Đang tải... (xem toàn văn)
Thành phần khoáng sét ảnh hưởng đến 1 số tính chất của đất
Chơng sáu Chế phẩm sinh vật dùng bảo vệ thực vật Để đáp ứng nhu cầu lơng thực, thực phẩm cung cấp cho ngời ngày tăng, trình sản xuất nông nghiệp ngày đợc phát triển Đồng thời với trình phát triển sản xuất xuất dịch hại nguyên nhân gây bất ổn đến suất chất lợng nông sản, gây thiệt hại tới 20 - 30% sản lợng, cao Để phòng chống dịch hại bảo vệ trồng ngời đà sử dụng biện pháp khác nhau: biện pháp thủ công, biện pháp vËt lý, biƯn ph¸p ho¸ häc, biƯn ph¸p sinh häc Trong thời gian qua biện pháp hoá học đợc coi biện pháp tích cực cho hiệu cao, nhanh, đơn giản, dễ sử dụng Nhng biện pháp bộc lộ nhiều tồn Mặt trái thuốc hoá học thể chỗ sử dụng thuốc không hợp lý, không đúng, sử dụng lâu dài kéo theo hàng loạt vấn đề nh: ảnh hởng tới sức khoẻ ngời động vật, tăng khả hình thành tính kháng thuốc sâu bệnh, tiêu diệt hệ thiên địch, phá vỡ cân sinh học, gây nhiều vụ dịch hại mới, gây hậu xấu tới môi trờng Chính hạn chế mà nhiều tác giả đà đề nghị cần thay đổi quan điểm phòng chống kiểm soát dịch hại, đặc biệt cần giảm số lợng thuốc hoá học Hiện hớng nghiên cứu kiểm soát dịch hại biện pháp quản lý tổng hợp dịch hại (IPM), biện pháp sinh học biện pháp quan trọng Các sinh vật nh: virus, vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, tuyến trùng, ong , nhện, đợc ứng dụng rộng rÃi việc hạn chế tác hại sinh vật gây hại cho trồng I Virus gây bệnh cho côn trùng Khái quát virus gây bệnh cho côn trùng Virus gây bệnh côn trïng lµ mét nhãm vi sinh vËt cã nhiỊu triĨn vọng công tác phòng chống côn trùng hại trồng Virus có kích thớc nhỏ có khả sống, phát triển mô, tế bào sống mà nuôi cấy môi trờng dinh dỡng nhân tạo Virus gây bệnh côn trùng có đặc điểm bật khác với nhóm virus khác là: khả chuyên tính hẹp, gây bệnh mô định vật chủ Virus côn trùng có vỏ protein (vỏ capxit) bao bọc phần lõi acid nucleic virus tạo nên thể vùi đa điện hay dạng hạt Tuy vậy, tất virus gây bệnh côn trùng tạo thành thể vùi Vì vậy, ngời ta chia virus gây bệnh côn trùng thành hai nhóm lớn, là: - Virus tạo thành thể vùi bao gồm virus đa diện nhân (NPV), virus đa diện dịch tế bào (CPV), virus hạt (GV), virus thuộc nhóm Entomopoxvirus (EPV) - Virus không tạo thành thĨ vïi nh− Iridovirus, Densovirus, Baculovirus HiƯn ng−êi ta đà mô tả đợc 700 bệnh virus 800 loài côn trùng Các virus gây bệnh côn trùng đợc xÕp thµnh hä sau: Baculoviridae, Reoviridae, Iridoviridae, Parvoviridae, Picaviridae, Poxviridae vµ Rhabdoviridae Hai hä Baculoviridae vµ Reoviridae cã nhiỊu loài tác nhân triển vọng việc phát triển BPSH trừ sâu hại Họ Baculoviridae: nhiều loài virus gây bệnh côn trùng đà phát đợc thuộc họ Khoảng 500/700 virus gây bệnh cho côn trùng đà biết thuộc họ Baculoviridae, quan trọng loài virus đa diện nhân virus hạt Nhiều loài đà đợc nghiên cứu sử dụng để trừ sâu hại Họ Reoviridae với điển hình virus đa diện dịch tế bào Những nhóm virus gây bệnh côn trùng 2.1 Nhóm Virus đa diện nhân (NPV) Nhóm NPV gồm virus gây bệnh côn trùng thuộc họ Baculoviridae, vùi hình khối đa diện chúng ký sinh nhân tế bào vật chủ Thể vùi cđa NPV ë t»m gåm 17 lo¹i axit amin Trong thể vùi chứa nhiều virion hình que Sâu bị bệnh NPV trở nên hoạt động, ngừng ăn; thể chúng có màu sắc sáng sâu khoẻ; căng phồng, trơng phù, chứa toàn nớc Khi có tác động giới lên bề mặt thể dễ dàng bị phá vỡ giải phóng dịch virus Các sâu bị chết bệnh NPV bị treo ngợc Nếu sâu bị chết NPV tế bào thành ruột phần đầu lại bám chặt vào phận NPV có tính chuyên hoá cao đứng thứ sau GV Thờng NPV loài côn trùng gây bệnh cho loài Riêng NPV sâu xanh Baculovirus heliothis gây bệnh cho loài sâu xanh Heliothis giới Một số NPV khác gây bệnh cho vài loài côn trùng Các virus NPV thờng ký sinh tế bào hạ bì, thể mỡ, khí quản, dịch huyết tơng biểu mô ruột