Đang tải... (xem toàn văn)
Giáo trình nuôi cấy mô.
Giáo trình ni cấy mơ Tập hợp thực hành nuôi cấy mô Được sưu tầm, xin giới thiệu đến bạn đồng nghiệp bạn học sinh, sinh viên BÀI 1: MỞ ĐẦU 1.CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHỊNG THÍ NGHIỆM NI CẤY MƠ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT a Phòng rửa cất nước - Máy cất nước lần - Máy cất nước lần b Phòng hấp – sấy - Autoclave - Tủ sấy 60 – 200oC c Phòng chuẩn bị mơi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g) - Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g) - pH kế - Máy khuấy từ - Tủ lạnh - Lị vi sóng (microwave) d Phịng thao tác ni cấy - Tủ cấy vô trùng (laminar) - Quạt thông gió - Đèn tử ngoại treo tường e Phịng ni - Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang - Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang - Tủ ấm f Phịng thí nghiệm: (phịng dùng để tiến hành phân tích sinh hóa, phân tử di truyền) - Kính hiển vi mắt (độ phóng đại 1000 lần) - Kính lúp mắt (độ phóng đại 75 lần) - Microtome - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu - Quang phổ kế … CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CƠNG TRONG NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT Có nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vơ trùng - Chọn môi trường chuẩn bị môi trường cách - Chọn mô cấy xử lý mơ cấy thích hợp trước sau cấy 2.1 Ý nghĩa vô trùng nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường để nuôi cấy mô tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khống… thích hợp cho loại nấm vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào nấm vi khuẩn lớn nhiều so với tế bào thực vật, môi trường nuôi cấy nhiễm vài bào tử nấm vi khuẩn sau vài ngày đến tuần, toàn bề mặt môi trường mô nuôi cấy phủ đầy nhiều loại nấm vi khuẩn Thí nghiệm phải bỏ điều kiện mơ ni cấy không phát triển chết dần 2.2 Nguồn tạp nhiễm Có nguồn tạp nhiễm chính: - Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy nút đậy không vô trùng tuyệt đối - Trên bề mặt bên mô cấy tồn sợi nấm, bào tử nấm vi khuẩn - Trong trình thao tác làm rơi nấm vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường 2.3 Kỹ thuật vô trùng 2.3.1 Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy môi trường a Dụng cụ thuỷ tinh Thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng thí nghiệm thường xử lý dung dịch sulfocromate lần đầu trước đưa vào sử dụng; sau cần rửa xà phòng, tráng nước cất để thật trước sử dụng Trong trường hợp dụng cụ thuỷ tinh dùng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật địi hỏi vơ trùng, khử trùng tủ sấy nhiệt độ cao nhiều phút nhiều Các dụng cụ ln gói giấy nhơm hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khử trùng Bảng 1.1: Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh nhiệt nhiệt độ khử trùng Nhiệt độ (oC) Thời gian khử trùng(phút) 160 45 170 18 180 7,5 190 1,5 b Nút đậy Thường dùng nút đậy làm gịn khơng thấm nước.Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc dễ dàng q trình ni cấy Bơng khơng thấm nước loại nút đơn giản có nhược điểm sau: - Nếu hấp nút bơng bị ướt dính mơi trường sau dễ bị nhiễm nấm, với thí nghiệm tiến hành thời gian dài - Thao tác làm nút chậm, không thuận tiện nuôi cấy qui mô lớn - Chỉ dùng vài lần phải bỏ Hiện người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay nút Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm bình tam giác nhựa chịu nhiệt hấp vô trùng nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng Một số phịng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox cao su thuận tiện cho việc vơ trùng khơ ướt Cũng sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy… c Môi trường Môi trường nuôi cấy thường hấp khử trùng nồi hấp (autoclave), khử trùng áp suất nước bão hòa Thời gian hấp từ 15-30 phút áp suất nước bão hòa 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết sinh vật có mơi trường bị tiêu diệt, kể dạng bào tử Sau vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm nút để tránh bị nhiễm trở lại Bảng 2: Thời gian khử trùng dung dịch môi trường lỏng nồi hấp (autoclave) 121oC 103,4 kPa Thể tích mơi trường (mL) Thời gian hấp khử trùng(phút)