TCNCYH 23 (3) 2003 Nghiên cứu giá trị Creatine kinase trong chẩn đoán sớm, phát hiện dị hợp tử, bớc đầu thăm dò ở mức độ gen của bệnh loạn dỡng cơ Duchenne ở trẻ em Việt Nam Nguyễn Thị Trang 1 , Nguyễn Thị Phợng 2 , Nguyễn Thu Nhạn 2 1 Trờng Đại học Y Hà Nội, 2 Viện Nhi quốc gia Nghiên cứu 112 bệnh nhân đợc chẩn đoán là DMD tại Viện Nhi quốc gia dựa trên lâm sàng, xét nghiệm creatine kinase (CK) và tiền sử gia đình, 24 em trai của bệnh nhân cha rõ triệu chứng lâm sàng cũng đợc xét nghiệm CK. Để nghiên cứu khả năng phát hiện những bà mẹ dị hợp tử mang gen bệnh bằng định lợng CK: 68 bà mẹ bệnh nhân DMD và 34 bà mẹ bình thờng đợc xét nghiệm CK. Mẹ bệnh nhân DMD đợc chia làm 2 nhóm tiền sử di truyền (TSDT) rõ, và không rõ. Chiết tách ADN và chạy PCR với một cặp mồi của exon 48 cho 2 bệnh nhân DMD có TSDT rõ. Nhận xét và kết quả: - CK có giá trị chẩn đoán xác định bệnh DMD: 100% bệnh nhân DMD có mức CK tăng cao, trung bình là 41113154 IU/l gấp 12193 lần CK trung bình của trẻ em bình thờng. - CK có giá trị chẩn đoán sớm bệnh DMD: 17 bệnh nhân DMD cha có biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ có kết quả CK trung bình là 62794114 IU/l cao hơn hẳn CK trung bình của trẻ em bình thờng có ý nghĩa thống kê (p<0,001). - CK có giá trị phát hiện sớm bệnh DMD cho các em trai bệnh nhân khi cha có biểu hiện lâm sàng (11/24 bệnh nhân đã đợc phất hiện bệnh DMD). - CK có giá trị phát hiện ngời nữ dị hợp tử: Khả năng phất hiện dị hợp tử là 82,3% cho nhóm bà mẹ có TSDT rõ, 35,3% cho nhóm bà mẹ TSDT không rõ. - Dùng phơng pháp PCR thăm dò ở mức độ gen của 2 bệnh nhân DMD có TSDT rõ: Kết quả đột biến ở cả 2 bệnh nhân này không thuộc exon 48. I. Đặt vấn đề Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy (DMD)) còn gọi là bệnh teo cơ giả phì đại, là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X. Ngời bị đột biến gen dystrophin dẫn tới không tổng hợp đợc dystrophin một protêin của tế bào cơ, làm huỷ hoại tế bào cơ, giải phóng enzym đặc hiệu creatine kinase vào máu và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng giống nh Duchenne đã mô tả [1]. DMD là bệnh di truyền có tần số cao và là một trong những bệnh di truyền khó điều trị, biểu hiện lâm sàng muộn khoảng 6-7 tuổi, tiến triển nặng dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại và thờng chết ở lứa tuổi 18-20 [1]. 115 TCNCYH 23 (3) 2003 ở Việt Nam DMD là bệnh hay gặp trên lâm sàng, chẩn đoán và phát hiện dị hợp tử bằng xét nghiệm đặc hiệu ADN còn gặp khó khăn, vì phải áp dụng nhiều phơng pháp di truyền phân tử với đòi hỏi trang thiết bị và hoá chất đồng bộ mới phát hiện đợc các loại đột biến gen nh: mất đoạn, nhân đoạn, chuyển đoạn hay đột biến điểm [2]. Vậy làm thế nào có thể chẩn đoán, đặc biệt chẩn đoán rất sớm trẻ bị bệnh DMD để kịp thời phát hiện dị hợp tử cho những ngời nữ trong gia đình để cho họ lời khuyên khi họ xây dựng gia đình hoặc muốn sinh con tiếp theo nhằm hạn chế tỷ lệ sinh con bị bệnh DMD. Xuất phát từ thực tế trên nghiên cứu này nhằm 2 mục tiêu: - Xác định giá trị creatine kinase trong chẩn đoán, đặc biệt chẩn đoán sớm bệnh DMD cho bệnh nhi và phát hiện nữ dị hợp tử. - Bớc đầu thăm dò ở mức độ gen một số bệnh nhân DMD. