Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Ni cấy mơ (tissue culture) là một nhánh của sinh học, trong đó, mơ hay tế bào được ni cấy nhân tạo trong một mơi trường có kiểm sốt. Nhân giống in vitro th ự c v ậ t hay vi nhân giống thực vật (micropropagation) là phương thức nuôi cấy tế bào, cơ quan thực vật trong ống nghiệm, bình ni cấy, ở điều kiện vô trùng, nhằm mục đích nhân nhanh giống, mang lại hiệu quả kinh tế cao. KHÁI NIỆM Gồm 05 điểm nổi bật: - Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao. - Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt di truyền. - Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh. - Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản xuất. - Trẻ hóa vật liệu giống. ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Gồm 03 điểm nổi bật: - Hạn chế về chủng loại sản phẩm. - Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: đặc biệt là các biến dị di truyền. NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Các yếu tố đảm bảo sự thành công trong nuôi cấy mô thực vật là gì? 2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng 2.2 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách 2.3 Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy 2.1 BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, là môi trường thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm chắc chắn phải loại bỏ. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy, đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy. - Trong thao tác nuôi cấy cần tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường. VÔ TRÙNG MÔ CẤY Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, diệt khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập trên bề mặt mô cấy. Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochlorite canxi 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Hypochlorite natri 2 5 – 30 Rất tốt Hydroperoxid (H 2 O 2 ) 10 – 12 5 – 15 Tốt Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt HgCl 2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh 4 – 50 (mg/l) 30 – 60 Khá tốt Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt nấm, diệt khuẩn có thể dùng để xử lý mô cấy: [...]... CẤY Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có hàng trăm loại môi trường khác nhau Tuy nhiên có thể chia chúng thành 3 nhóm: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển hình là môi trường Knop, môi trường Knudson C; - Môi trường trung bình: điển hình là môi trường môi trường White; môi trườnng B5 của Gamborg; - Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình là môi trường Murashige – Skoog (môi trường MS) MƠI TRƯỜNG NI CẤY... dùng trong môi trường nuôi cấy thường từ 5 20% thể tích môi trường Nước chiết: nước chiết nấm men, malt, là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật, đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạng thương phẩm, thường dùng là 1 gam cho 1 lít môi trường TÁC NHÂN LÀM THAY ĐỔI TRẠNG THÁI VẬT LÝ MƠI TRƯỜNG Tác nhân tạo gel quyết định trạng thái vật lý của mơi trường ni cấy (agar,... kéo, kẹp, giấy bọc, bông, ống nghiệm, v.v Tủ cấy: là loại tủ có thiết bò thổi không khí vô trùng vào vị trí thao tác cấy KỸ THUẬT CẤY VƠ TRÙNG • • • • Vơ trùng dụng cụ trong ni cấy Rữa tay bằng xà phòng và nước trước khi cấy Lau cồn mặt bàn tủ cấy vơ trùng Dùng ngọn lửa đèn cồn để vơ trùng pince, dao cấy, kéo, • Tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ vơ trùng trong tủ cấy • Đậy các dụng cụ và mơi trường... chuyện trong phòng cấy 2.2 CHỌN ĐÚNG MƠI TRƯỜNG VÀ CHUẨN BỊ MƠI TRƯỜNG ĐÚNG CÁCH MƠI TRƯỜNG NI CẤY Thành phần của mơi trường ni cấy thay đổi tùy theo lồi thực vật, loại tế bào, mơ và cơ quan ni cấy Đối với cùng một loại mơ, cơ quan nhưng mục đích ni cấy khơng giống nhau, mơi trường sử dụng cũng khác nhau Mơi trường ni cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy PHÂN LOẠI... toàn vi sinh vật và bào tử (60 – 80 phút) 100 212 Nhiệt độ sôi của nước có khả năng tiêu diệt tế bào dinh dưỡng nhưng không tiêu diệt được bào tử 82 – 93 179 – 200 Tiêu diệt hoàn toàn tế bào đang phát triển vi khuẩn, nấm men, nấm mốc 62 – 82 151 – 180 Các vi sinh vật ưa nhiệt vẫn phát triển được 60 – 77 140 – 171 Pasteur hóa, tiêu diệt phần lớn vi sinh vật gây bệnh trong sữa, nước quả, trừ bào tử của... 0 32 Các loài vi sinh vật ngừng phát triển – 18 0 Vi khuẩn ở trạng thái chết – 251 – 420 Rất nhiều loài vi sinh vật không bò chết trong hydrogen lỏng KỸ THUẬT CẤY VƠ TRÙNG Buồng cấy: là buồng có diện tích nhỏ, có hai lớp cửa Buồng cấy cần lát gạch tráng men, tường sơn có thể lau rửa được Trước mỗi lần sử dụng, buồng cấy cần được xử lý vơ trùng sơ bộ Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều cần phải được... hấp được bảo quản ở 250C 2.3 CHỌN MƠ CẤY VÀ XỬ LÝ MƠ CẤY CHỌN MƠ CẤY VÀ XỬ LÝ MƠ CẤY Các mơ có sức phát triển mạnh: mơ phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, lá non, cuống hoa, chồi bên, , thường được dùng làm mơ cấy Các mô khác nhau trên cùng một cây có thể cho các loại mô sẹo hoàn toàn khác nhau với khả năng tái sinh rất khác nhau Sau khi cấy, mơ cấy thường được đặt trong các điều kiện ổn định về nhiệt... Trong q trình xử lý mơ cấy phải ngập hồn tồn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn Với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nước máy Sau khi xử lý xong, mơ cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vơ trùng và loại bỏ những phần bị hoại tử trước khi đặt mơ cấy lên mơi trường Quy trình khử trùng mẫu thực sinh: Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy Cho vào... sẹo hoàn toàn khác nhau với khả năng tái sinh rất khác nhau Sau khi cấy, mơ cấy thường được đặt trong các điều kiện ổn định về nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, , CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA PHỊNG THÍ NGHIỆM NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT ... ni cấy VƠ TRÙNG DỤNG CỤ THỦY TINH, MƠI TRƯỜNG VÀ NÚT ĐẬY Dụng cụ thủy tinh, mơi trường và nút đậy của chai lọ hay dụng cụ thủy tinh được vơ trùng bằng cách hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm trong thời gian 15 – 20 phút oC oF Tác động đến vi sinh vật 121 250 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (15 – 20 phút) 116 240 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào . Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Ni cấy mơ (tissue culture) là một nhánh của sinh học, trong đó, mơ hay tế bào được ni cấy nhân tạo trong. khác nhau. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có hàng trăm loại môi trường khác. phần của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường