt tính chống loãng xơng đến sự biệt hóa của dòng tế bào MC3T3-E1 cho thấy hợp chất MP6B1 và hợp chất MP3C1 gia tăng mạnh họat lực của enzim ALP, thành phần collagen và quá trình khoáng hóa. Điều đó cho thấy các hợp chất này kích thích đáng kể sự phát triển và sự biệt hóa của tế bào nguyên xơng MC3T3-E1. 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 121 trang với 24 bảng số liệu, 19 hình và 4 sơ đồ và 96 tài liệu tham khảo. Bố cục luận án gồm: Mở đầu (2 trang), Chơng 1: Tổng quan tài liệu (34 trang), Chơng 2: Phơng pháp nghiên cứu (9 trang), Chơng 3: Thực nghiệm và kết quả (19 trang), Chơng 4: Kết quả và thảo luận (45 trang). Kết luận và kiến nghị (2 trang). Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án (1trang). Tài liệu tham khảo (9 trang). II. Nội dung của luận án 21 Bảng 3.4: Kết quả hoạt tính kháng nấm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:àg/ml) STT Ký hiệu mẫu Nấm mốc Nấm men Asp.niger F.oxysporum S.cerevisiae C.albicans 1 MP2F (-) 12,5 (-) (-) 2 MP3C1 (-) 12,5 (-) 50 3 MP5A1 (-) 12,5 25 50 4 MP6B1 (-) 12,5 (-) (-) 5 MP7G1 (-) 25 (-) (-) 6 MP9C1 (-) 25 (-) (-) 7 MP3B 25 12,5 25 (-) 8 MP3C 50 25 25 (-) 9 MP4A (-) 50 (-) (-) 10 MP4B (-) 25 (-) (-) 11 MP5A (-) (-) (-) (-) 12 MP8A (-) 50 (-) (-) 13 MP8B (-) (-) (-) 50 14 MP9B (-) 50 (-) (-) - Hoạt tính chống loãng xơng Bảng 3.6: ảnh hởng của các hợp chất đến sự biệt hóa của dòng tế bào MC3T3-E1 Hợp chất àM Hoạt lực ALP (%) Collagen (%) Khoáng hóa (%) 0,3 104,0 3,29 104,5 4,17 106,7 2,95 3,0 117,5 2,67* 110,7 4,62 104,4 3,29 MP2F 30 110,2 10,24 103,5 1,52 104,9 3,24 0,3 114,2 3,20* 122,8 4,98* 117,4 2,18* 3,0 110,9 1,33* 115,8 3,92* 108,6 3,66 MP6B1 30 112,1 1,79* 106,7 3,90 103,5 2,34 0,3 101,2 6,08 107,1 2,34 105,6 0,64* 3,0 117,5 11,59 100,9 2,41 109,6 3,82 MP7G1 30 104,0 5,68 103,7 1,51 110,9 1,63* MP9C1 0,3 87,5 5,22 107,5 0,78* 106,7 1,27* 20 (C-7), 43,66 (C-8), 73,50 (C-9), 135,03 (C-1), 104,37 (C-2), 149,29 (C-3), 134,79 (C-4), 149,29 (C-5), 104,37 (C-6), 84,17 (C-7), 54,13 (C-8), 60,52 (C-9),105,62 (C-1), 75,77 (C-2), 77,83 (C-3) 71,38 (C-4), 78,33 (C-5), 62,64 (C-6), 57,07 (3- OCH 3 ), 57,07 (5- OCH 3 ), 56,82 (3- OCH 3 ), 56,82 (5- OCH 3 ). 4.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các chất phân lập đợc - Hoạt tính kháng oxi hóa Bảng 3.2: Kết quả SC 50 thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa STT Ký hiệu mẫu SC (%) SC 50 (à àà àg/ml) Kết quả 1 MP8B 33,85 1,7 - Hoạt tính yếu 2 MP9B 66,15 0,2 7,65àg/ml Dơng tính 3 MP3C 66,15 0,2 4,19àg/ml Dơng tính 4 MP3B 57,94 0,1 33,39àg/ml Dơng tính Kết quả cho thấy các hợp chất MP9B, MP3C, MP3B có hoạt tính chống oxi hóa, mẫu MP8B có hoạt tính yếu - Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Bảng 3.3: Kết quả hoạt tính kháng khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC:à àà àg/ml) Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) STT Ký hiệu mẫu E.Coli P.aeruginosa