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng - 112 bệnh nhân đợc chẩn đoán là DMD tại viện Nhi Quốc gia bằng phân tích kết quả CK có đối chiếu với giai đoạn lâm sàng, tiền sử gia đình , 24 em trai của bệnh nhân DMD cũng đợc xét nghiệm CK cho mục đích chẩn đoán sớm. - 68 bà mẹ bệnh nhân đợc chia làm 2 nhóm: tiền sử di truyền (TSDT) rõ và không rõ. - 18 chị em gái của bệnh nhân DMD cũng đợc chia làm 2 nhóm TSDT rõ và không rõ. - Nhóm chứng gồm 34 bà mẹ đã sinh các con khoẻ mạnh, không bị các bệnh nhiễm trùng cấp tính đợc xét nghiệm CK. 2. Phơng pháp - Thu thập thông tin: Các bệnh nhân DMD đợc thu thập thông tin theo một mẫu bệnh án thống nhất. - Định lợng CK toàn phần huyết thanh Các đối tợng nghiên cứu đợc xét nghiệm CK theo phơng pháp phân tích động học enzym, sử dụng các kit thuốc thử của hãng Boeringer Mannheim (CHLB Đức), đọc trên máy quang phổ kế Hitachi của Nhật có hiện số và chơng trình hoá trong vùng tử ngoại, bớc sóng 340 nm, điều kiện 25 0 C, rồi tính toán kết quả. Trị số CK thu đợc từ các bệnh nhân DMD và các em trai, chị em gái của bệnh nhân dới 15 tuổi đợc so sánh với hằng số sinh học CK huyết thanh của trẻ em bình thờng, đợc công bố bởi H.V.Sơn và CS khoa Hoá sinh Viện Nhi Quốc gia. Trị số CK thu đợc từ các mẹ bệnh nhân DMD đợc so sánhvới kết quả CK trung bình của nhóm chứng là các bà mẹ bình thờng. So sánh kết quả CK của hai nhóm bà mẹ để rút ra nhận xét. - Thăm dò phản ứng PCR với 1 cặp mồi của exon 48 cho 2 gia đình có tiền sử di truyền bệnh DMD (chiết tách ADN xử lý proteinase K, hoá chất chạy PCR của hãng Sigma) - Các kết quả thu đợc, đợc xử lý theo các thuật toán thống kê. III. Kết quả 1. Xét nghiệm CK trong chẩn đoán: 116 TCNCYH 23 (3) 2003 Bảng 1. Kết quả xét nghiệm CK trung bình của bệnh nhân DMD Kết quả CK n Giá trị CKTB (IU/l) Số lần tăng trung bình P CKTB trẻ em bt (H.V. Sơn) 18 16 CKTB bệnh nhân 112 4111 3154 121 93 P < 0,001 Kết quả CK trung bình của 112 bệnh nhân tăng cao rõ rệt so với CK trung bình của trẻ em bình thờng có ý nghĩa thống kê với P< 0,001. Kết quả của CK trong chẩn đoán sớm bệnh DMD. Bảng 2. Kết quả xét nghiệm CK của các bệnh nhân ở giai đoạn I. Bệnh nhân DMD g/đ I n=17 Kết quả CK (IU/l) CK tối thiểu 412,2 CK tối đa 12381 CK trung bình 6279,7 4114,2 17 bệnh nhân giai đoạn I cha có biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ có kết quả xét nghiệm CK tăng vọt, trị số CK trung bình là 6279,7 4114,2 cao hơn hẳn CK trung bình của trẻ em bình thờng có ý nghĩa thống kê (P< 0,001). Bảng 3. Kết quả CK của các em trai bệnh nhân DMD Giá trị CK Tổng số CK tăng CK bình thờng P Số em trai BN DMD 24 11 13 CK tăng trung bình 11 7711,75291 P<0,001 Số lần tăng trung bình 226,7155,6 11/24 trẻ trai có mức CK tăng vọt chiếm tỷ lệ 45,8%, CK tăng trung bình là 7711,7 5291 IU/l cao hơn hẳn CK trung bình của trẻ em bình thờng có ý nghĩa thống kê (P<0,001). 