Bài 7: Tái DNA sửa chữa DNA Chứng minh DNA tái theo kiểu bán bảo toàn Các đặc tính yếu tố thiết yếu tái Cơ chế tái Sự tái tế bào chân hạch 5-Sửa chữa DNA • Ngun phân (tạo tế bào con) & giảm phân (tạo tế bào con) cần nhân đôi nhiễm sắc thể → cần nhân đôi DNA (tái bản) • Chứng minh DNA tái theo kiểu bán bảo tồn Thí nghiệm Meselson & Stahl * Thí nghiệm sơ khởi: - Ống nghiệm 1: Ly tâm siêu tốc DD CsCl (40.000 v/p 48 giờ) → tạo gradien tỷ trọng (tỷ trọng tăng dần hướng đáy ống nghiệm) - Ống nghiệm 2: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N (40.000 v/p 48 giờ) → tạo lớp cĩ tỷ trọng nặng nằm gần đáy ống nghiệm - Ống nghiệm 3: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 14N (40.000 v/p 48 giờ) → tạo lớp cĩ tỷ trọng nhẹ nằm ống nghiệm - Ống nghiệm 4: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N DNA 14N (40.000 v/p 48 giờ) → tạo lớp tương ứng với lớp ống nghiệm 1&2 • • Kỹ thuật ly tâm theo Gradien mật độ: • DD CsCl ly tâm siêu tốc, ion Cesium hướng đáy ống ( tạo Gradien mật độ hay thang tỷ trọng - ion Cesium nhiều đáy ON) • Mỗi DNA lắng thành lớp tương ứng theo tỷ trọng (DNA 15N DNA 14N trên) Mật độ hay tỷ trọng khối lượng hay số hạt chất 1đơn vị thể tích (gr/cm3) Tỷ trọng số đo độ chặt chất * Thí nghiệm Meselson & Stahl Ni VK E.coli MT chứa 15N nguồn đạm nhất, sau thời gian trích DNA nghiên cứu Chuyển VK E.coli sang MT chứa 14N nguồn đạm để đủ lần phân chia tế bào, trích DNA nghiên cứu Tương tự nuôi tiếp E.coli MT chứa 14N để đủ 2,3 lần phân chia tế bào, trích DNA nghiên cứu Ghi nhận giải thích kết Trong MT chứa 15N, DNA E.coli chứa 15N lắng thành lớp ống nghiệm Chuyển sang MT chứa 14N, lần phân bào thứ có lớp DNA lai (1 mạch 15N mạch 14N ) - lần phân bào thứ có lớp gồm: lớp DNA lai (50%) lớp DNA 14N (50%) - lần phân bào thứ có lớp gồm: lớp DNA lai (25%) lớp DNA 14N (75%) Kết luận DNA tự nhân đơi theo kiểu bán bảo tồn • Các đặc tính yếu tố thiết yếu tái • Các đặc tính ∀ • Theo chế bán bảo tồn ∀ • Phát triển theo hai hướng từ OriC ∀ • Sự gắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, theo cách đối song (với sợi cha-mẹ) bắt cặp bổ sung ∀ • Khơng liên tục hai sợi Cơ chế bán bảo toàn Cơ chế bán bảo toàn DNA cĩ mang mạch đơn cha-mẹ mạch đơn cĩ nucleotide lấy từ mơi trường (TN chứng minh Meselson & Stahl) Như DNA cĩ mang mạch cũ 1mạch (bán bảo tồn) • • Các yếu tố thiết yếu • • (2) Sợi khuôn (sợi đơn cha-mẹ): sợi giữ phân tử DNA (bán bảo toàn) (1) Các nucleoside triphosphate: dATP, dTTP, dCTP dGTP (nguyên liệu cho tái & nhiên liệu cung cấp lượng) (3) Mồi RNA (do DNA Primase tạo): đoạn RNA gồm 4-12 nucleotide, giúp DNA pol III kéo dài chuỗi polynucleotide • (4) Các enzyme protein, bao gồm: • Helicase: enzyme mở xoắn • DNA Gyrase: cản xoắn trở lại • DNA Primase: tạo đoạn mồi RNA • • • DNA pol III kéo dài sợi DNA tăng trưởng DNA pol I loại đoạn mồi RNA tổng hợp