B.subtillis S.aureus 1 MP2F (-) (-) (-) (-) 2 MP3C1 (-) (-) (-) (-) 3 MP5A1 50 (-) (-) (-) 4 MP6B1 (-) (-) (-) (-) 5 MP7G1 (-) (-) (-) (-) 6 MP9C1 50 (-) (-) (-) 7 MP3B 50 (-) (-) 25 8 MP3C 50 (-) 50 25 9 MP4A (-) (-) (-) (-) 10 MP4B 50 (-) (-) (-) 11 MP5A 50 (-) (-) 50 12 MP8A (-) (-) 50 (-) 13 MP8B 50 (-) (-) 50 14 MP9B (-) (-) (-) (-) 5 Mở đầu Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án. Chơng 1: tổng quan tài liệu Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nớc và quốc tế về các vấn đề: - Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của loài Magnolia phuthoensis Dandy ex Gapnep (Manglietia phuthoensis Dandy ex Gapnep - Các nghiên cứu về thành phần hóa học về chi Magnolia - Hoạt tính sinh học sinh học từ các loài thuộc chi Magnolia Chơng 2: Phơng pháp nghiên cứu 2.1. Phơng pháp phân lập các hợp chất Phần này trình bày các phơng pháp đợc áp dụng để phân lập các hợp chất tinh khiết 2.2. Phơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất Phần này trình bày các phơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất cũng nh các thiết bị máy móc đợc áp dụng bao gồm: Phổ khối lợng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối lợng phân giải cao (HR- ESI-MS), phổ cộng hởng từ hạt nhân (NMR) bao gồm các loại phổ 1D-NMR và 2D-NMR 2.3. Phơng pháp thử hoạt tính sinh học Theo các công trình đã công bố trên thế giới các hợp chất thuộc chi Magnolia có họat tính sinh học khá đa dạng và phong phú nh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxi hóa, kháng viêm Do đó trong luận án này chúng tôi thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên 8 chủng, phơng pháp kháng oxi hóa DPPH thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH free radical scavenging) và hoạt 6 tính chống loãng xơng thông qua các cơ chế kích thích sự biệt hóa của tế bào nguyên bào xơng MC3T3-E1 CHƯƠNG 3: THựC NGHIệM và kết quả 3.1. Mẫu thực vật: Mẫu thực vật dùng cho việc nghiên cứu là lá cây Mỡ Phú Thọ tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Mẫu cây đợc TS Tô Đức Cờng, Vờn quốc gia Tam Đảo và TS Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam giám định 3.2. Phân lập các hợp chất Phần này trình bày cụ thể quá trình phân lập từng chất từ lá của cây Mỡ Phú Thọ (18 hợp chất). Từ mẫu khô ngâm chiết với metanol và sau đó phân bố lại với các dung môi CHCl 3, EtOAc và nớc thu đợc các cao tơng ứng. Từ các cao này tiến hành sắc ký cột để phân lập các hợp chất. Từ cao CHCl 3 đã phân lập đợc 9 hợp chất Sơ đồ 3.2: Phân lập các hợp chất từ cao CHCl 3 MP8B 25 mg Cao CHCl 3 45g CC silicagel n-hexan-aceton 50 : 1 ờ n 100% Nhom II 10g Nhom III 14g Nhom I 6g MP5A 23mg MP4A 58mg CC silicagel n-hexan: aceton 40:1 CC silicagel n-hexan: aceton 35:1 MP4B 20mg MP3B 25mg Nhom IV 8 g MP8A 34 mg CC silicagel n-hexan: EtOAc 10:1 CC silicagel n-hexan: EtOAc 8:1 MP6A 210mg MP6B 18mg CC silicagel n-hexan: EtOAc 20:1 CC silicagel