2. Kết quả CK trong phát hiện dị hợp tử Bảng 4. Kết quả CK của mẹ bệnh nhân DMD CK tăng CK bình thờng Mẹ bệnh nhân DMD n n % n % TSDT rõ (M1) 17 14 82,3 3 17,7 TSDT không rõ (M2) 51 18 35,3 33 64,7 Tổng số 68 32 47,05 36 52,95 117 TCNCYH 23 (3) 2003 82,3% các bà mẹ DHT bắt buộc (Nhóm M1) có CK tăng cao, còn lại 17,7% các bà mẹ DHT bắt buộc có mức CK bình thờng. Nhóm M2: Trong số 51 bà mẹ có 18 bà mẹ có CK tăng (35,3%), số này đợc xem là DHT đã đợc phát hiện. Còn lại 33 bà mẹ có kết quả CK bình thờng (64,7%). Bảng 5. Trị số CK tăng trung bình và số lần tăng trung bình của nhóm bà mẹ TSDT rõ và TSDT không rõ Nhóm n CK TB (IU/l) Số lần tăng TB P Bà mẹ nhóm chứng 34 26,99,8 CK tăng TB nhóm TSDT rõ 14 272,7164,6 7,44,5 P<0,001 CK tăng TB nhóm TSDT không rõ 18 191120,5 5,23,3 P<0,001 CK tăng trung bình nhóm bà mẹ TSDT rõ cao hơn hẳn CK trung bình của các bà mẹ nhóm chứng có ý nghĩa thống kê P<0,001. 3. Kết quả PCR Để thăm dò ở mức độ gen cho 2 bệnh nhân Phạm. Q. Kh 8 tuổi và Nguyễn.V. Th 8 tuổi trong gia hệ có 2 thế hệ bị bệnh. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với 1 cặp mồi của exon 48 . Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gen agarose 2% xuất hiện băng 506 bp đặc hiệu cho exon 48. Chứng tỏ đột biến gen dystrophin của hai bệnh nhân này không thuộc exon 48. IV. Bàn luận Về giá trị của CK trong chẩn đoán: 112 bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi có 100% kết quả CK tăng cao vọt, trị số thấp nhất cao gấp 22,8 lần CK của trẻ em bình thờng, trị số cao nhất gấp 558 lần so với trị số tối đa của trẻ em bình thờng. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của Mendell .RJ (1991) [5] và phù hợp với các tác giả trong và ngoài nớc nh: Goedde và CS (1977); Chemnitz (1981); H.V.Sơn và CS (1987); V.C. Dũng(1996) [3, 4]. Để tìm hiểu giá trị của CK trong chẩn đoán sớm: 17 bệnh nhân thuộc giai đoạn I cha có biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ có kết quả CK trung bình là 6279,74114,2 cao hơn hẳn CK trung bình của trẻ em bình thờng có ý nghĩa thống kê( p<0,001), nh vậy CK có khả năng phát hiện bệnh DMD rất sớm. Bệnh nhân Ng. B. Ch đợc xét nghiệm lúc 14 tháng tuổi kết quả là 2426,5 IU/l cao gấp 71,3 lần so với trị số tối đa của trẻ em bình thờng. Một bệnh nhân khác Ng.