ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền bắc việt nam Phan Thị Ngà, Mary B. Crabtree* Viện Vệ sinh dịch tễ trung -ơng (VSDTTƯ), Hà Nội *Trung tâm kiểm soát bệnh tật, Fort Collins, Colorado virut, kỹ thuật này nhạy nh-ng chỉ có thể ứng I. Đặt vấn đề dụng để định loại sự hiện diện vật liệu di Trong những năm gần đây, có rất nhiều truyền của những virut đã biết [8, 9, 10]. căn nguyên virut gây HCNC mới đ-ợc phát Trong thực tế vật liệu di truyền của nhiều virut hiện, hoặc mới thấy xuất hiện ở những vùng nh- là một túi cóp nhặt (grap-bags), nó có tr-ớc đây ch-a có sự l-u hành của những đ-ợc một số gen từ vật chủ của nó cũng nh- virut này ví dụ nh- virut Hendra, virut viêm có đ-ợc một số gen từ những virut khác. Do não Nhật bản (VNNB) ở Australia, virut Nipah vậy vật liệu di truyền của nhiều virut trong các ở Malaysia, virut West Nile ở Mỹ [6, 8]. ở Việt họ khác nhau trong phần lớn các tr-ờng hợp Nam theo số liệu thống kê, hàng năm có rất khác nhau, nh-ng trong một số tr-ờng khoảng 2000 - 3000 tr-ờng hợp bị HCNC, hợp lại t-ơng tự nh- nhau về trình tự của vật nh-ng cho đến nay mới xác định đ-ợc virut liệu di truyền [3, 5]. Nên có giả thiết rằng: kết VNNB, virut đ-ờng ruột là căn nguyên, số quả xác định d-ơng tính từ mẫu bệnh phẩm còn lại có thể do nhiễm virut khác [2, 4]. chỉ đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di Để phát hiện một tác nhân virut mới gây truyền của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân bệnh, phân lập virut có ý nghĩa quan trọng lập virut từ những mẫu bệnh phẩm này, hiệu cho việc xác định tác nhân, tuy nhiên phân quả phân lập đ-ợc virut rất cao. lập virut th-ờng ít đạt kết quả do bị ảnh h-ởng Do vậy trong nghiên cứu này cặp mồi của của nhiều yếu tố nh- thời gian lấy mẫu, bảo 3 nhóm virut là những nhóm virut đã đ-ợc xác quản và vận chuyển mẫu làm giảm hiệu giá định hoặc giả định có thể là tác nhân gây virut trong mẫu, mặt khác thời gian có kết quả HCNC [4, 9, 10] đ-ợc sử dụng sàng lọc mẫu chậm. Ng-ợc lại kỹ thuật PCR cho phép DNT để phân lập virut gây HCNC do muỗi khuếch đại nhiều lần theo cấp số nhân những truyền ở miền bắc Việt Nam trong năm 2003. đoạn ADN phiên mã từ vật liệu di truyền của Bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng mồi đột biến của 3 nhóm virut để chọn mẫu dịch não tuỷ (DNT) phân lập virut gây hội chứng não cấp (HCNC) do muỗi truyền. Xét nghiệm 53 mẫu DNT của bệnh nhân HCNC bằng kỹ thuật RT-PCR, xác định có 16 tr-ờng hợp d-ơng tính với tỉ lệ nh- sau: 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut do muỗi truyền, 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut tiềm tàng, 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá. Kết quả d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR không thể thay thế kết quả phân lập, nh-ng nó định h-ớng cho việc chọn mẫu thích hợp để phân lập virut. Sử dụng tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng C6/36 để phân lập virut do muỗi truyền. Từ 7 mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi truyền, phân lập đ-ợc 7 chủng virut, trong số này có 5 chủng là virut VNNB, 1 chủng là virut thuộc nhóm virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở Việt nam 2002, còn 1 chủng ch-a định loại đ-ợc. 15 TCNCYH 30 (4) - 2004 Tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng II. Vật liệu và ph-ơng pháp C6/36, môi tr-ờng nuôi tế bào Eagle Minimun 2.1. Vật liệu: Essential Medium (EMEM) có 10 % huyết Mẫu bệnh phẩm: 53 mẫu DNT của bệnh thanh bê bào thai. nhân HCNC đ-ợc lấy ở Viện Nhi trung -ơng Máy PCR, các trang thiết bị, sinh phẩm trong tháng 4 và tháng 5 năm 2003, các mẫu hoá chất và vật liệu cần thiết khác. DNT đ-ợc xác định không có kháng thể IgM 2.2. Ph-ơng pháp: kháng VNNB. Tách chiết ARN của virut từ DNT bằng bộ Sử dụng mồi đột biến một số nucleotit sinh phẩm QIAamp theo h-ớng dẫn của bộ (denegenate primer) để tăng độ nhậy của kỹ sinh phẩm. thuật