n-hexan: EtOAc 15:1 MP3C 28mg CC silicagel n-hexan: EtOAc 25:1 CC silicagel n-hexan: aceton 30:1 CC silicagel n-hexan: EtOAc 20:1 19 có một phân tử đờng glucozơ gắn vào vị trí OH ở C-4, còn hợp chất salvadoside có hai phân tử đờng glucozơ gắn vào vị trí OH ở C- 4 và C-4. Nh vậy từ các dữ kiện phổ NMR, ESI-MS, HR ESI-MS, hợp chất MP3C1 đợc xác định là 5,5-dimethoxylariciresinol- 4-0--D glucopyranozit. Đây là một hợp chất mới và đợc đặt tên là Manglieside E Hình 4.16: Cấu trúc hóa học của hợp chất MP3C1 và tơng quan HMBC Dữ liệu phổ của hợp chất MP3C1 Phổ ESI-MS m/z: 605,2 [M+Na] + , ESI-MS m/z: 581,2 [M-H] - Phổ HR- ESI-MS m/z: 605,2183 [M+Na] + , (Calcd 605,2210, C 28 H 38 O 13 Na) Phổ 1 H-NMR (500 MHz, MeOD) H (ppm), (J, Hz): 6,60 (br s, H-2), 6,60 (br s, H-6), 3,01 (dd, 13,0; 5, H-7) và 2,58 (dd, 13; 11,5, H-7), 2,78 (m, H-8), 4,05 (dd, 6,5; 8,0, H- 9) và 3,77 (dd, 6,0; 8,0, H-9), 6,64 (br s, H-2), 6,64 (br s, H-6), 4,78 (d, 7,0, H-7), 2,40 (m, H-8), 3,70* (H-9) và 3,87* ( H-9), 4,82 (d, 7,5, H-1), 3,50 (dd, 8,0; 7,5, H-2), 3,45 (dd, 7,0; 8,0, H-3), 3,44 (dd, 7,0; 8,0, H-4), 3,24 (m, H- 5), 3,72* (H-6) và 3,82* (H-6), 3,86 (s, 3-OCH 3 ), 3,86 (s, 5- OCH 3 ), 3,86 (s, 3-OCH 3 ), 3,86 (s, 5-OCH 3 ). Phổ 13 C-NMR (125MHz, MeOD), C (ppm): 139,10 (C-1), 107,82 (C-2), 154,24 (C-3), 136,04 (C-4), 154,24 (C-5), 107,82 (C-6), 34,40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' O H 3 CO HO H 3 CO CH 2 OH OCH 3 O OCH 3 H H H O OH OH HO HO 1" 2" 3" 4" 5" 6" 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' O H 3 C O HO H 3 CO CH 2 OH OCH 3 O OCH 3 H H H O OH OH HO H O 1" 2" 3" 4" 5" 6" 18 các vị trí các bon C-7 với C-8, C-8 với C-9 và C-7, của C-7 với C-8, của C-8 với C-7 và C-9. Để xác định vị trí của các nhóm thế nối với nhau, cũng nh độ dịch chuyển hóa học của chúng chúng tôi tiến hành phân tích phổ HMBC. Vị trí nhóm ancol bậc một đợc khẳng định bằng tơng tác HMBC của H-8( 2,40) và C-9 (60,52), cacbon oximetylen cũng đợc khẳng định bằng tơng tác của H-8 ( 2,78) và C-9 (73,50). Proton của nhóm O-CH 3 ( 3,86) tơng tác với C-3, C-5 và C-3, C-5 ( 154,24 và 149,29), điều đó cho thấy nhóm metoxi gắn vào các vị trí C-3, C-5 và C-3 và C-5. Vị trí nhóm OH ở vị trí C-4 cũng đợc khẳng định bằng sự tơng tác giữa H-6 ( 6,64) với C-4 ( 134,79), C-5 ( 149,29) và C-7 ( 84,17). Tín hiệu cacbon anomeric đợc xác định bằng sự tơng tác của C-4 (105,62) với proton anomeric H- 1( 4,82 ) có hằng số tơng tác J= 7,5 Hz, chứng tỏ liên kết glycozit có cấu hình . Hình 4.8 Phổ HMBC của MP3C1 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất MP3C1 gần giống vớp hợp chất Salvadoside, nhng chỉ khác một điểm duy nhất là hợp chất MP3C1 7 Từ cao EtOAc đã phân lập đợc 3 hợp chất Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ cao EtOAc Từ cao nớc đã phân lập đợc 6 hợp chất Sơ đồ 3.4: Phân lập các hợp chất từ pha nớc Cao nc 50g CC Diaion HP-20 100%MeOH 7g 100%H 2 O 