đoạn DNA thay đoạn mồi DNA ligase tạo cầu nối phosphodiester hai đoạn Okazaki cạnh • SSB Protein giữ sợi DNA thẳng (các sợi khơng tái bắt cặp) • Các đặc tính DNA polymerase ∀ • Gắn nucleotide vào 3’OH mồi 3’OH sợi tăng trưởng ∀ • Kéo dài chuỗi theo hướng 5’→ 3’ (dọc theo hướng 3’→ 5’ sợi khn) ∀ • DNA polymerase III kéo dài chuỗi DNA theo hướng 5’→ 3’ ∀ • DNA pol I cĩ vai trị: • *loại mồi (đĩng vai trị Exonuclease 5’→ 3’) • * thay mồi DNA ( đĩng vai trị DNA polymerase theo hướng 5’→ 3’) * Tổng hợp DNA in vitro: 1956 Kornberg tổng hợp DNA in vitro nhờ ly trích enzyme DNA polymerase E.coli Enzyme tổng hợp DNA in vitro có: DNA khn, loại Nucleotide, đoạn mồi RNA, Mg2+ ( sau gọi tên DNA Kornberg hay DNA polymerase I) Sau người ta biết E.coli có DNA polymerase I, II, III (nay 5) Tóm tắt trình tự tái DNA: DNA sợi mở xoắn (Helicase)→ tạo đoạn mồi (DNA primase) → tổng hợp sợi từ đầu 3’ OH mồi (DNA polymeraseIII) dựa vào sợi khuôn 3’ → 5’ → loại đoạn mồi (DNA polymerase I- Exonuclease 5’→ 3’ ) → tổng hợp đoạn DNA thay đoạn mồi (DNA polymerase theo chiều 5’→ 3’ ) Ở sợi bất liên tục DNA Ligase nối đoạn Okazaki lại với Sự tái tế bào chân hạch Tế bào chân hạch tái DNA theo chế tế bào tiền hạch - theo hướng phát triển; - kéo dài 5’→ 3’ (bổ sung & đối song với sợi khuôn); - cần mồi RNA; - không liên tục sợi khởi đầu đồng thời nhiều ngàn điểm phân tử DNA dài (thay 1) - Ở tế bào chân hạch cĩ DNA polymerase khác TB tiền hạch • • • • Sửa chữa DNA • ° Lỗi tái DNA (do DNA pol) gây đột biến làm biến dịng tế bào Vì phải sửa chữa? Sự sống cịn sinh vật tùy thuộc nhân đơi xác genome ° Lỗi tổng hợp mRNA (do RNA pol) dẫn tới protein khiếm khuyết, mRNA có đời sống ngắn (ít gây hậu kéo dài) Có nhiều cách, sau tái bản, ví dụ sửa chữa nhờ hoạt tính exonuclease DNA pol (đọc in thử): Khi nucleotide sai vào chuỗi, đầu chuỗi có tách khỏi khn để vào vị trí exonuclease • • • • Tỷ lệ sai sót tái DNA thực tế 10-10 - 10-11 Tỷ lệ sai sót DNA pol qua 10- Tỷ lệ sai sót DNA pol đọc nhầm 10-4 Qua số liệu chứng minh có nhiều chế sửa chữa sai hỏng DNA sau q trình tái • Tóm lại, q trình tái bản, prokaryote eukaryote, xảy an toàn để trì thơng tin ngun vẹn phân tử DNA • Phân tử DNA sợi bổ sung: x2 thông tin; sợi bị xáo trộn sửa chữa nhờ sợi nguyên vẹn ... điểm phân tử DNA dài (thay 1) - Ở tế bào chân hạch cĩ DNA polymerase khác TB tiền hạch • • • • Sửa chữa DNA • ° Lỗi tái DNA (do DNA pol) gây đột biến làm biến dịng tế bào Vì phải sửa chữa? Sự sống... - 10-11 Tỷ lệ sai sót DNA pol qua 10- Tỷ lệ sai sót DNA pol đọc nhầm 10-4 Qua số liệu chứng minh có nhiều chế sửa chữa sai hỏng DNA sau q trình tái • Tóm lại, trình tái bản, prokaryote eukaryote,... Tóm tắt q trình tự tái DNA: DNA sợi mở xoắn (Helicase)→ tạo đoạn mồi (DNA primase) → tổng hợp sợi từ đầu 3’ OH mồi (DNA polymeraseIII) dựa vào sợi khuôn 3’ → 5’ → loại đoạn mồi (DNA polymerase I-