RT-PCR: Với nhóm virut do muỗi truyền sử dụng cặp mồi của virut nhóm Alpha, Flavi, Kỹ thuật RT-PCR thực hiện theo h-ớng Bunya. Với nhóm virut tiềm tàng sử dụng cặp dẫn của sinh phẩm. mồi của nhóm virut Herpes. Với nhóm virut Phát hiện vật liệu di truyền của virut trong lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc, sử mẫu DNT với mồi đột biến (denegenate dụng cặp mồi của nhóm virut Entero, Adeno primer). và Nipah. Các mẫu chứng d-ơng cho kỹ Phân lập virut bằng tế bào muỗi C6/36 thuật RT-PCR do Trung tâm kiểm soát bệnh theo th-ờng quy phòng thí nghiệm Virut viêm tật CDC, Mỹ và Viện Y học Nhiệt đới não Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung -ơng. Nagasaki cung cấp. Định loại sơ bộ virut phân lập bằng kỹ Cặp mồi đặc hiệu để định loại virut VNNB thuật ELISA-Sandwich với kháng thể kháng (841N, 2670 R), cặp mồi đặc hiệu để định virut VNNB. Những mẫu d-ơng tính đ-ợc loại virut Arbo mới phát hiện ở Việt Nam (85F, khẳng định bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi 475 R). đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu âm tính Bộ sinh phẩm QIAamp để tách chiết ARN đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của virut của QIAGEN, Nhật Bản. nhóm Alpha, nhóm Bunya, virut Arbo mới [1]. Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR trực tiếp Sản phẩm PCR tổng hợp đ-ợc kiểm tra của Roche (Titan one tube RT-PCR System), trên thạch 1% trong Tris-Borat-EDTA có Nhật Bản. ethidium bromide chạy điện di 100 mA, 40 Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR của phút, đọc kết quả bằng máy đọc Polaroid Takara Bio Inc, Nhật Bản. theo nguyên lý hoá phát quang (Chemilluminescence). Bảng 1. Kết quả xác định căn nguyên virut gây HCNC, 2003 bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi của 3 nhóm virut Mồi của nhóm virut Số mẫu xét nghiệm Số mẫu d-ơng tính % Do muỗi truyền 53 8 15,09 Virut tiềm tàng 53 7 12,96 Lây qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc 53 1 1,88 16 TCNCYH 30 (4) - 2004 VN105 VN89 VN82 VN81 VN79 Neg. Pos. 1 Kb Trong số 53 mẫu DNT của bệnh nhân năm Có 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi 2003 đ-ợc xác định không có kháng thể IgM của nhóm virut do muỗi truyền (nhóm virut kháng virut VNNB, ứng dụng kỹ thuật RT- Bunya), có 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với PCR để phát hiện nhanh vật liệu di truyền của mồi của nhóm virut tiềm tàng (nhóm virut virut. Kết quả d-ơng tính đ-ợc xác định với Herpes), có 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính với mồi của 3 nhóm virut với tỉ lệ xác định d-ơng mồi của nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu tính với cặp mồi của từng nhóm virut nh- sau: hoá, tiếp xúc (nhóm virut Entero). Bảng 2. Kết quả phân lập virut từ các mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi truyền Ký hiệu mẫu DNT Ký hiệu chủng virut Kết quả (+) với mồi của nhóm virut do muỗi truyền Kết quả phân lập virut Kết quả định loại virut 03CSF13 // + (Weak band) Hết mẫu // 03CSF14 03VN76 + ( Strong band) D-ơng tính Arbo mới 03CSF17 03VN79 + (Weak band) D-ơng tính VNNB 03CSF23 03VN81 + (Weak band) D-ơng tính VNNB 03CSF25 03VN82 + (Weak band) D-ơng tính VNNB 03CSF62 03VN89 + (Weak band) D-ơng tính VNNB 03CSF78 03VN99 + (Weak band) D-ơng tính Ch-a xác định 03CSF85 03VN105 + (Weak band) D-ơng tính VNNB Hình 1: Kết quả định loại virut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu với virut VNNB 17 TCNCYH 30 (4) - 2004 Thử nghiệm phân lập virut bằng tế bào muỗi với mồi đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu C6/36 từ các mẫu DNT đ-ợc xác định d-ơng âm tính đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của virut nhóm Alpha, virut nhóm Bunya và virut nhóm virut do muỗi truyền, kết quả phân lập Arbo mới phát hiện ở Việt Nam 2002. Kết quả đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT. Virut VNNB xác định có 5 chủng là