50%MeOH 10g 25%MeOH 8g 75%MeOH 15g H 2 O: MeOH CC Silicagel CHCl 3 :M eOH:H 2 O 40 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 3 : 1 MP5A1 8mg CC Silicagel CHCl 3 :M eOH:H 2 O 20 : 1 : 0.1 YM C R P 18 M eOH : H 2 O 2 : 1 MP2F 16mg MP7G1 8mg MP9C1 20mg CC Silicagel CHCl 3 :M eOH:H 2 O 10 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1.5 : 1 CC Silicagel CHCl 3 :M eOH:H 2 O 8 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1 : 1 CC Silicagel CHCl 3 :M eOH:H 2 O 5 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1 . 5 : 1 MP3C1 14mg CC Silicagel CHCl 3 :M eOH:H 2 O 7 : 3 : 0.4 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1 : 2 MP6B1 18mg Cao nc 50g CC Diaion HP-20 100%MeOH 7g 100%H 2 O 50%MeOH 10g 25%MeOH 8g 75%MeOH 15g H 2 O: MeOH CC Silicagel CHCl 3 :MeOH:H 2 O 40 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 3 : 1 MP5A1 8mg CC Silicagel CHC l 3 :MeOH:H 2 O 20 : 1 : 0.1 YM C RP 18 MeOH : H 2 O 2 : 1 MP2F 16mg MP7G1 8mg MP9C1 20mg CC Silicagel CHCl 3 :MeOH:H 2 O 10 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1.5 : 1 CC Silicagel CHCl 3 :MeOH:H 2 O 8 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1 : 1 CC Silicagel CHCl 3 :MeOH:H 2 O 5 : 1 : 0.1 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1 . 5 : 1 MP3C1 14mg CC Silicagel CHCl 3 :MeOH:H 2 O 7 : 3 : 0.4 YM C RP 18 M eOH : H 2 O 1 : 2 MP6B1 18mg Cao EtOAc 20g Nhóm I Nhóm II Nhóm III MP8D 25mg MP9B 32mg MP9A 15mg CC Silicagel CHCl 3 : MeOH 50 : 1 đến 100% CC Silicagel CHCl 3 : MeOH 20 : 1 YMC RP 18 MeOH : H 2 O 6 : 1 CC Silicagel CHCl 3 : MeOH 10 : 1 YMC RP 18 MeOH : H 2 O 4 : 1 CC Silicagel CHCl 3 : MeOH 8 : 1 YMC RP 18 MeOH : H 2 O 3 : 1 8 3.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập đợc Phần này nêu ra các dữ kiện phổ cũng nh hằng số vật lý của 18 hợp chất phân lập đợc. Chơng 4. kết quả và thảo luận Chơng này trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đợc và kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất này. 4.1. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập đợc từ cây mỡ Phú thọ Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 18 hợp chất đợc phân lập từ lá của cây mỡ Phú Thọ, trong đó có 7 chất mới và 11 chất đã biết. Tổng hợp các hợp chất phân lập đợc từ lá cây mỡ Phú Thọ đợc nêu ra dới đây: O H 3 C C H 3 O CH 2 Cl OH C H 3 O H OH HO H H H H O H O H 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1 4 2 5 10 8 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 MP5A1(Manglieside F) chất mới H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 O H 1 2 3 7 1115 16 17 18 19 20 Phytol (MP4A) O O OH 1 2 3 4 5 6 1' 3' 7' 11' 15' 17' 18' 19' 20' -Tocopherolquinon (MP4B) 9 10 12 18 COOCH 3 OH 13 15 1 13(R)-hydroxy-octadeca-(9Z,11E,15Z)-trien-oic axit metyl este MP5A (chất mới) 17 Hình 4.7: Phổ 13 C-NMR của MP3C1 Phổ 13 C-NMR (125 MHz, MeOD) C (ppm) xuất hiện tín hiệu cộng hởng của 28 