Đ. Th đợc xét nghiệm CK lúc 3 tháng tuổi là 4325IU/l, lúc 6 tuổi bệnh nhân này đợc xét nghiệm lại kết quả CK là 9079 IU/l mức CK tăng 267 lần so với giới hạn tối đa của trẻ em bình thờng. Những kết quả nêu trên đã chứng tỏ CK có giá trị trong chẩn đoán sớm bệnh DMD. Trong 24 em trai của bệnh nhân DMD cha rõ triệu chứng lâm sàng, 11/24 (45,8%) có mức CK tăng vọt, mức CK trung bình là 7711,7 5291,0 IU/l cao hơn hẳn CK của trẻ em bình thờng có ý nghĩa thống kê (p<0,001), số lần tăng trung bình là 226,7155,6IU/l so với trị số tối đa của trẻ em bình thờng. Việc chẩn đoán sớm bệnh DMD là rất cần thiết để chỉ định phát hiện dị hợp tử và t vấn di truyền. Về giá trị của CK trong phát hiện dị hợp tử của bệnh DMD: Để tìm hiểu về khả năng phát hiện dị hợp tử của CK, chúng tôi chia các bà mẹ bệnh nhân DMD làm 2 nhóm: Nhóm bà mẹ có tiền sử di truyền (TSDT) rõ là những bà mẹ 118 TCNCYH 23 (3) 2003 đã sinh từ 2 con trở lên bị bệnh hoặc có 2 thế hệ trở lên có ngời bị bệnh, những bà mẹ này là dị hợp tử chắc chắn đợc xét nghiệm CK, kết quả 14/17 (82,3%) có kết quả CK tăng, với mức CK tăng trung bình là 272,7164,6 IU/l cao gấp 7,44,5 lần so với kết quả CK của các bà mẹ bình thờng có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Nh vậy định lợng CK có giá trị phát hiện dị hợp tử cho mẹ bệnh nhân DMD với tỷ lệ 82,3%. Nhóm bà mẹ TSDT không rõ, (những bà mẹ chỉ sinh 1 con bị bệnh DMD, trong gia hệ không có ai bị bệnh), kết quả CK của các bà mẹ nhóm này có 18/51 tăng chiếm tỉ lệ 35,3%, còn lại 64,7% CK bình thờng, có 2 khả năng hoặc các bà mẹ này không phải là dị hợp tử mà do đột biến mới xẩy ra trong quá trình tạo giao tử hoặc là dị hợp tử nhng do hạn chế của phơng pháp CK không phát hiện đợc. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với số liệu của các tác giả khác nh: Margaret (1967) ở Canada, Falcao và CS (1983) [7], Alvarez (1990) ở Mexico [6]. Để thăm dò ở mức độ gen của 2 bệnh nhân DMD đã đợc chẩn đoán xác định. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi cho exon 48 vùng hay xẩy ra khuyết đoạn, tuy nhiên cả 2 bệnh nhân đều xuất hiện băng 506 bp. Điều này có nghĩa đột biến không thuộc exon 48 mà thuộc những exon khác của gen. Để phát hiện đột biến gen cần phải sử dụng nhiều cặp mồi hơn. V. Kết luận 1. CK có giá trị trong chẩn đoán và đặc biệt chẩn đoán rất sớm bệnh DMD khi cha rõ triệu chứng lâm sàng. 2. CK có giá trị phát hiện ngời nữ dị hợp tử lành mang gen bệnh. 3. Sử dụng một cặp mồi thuộc exon 48 đã hiện băng 506 bp đặc hiệu cho exon 48 của 2 bệnh nhân đợc chẩn đoán xác định là DMD, tuy nhiên cha phát hiện đợc đột biến gen ở những bệnh nhân này. VI. Đề xuất 1.Phơng pháp định lợng CK là phơng pháp xét nghiệm cho kết quả nhanh và giá thành không cao. Vì vậy nên đợc triển khai áp dụng cho những đối tợng trong chỉ định xét nghiệm để chẩn đoán sớm các trờng hợp DMD và phát hiện dị hợp tử cho những ngời nữ trong gia đình bệnh nhân để t vấn di truyền nhằm mục đích phòng bệnh. 2.Cần thiết phát triển kỹ thuật di truyền phân tử để phát hiện đột biến gen làm cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh và phát hiện dị hợp tử bệnh DMD cho những phụ nữ mà phơng pháp CK không phát hiện đợc. Tài liệu tham khảo 1. Jean- Claude Kaplan (1993), Biologie moleculair et pathologie,pp 386-403. 