virut VNNB, có 1 trong n-ớc nổi tế bào gây nhiễm đ-ợc phát chủng là thuộc nhóm genotyp của virut Arbo hiện bằng kỹ thuật ELISA-Sandwich với mới phân lập ở Việt Nam năm 2002, còn 1 kháng thể đặc hiệu kháng virut VNNB, xác chủng virut ch-a định loại đ-ợc, không có định 5 mẫu d-ơng tính, 2 mẫu âm tính bằng mẫu nào d-ơng tính với mồi của virut nhóm kỹ thuật này. Những mẫu d-ơng tính đ-ợc Alpha và virut nhóm Bunya. kiểm tra và xác dịnh bằng kỹ thuật RT-PCR 1 Kp Pos. VN 76 VN 99 Neg. 100 bp phòng bệnh [9, 10]. Tuy nhiên kết quả âm IV. Bàn luận tính với mồi của những virut khác chỉ có nghĩa Việc phát hiện nhanh vật liệu di truyền của rằng trình tự phần khuếch đại của mẫu không virut bằng kỹ thuật RT-PCR, kết quả có thể đ-ợc phát hiện [10]. Ví dụ nh- trong nghiên nhận đ-ợc ngay trong ngày nhận mẫu có ý cứu này không có mẫu nào đ-ợc phát hiện nghĩa quan trọng để định h-ớng cho việc Hình 2: Kết quả định loại vi rut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu của vi rut Arbo mới 18 TCNCYH 30 (4) - 2004 d-ơng tính với mồi của virut nhóm Flavi, d-ơng tính với mồi của nhóm virut tiềm tàng, mặc dù virut VNNB là một virut thuộc nhóm có 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính vi mồi của Flavi gây HCNC ở Việt Nam [4]. Kết quả này nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá. cũng phù hợp với nghiên cứu đã công bố Sử dụng tế bào muỗi Aedes Albopictus tr-ớc đây việc phát hiện genôm của virut dòng C6/36 để phân lập virut từ 7 mẫu DNT VNNB trong dịch não tuỷ th-ờng ít đạt kết đ-ợc xác định d-ơng tính bằng mồi của nhóm quả, ng-ợc lại đối với virut West Nile, một virut do muỗi truyền, kết quả phân lập đ-ợc 7/ virut thuộc nhóm Flavi, việc phát hiện genôm 7 chủng virut, trong số này 5 chủng đ-ợc xác của virut này trong dịch não tuỷ có hiệu suất định là virut VNNB, 1 chủng đ-ợc xác định cao hơn [7]. thuộc nhóm virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở Mặt khác kỹ thuật PCR cũng có những Việt Nam năm 2002, 1 chủng ch-a định loại giới hạn nhất định vì nó không định loại đ-ợc đ-ợc. toàn bộ thành phần virut, nên kết quả xác Lời cảm ơn: định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR không thể thay thế đ-ợc kết quả phân lập Đề tài thực hiện tại CDC Fort Collins, virut. Colorado và Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương. Với giả thiết kết quả xác định d-ơng tính bằng kỹ thuật PCR từ mẫu bệnh phẩm là Tập thể tác giả xin trân trọng cảm ơn: đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di truyền - Sự hỗ trợ của nhóm Pathogen Discovery của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân lập virut Group, CDC Atlanta về việc trợ giúp kỹ thuật từ những mẫu bệnh phẩm này, khả năng và sinh phẩm để phát hiện vật liệu di truyền phân lập đ-ợc virut rất cao. Kết quả phân lập của virut nhóm Herpes, Adeno và Entero. đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT đ-ợc xác - GS. Kouichi Morita về việc cung cấp sinh định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR trong phẩm cho kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vật nghiên cứu này là một minh chứng cho nhận liệu di truyền của virut Nipah, virut VNNB, định trên. Mặc dù 7 mẫu DNT đ-ợc xác định virut Arbo mới. d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi của virut nhóm Bunya, nh-ng 7 chủng virut TàI liệu tham khảo đ-ợc phân lập từ các mẫu dịch não tuỷ này không có mẫu nào d-ơng tính với mồi của 1. Phan Thị Ngà, Kouichi Morita. 2004. virut nhóm Bunya, kết quả này cho thấy việc Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ sử dụng mồi đột biến để phát hiện vật liệu di của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền truyền từ mẫu DNT làm tăng độ nhạy của kỹ Bắc Việt Nam. Tạp chí nghiên cứu Y học, tập thuật RT-PCR, nh-ng có thể có d-ơng tính 29, số 3: giả [3]. 2. Nguyễn Thị Hiền Thanh. 