cacbon trong đó có 18 cacbon của một đơn vị lignan, hai vòng thơm đợc xác định tại 139,10 (C), 154,24 (C), 134,79 (C), 154,24 (C), 107,82 (CH) và 135,03 (C), 149,29 (C), 136,04 (C ), 149,29 (C ), 104,37 (CH). Hai nhóm oximetylen tại 73,50 và 60,52 cùng với các tín hiệu tại 84,17 (CH), 43,66 (CH), 54,13 (CH) và 34,40 (CH 2 ). Sự xuất hiện của bốn nhóm metoxi đợc khẳng định thêm bằng tín hiệu singlet tại 57,07 và 56,82 với cờng độ cao gấp đôi các tín hiệu của nhóm metyl khác. Cacbon anomeric của phân tử đờng xuất hiện pic 105,62, cùng với 4 nhóm metin nối oxi ( 78,33; 77,83; 71,38; 75,77) và một nhóm ancol bậc 1 xuất hiện ở 62,64. Trớc hết, để có thể nối các cacbon tại các vị trí cha xác định, chúng tôi đã đo phổ 1 H- 1 H COSY. Trên phổ này, tơng tác của H-7 ( 3,01) với H-8 ( 2,78), của H-8 ( 2,78) với H-7 ( 3,01) và H-9 ( 4,05), của H-9 ( 4,05) với H-8 ( 2,78), của H-7 (4,78) với H-8 ( 2,40), của H-8 ( 2,40) với H-7 (4,78) và H-9 (3,70) cho phép nối [...]... 146,77), C-4 ( 146,66), C-6 ( dihydroxyallylbenzene-4-O--D-glucozit Hợp chất MP2F đợc 124,55) và C-7 ( 40,51) Điều này cho thấy phần đờng gắn vào vị khẳng định là 3,4-dihydroxyallylbenzene-3-O--D-allopyranozit, hợp trí C-3 và nhóm propenyl gắn vào vị trí C-1 trên vòng thơm Vị trí nối chất này là chất mới và đợc đặt tên là Manglieside A ... hai proton của ancol bậc một tại 3,88 (dd, HO 6' O 5' propenyl gắn vào vòng thơm Tín hiệu cộng hởng của proton 7 HO HO 9 6 O O O 4' 1' 3' H-H COSY 2' HO HO HMBC OH OH OH OH Hình 4.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất MP2F và tơng quan HMBC, H-H COSY trong vùng từ 3,63-4,18 Nh vậy hợp chất MP2F tồn tại một phân tử đờng Độ dịch chuyển hóa học và hằng số ghép cặp đợc xác định trên phổ 1H-NMR cho thấy hằng số... H-9) và 5,05 (ddd, 17,0; 3,5; 115,57) Tín hiệu cacbon anomeric xuất hiện 102,30, bốn nhóm metin 1,5, H-9), 5,11 ( d, 7,0, H-1), 3,65 (dd, 8,0; 3,0, H-2), 4,18 (t, 3,0, nối oxi ( 72,19; 72,84; 68,50; 75,88) và một nhóm ancol bậc một ở H-3), 3,63 (dd, 3,0; 4,5, H-4), 3,82 (m, H-5), 3,88 (dd, 11,5; 2,0, 62,72 cũng đợc khẳng định trên phổ 13C-NMR H-6) và 3,73 (dd, 11,5; 5,0, H-6) 12 13 đôi tại C-8 và C-9... 6 8 O HO OH 7 9 O 5" OH OCH3 1 6' O 3" phân tử đờng tại 3,72 và 3,82, các proton khác của một phân tử 4 3 O 9 6 7 HO 3,70*, 3,87* Tín hiệu proton metin tại 2,78 (1H, m) và 2,40 (1H, anomeric tại 4,82 (d, 7,5), hai proton của nhóm ancol bậc một của 2' OH OH 3-Methoxymagnolol tại 6,60 (2H, br s,) và 6,64 (2H, br s), chứng tỏ vòng thơm có tính Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện tín hiệu cộng hởng của proton... [M+Na]+, ESI-MS m/z: 311,1 [M-H]-, Phổ Phổ HR-ESI-MS m/z: 335,1068 [M+Na] 11,5; 2,0) và 3,73 (dd, 11,5; 5,0) và các proton metin cộng hởng + (Calcd 335,1107, C15H20O7Na) D-allozơ có cấu hình C3-OH nằm ở trục Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hởng của 15 cacbon trong đó có 6 cacbon của phân tử