2.Van Essen AJ, Kneppers AL, Vander Hout AH. (1997), The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular dystrophy an updated protocol, J Med Genet, 34 (10), pp.805- 812. 3.Hoàng Văn Sơn, Hoàng Hạnh Phúc, Đỗ Ngọc Yến (1987), Xét nghiệm Creatine Kinase và Lactate dehydrogenase chẩn đoán bệnh teo cơ giả phì đại Duchenne, Tạp chí nhi khoa. Tổng hội Y dợc học Việt Nam xuất bản; tr. 17-24. 4. Vũ Chí Dũng (1996). Triệu chứng và chẩn đoán bệnh loạn dỡng cơ Duchenne trong điều kiện Việt Nam. Luận văn thạc sỹ y học. 5. Mendell.R. jerry(1991), Muscular dystrophy. In: Harrison's principles of Internal medicine, 12th edition, 365, pp. 2112-2118. 6.Alvarez leal-M; Ortiz-Mariscal-JD (!990). Evaluation of The activity of creatine phosphokinase for the detection of carriers of Duchenne type Muscular dystrophy in families in the city of 119 TCNCYH 23 (3) 2003 Monteray Mexico,Rev-Invest clin, jan-Mar, 42(1), pp. 39-45. 7. Falcao-conceicao DN. (1983), Detection of carriers of X-linke® gene for Duchenne muscular dystrophy by levels of creatine kinase and pyruvate kinase, J-neurol- Sci,62(1-3),pp. 171-80. Summary Value of creatine kinase in early diagnosis, detection of the heterozygotes, primary research gene level of Duchenne muscular dystrophy in vietnamese patients 112 patients were diagnose® DMD at the National institute of pediatrics based on clinic, family history, creatine kinase (CK) analysis. 24 patient's brothers who had not yet expressed clinical figures, examined CK for early detection of DMD. 68 DMD patient's mothers, 34 normal mothers were examined CK. Result: -Value of definitive diagnosis of CK test were 100%: CK levels of 112 patients were 4111±3154 IU/l higher than CK levels of normal children (p,0,001): 121±93 times higher. - The CK method can detect very early DMD even patients who were not yet clinical expression: CK results of 17 DMD patients of first stage were 6279±4114 IU/l higher than CK results of normal children (p<0,001). 11/24 patient's brothers were not yet clinical expression detected DM D by CK higher than normal child (p<0,001). - Value of CK for heterozygote detection was 82,3% for DMD patient's mothers who had clearly family history and 35,3% for DMD patient's mothers who had only one child with DMD in the family. - Gene mutation of two DMD patients with clearly family history had not belonged to 48 exon based on PCR result analysis. 120 . TCNCYH 23 (3) 2003 Nghiên cứu giá trị Creatine kinase trong chẩn đoán sớm, phát hiện dị hợp tử, bớc đầu thăm dò ở mức độ gen của bệnh loạn dỡng cơ Duchenne ở trẻ em Việt Nam Nguyễn Thị Trang 1 ,. trên nghiên cứu này nhằm 2 mục tiêu: - Xác định giá trị creatine kinase trong chẩn đoán, đặc biệt chẩn đoán sớm bệnh DMD cho bệnh nhi và phát hiện nữ dị hợp tử. - Bớc đầu thăm dò ở mức độ gen. với trị số tối đa của trẻ em bình thờng. Việc chẩn đoán sớm bệnh DMD là rất cần thiết để chỉ định phát hiện dị hợp tử và t vấn di truyền. Về giá trị của CK trong phát hiện dị hợp tử của bệnh