2003. B-ớc đầu tìm hiểu căn nguyên gây viêm màng não V. kết luận ở trẻ em do một số virut đ-ờng ruột. Tạp chí Y ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xét nghiệm học dự phòng, tập XIII, số 4 (61): 5 12. 53 mẫu DNT của bệnh nhân có HCNC với 3. Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M. cặp mồi của 3 nhóm virut, xác định: Có 8/53 th et al. 1996. Virology 3 Edition: 15 57. (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut do muỗi truyền, có 7/53 (12,96 %) mẫu 4. Ha D. Q., Calisher C. H., Tien P. H., 19 TCNCYH 30 (4) - 2004 Isolation of a newly recognized Alphavirus Waqar M. A. 1994. Detection of West Nile from mosquitoes in Vietnam and evidence for and Japanese Encephalitis viral genome human infection and disease. Am. J. Trop. sequences in cerebrospinal fluid from acute Med. Hyg. 53(1): 100 -104. encphalitis cases in Karachi, Pakistan. Microbiol Immmunol, Vol. 38: 827 -830. 5. Hazelton P. R., Gelderblom H. R. 2003. Electron Microscopy for rapid diagnosis of 8. Parida M., Posadas G., Inoue S., infection agents in Emergent situation. Hasebe F. and Morita K. 2004. Real-Time Emerging Infectious Diseases. Vol. 9, No. 3: Reverse Transcription Loop-Mediated 294 303. Isothermal Amplification for Rapid Detection of West Nile virus. Journal of clinical 6. Mackenzie J.S., Johansen C.A., Microbiology, Vol. 42 No. 1: 257 263. Ritchie S.A., Van den Hurk A.F & Hall R.A. 2002. Japanese encephalitis as an emerging 9. Read S. J., Jeffery K. J. M. anh virus: The emergence and spread of Bangham C. R. M. 1997. Aseptic Meningitis Japanese encephalitis virus in Australia. In and Encephalitis: The Role of PCR in the Current topics in microbiology and diagnostic laboratory. Journal of Clinical Immunology: Japanese encephalitis and Microbiology : 691 696. West Nile virus infections, Vol. 267: 49-73. 10. Weidmann M., Rudaz V., Nunes M. R. Edited by J.S. mackenzie, A.D. Barret & V. T., Vasconcelos P. F. C. and Hufert F. T. Deubel. Berlin: Springer-Verlag. 2003. Rapid detection of human pathogenic 7. Igarashi A., Tanaka M., Morita K., Orthobunyaviruses. Journal of Clinical Ahmed Akhtar, Ahmed Arsalam, Akram D. S., Microbiology: 3299 3305. Summary Application RT-PCR for the selection of CSF samples for the isolation of virus transmiss by mosquitoes from acute encephalitis syndrome patients in the North Vietnam, 2003 RT-PCR technique with denegenate primers of three viral groups were used to selection samples for the isolation of mosquito borne viruses which cause acute encephalitis (AES) syndrome. The results showed that 16 out of 53 positive cases were confirmed by RT-PCR with proportion as following: 8/53 (15.09 %) were confirmed positive by primers of mosquito borne viruses, 7/53 (12.96 %) by primers of latent viruses and 1/53 (1.88 %) by viral group of hand-food-mouth diseases. The confirmed positive results by RT-PCR can not replace results of the isolation of virus, but it orients for the selection of relevant CSF samples for the isolation of virus . The Aedes Albopictus clone C6/36 cells were used to isolate virus which is transmitted by mosquitoes. From 7 CSF samples which were confirmed positive by RT-PCR, the isolation of virus were carried out yielding 7 virus strains. Among them, 5 strains were confirmed Japanese encephalitis virus, 1 strain belongs to group of new type Arbovirus and 1 strain was unknown. 20 TCNCYH 30 (4) - 2004 . ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền bắc việt nam Phan Thị Ngà, Mary B. Crabtree* Viện Vệ sinh dịch. ADN phiên mã từ vật liệu di truyền của Bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng mồi đột biến của 3 nhóm virut để chọn mẫu dịch não tuỷ (DNT) phân lập virut gây hội chứng não cấp (HCNC) do muỗi truyền. Xét. cho thấy việc Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ sử dụng mồi đột biến để phát hiện vật liệu di của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền truyền từ mẫu DNT làm tăng độ nhạy của kỹ