đờng, 9 cacbon của phần aglycon Phổ 13CNMR xuất hiện tín hiệu của 6 cacbon vòng thơm trong khoảng Phổ 1H-NMR... điển hình xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới trong số 7 chất mới là hợp chất MP2F và MP3C1 Phổ khối lợng ESI-MS của hợp chất MP3C1 xuất hiện pic ion phân tử với cờng độ cao m/z: 605 [M+Na]+, và đỉnh 581 [MH]- ứng với công thức phân tử là C28H38O13 Phổ khối lợng phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion (m/z: 605,2183 [M+Na] +và kết quả phân tích nguyên tố là 605,2210 cho C28H38O13Na) tơng ứng công thức phân... H-6) 12 13 đôi tại C-8 và C-9 cũng đợc khẳng định do có sự tơng tác H-7 ( 3,30) với C-8 ( 139,29) và C-9 ( 115,67), và giữa H-8 ( 5,96) với C-7 ( 40,49), giữa H-9 ( 5,03) với C-7 ( 40,49) Hình 4.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất MP2F Hình 4.3: Phổ HMBC của MP2F Để khẳng định một cách chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất này, chúng tôi đo phổ khối lợng ESI-MS cho thấy pic ion phân tử m/z 311,1 [M-H]-, 335,1... MP3C1 5' 3,4-Dihydroxyallylbenzene-3O--D-allopyranozit (Manglieside A =MP2F) (chất mới) (MP3B) đối xứng và đã bị thế 4 vị trí Proton của nhóm oximetin tại 4,78 (1H, d, 7,0) xuất hiện dới dạng pic đôi và proton nhóm CH2O- đợc 8 5 xác định bởi tín hiệu tại 4,05 (dd, 6,5; 8,0), 3,77 (dd, 6,0; 8,0), và 4" đờng cộng hởng trong vùng từ 3,24-3,50 2 H 5' CH2OH 1" 4' O OH 3' 2" 7' 1' 2' 5' HO 1' 2' 4' OH 3,4-Dihydroxyallylbenzene-3-O-D-apiofuranosyl-(16)--Dglucopyranozit... cho pic ion ( m/z: 335,1068 [M+Na]+ và kết quả phân tích nguyên tố là 335,1107 cho C15H20O7Na) hoàn toàn khẳng định chính xác cho Hình 4.2: Phổ 13C-NMR của MP2F Phân tích sự tơng tác của nối C-H trên phổ HMBC của hợp chất MP2F cho thấy H-1 ( 5,11) tơng tác C-3 ( 146,77), H-2 ( 7,01) công thức phân tử của MP2F là C15H20O7 Từ các kết quả của phổ NMR, ESI-MS, HR-ESI-MS và kết quả phân tích nguyên tố cũng... phenolic Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) H (ppm), (J, Hz), cho tín hiệu cộng hởng của 3 proton vòng thơm ở 7,04 (d, 2,0), 6,77 (d, 8,0) và 6,74 (dd, 2,0; 8,0), nh vậy vòng thơm đã bị thế ba lần Ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu cộng hởng của proton olefin 5,05 (ddd, 17,0; 3,5; 1,5) và 5,02 (ddd, 9,0; 3,5; 1,5), 5,94 (m), hai proton của nhóm metilen 3,29 (2H, d, 6,5) Điều đó cho thấy hợp chất có một nhóm Hình . nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây mỡ Phú Thọ Magnolia phuthoensis Dandy ex Gapnep hay còn gọi Manglietia phuthoensis Dandy ex Gapnep. Từ lá cây mỡ Phú Thọ bằng các. DụC Và ĐàO TạO Viện khoa học và công nghệ việt nam VIệN HóA HọC CáC HợP CHấT THIÊN NHIÊN mai đình trị NGHIÊN CứU THàNH PHầN HóA HọC Và HọAT TíNH SINH HọC CÂY Mỡ PHú THọ MAGNOLIA. chặn và tiêu diệt tế bào ung th Mục đích của luận án là giới thiệu kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây mỡ Phú Thọ mà đến nay cha có công trình nào nghiên cứu