NPV gây bệnh cho côn trùng thuộc bộ: cánh cứng, hai cánh, cánh màng, cánh vẩy, cánh mạch, cánh thẳng cánh nửa 2.2 Nhóm virus hạt (GV) GVvirus thuộc họ Baculoviridae, vùi dạng hạt Mỗi thể vùi chØ chøa cã mét virion, hiÕm chøa hai virion Virion virus hạt có dạng que Sâu bị bệnh GV thờng còi, chậm lớn, thể phân đốt rõ ràng, tầng biểu bì thể trở nên sáng màu, có phớt màu hồng, huyết tơng có màu trắng sữa Virus hạt có tính chuyên hoá cao virus gây bệnh côn trùng Virus hạt gây bệnh cho sâu xám mùa đông Agrotis segetum mà không gây bệnh cho loài sâu xám khác gần gũi với sâu xám mùa đông Virus hạt gây bệnh cho côn trùng thuộc cánh vảy Cha thấy côn trùng thuộc khác bị bệnh GV Virus hạt thờng xâm nhiễm mô mỡ, lớp hạ bì huyết tơng Ngời ta đà nghiên cứu đợc siêu cấu trúc GV loài côn trùng 2.3 Nhóm virus đa diện dịch tế bào (CPV) Virus đa diện dịch tế bào thuộc họ Reoviridae ký sinh chất dịch tế bào tế bào biểu mô ruột côn trùng Virus CPV tạo thành thể vùi Trong thể vùi CPV chứa virion hình cầu gồm sợi ARN Sâu bị nhiễm CPV chậm lớn, đầu to so với thể giai đoạn cuối phát triển bệnh lý, màu sắc thể sâu có màu sáng giống nh phấn trắng, đặc biệt mặt bụng thể Nếu sâu non tuổi lớn bị nhiễm CPV đến pha trởng thành bị chết với tỷ lệ cao Côn trùng bị nhiễm CPV thờng tạo thành khối u Bệnh CPV đợc phát côn trùng thuộc bộ: cánh cứng, hai cánh, cánh màng, cánh vảy, cánh mạch Virus CPV cã phỉ ký chđ réng, sù lan trun cđa bƯnh tăng lên nhờ qua nhiều ký chủ khác loài Các mẫu CPV phân lập từ ký chủ khác có tính độc khác Ngời ta đà nghiên cứu đợc siêu cấu trúc CPV 12 loài côn trùng Nhóm CPV đợc sử dụng BPSH so với NPV GV 3 Phơng thức lây nhiễm khả tồn tự nhiên virus gây bệnh côn trùng Phần lớn thể vùi NPV, GV, CPV đợc giải phóng từ thể sâu bị bệnh đà rơi xuống đất bám phận thực vật tạo thành ngn virus lan trun bƯnh Nh÷ng thĨ vïi cđa virus thức ăn xâm nhập vào ruột côn trùng Tại ruột côn trùng, dới tác động men tiêu hoá, thể vùi bị hoà tan giải phóng virion Qua biểu mô ruột virion xâm nhập vào dịch máu, tiếp xúc với tế bào xâm nhập vào bên tế bào để sinh sản gây bệnh cho vật chủ Chu kỳ phát triển cđa virus g©y bƯnh t»m nghƯ (NPV) gåm giai đoạn: - Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài không 12 Đây giai đoạn xâm nhiễm acid nucleic virus vào bên tế bào: virion đính vào vị trí thích hợp màng nhân tế bào - Giai đoạn tăng trởng: kéo dài từ 16 - 48 Đây giai đoạn tăng tr−ëng nhanh cđa virus Trong tÕ bµo vËt chđ xt trình tổng hợp protein acid nucleic virus dới điều kiển acid nucleic virus để hình thành cấu trúc giống nh dạng lới, sau 32 nhân tế bào vật chủ chứa acid nucleic virus dạng trần - Giai đoạn cuối: giai đoạn xảy tạo thành hạt virus có lắp ráp phần lõi acid nucleic virus với phần vỏ capxit protein để tạo thành virion Các virion hoàn thiện dần tạo thành hạt virus hoàn chỉnh Virus hoàn chỉnh đợc giải phóng khỏi tế bào cách phá huỷ màng tế bào nhiều vị trí nhanh chóng giải phóng hạt virus làm cho tế bào ký chủ bị tiêu diệt, số loài khác giải phóng từ tõ khái tÕ bµo chđ Thêi kú đ bƯnh cđa côn trùng bị nhiễm virus thờng kéo dài từ đến 12 ngày hơn, phụ thuộc vào tuổi vật chủ, nhiệt độ, ẩm độ nhiều điều kiện khác môi trờng Việc lây truyền nguồn bệnh virus côn trùng xảy theo hai hớng: + Lây truyền ngang: nguồn bệnh lây lan cá thĨ cïng mét thÕ hƯ ®iỊu kiƯn bƯnh phát thành dịch, nguồn virus bám bên vá trøng cña vËt chñ Khi në, Êu trïng gËm vỏ trứng chui bị nhiễm nguồn bệnh + Lây truyền dọc: truyền nguồn bệnh qua trứng (qua ph«i) Kh«ng chØ cã virus NPV, GV míi trun qua trứng, mà virus không tạo thành thể vùi (Iridoviridae) cịng cã thĨ trun qua trøng Ngoµi số trờng hợp virus xâm nhiễm trực tiếp vào dịch máu qua vết thơng thể (qua vết chọc đẻ trứng ong ký sinh, lỗ xâm nhiễm số ấu trùng ký sinh vào bên vật chủ) Trong quần thể tự nhiên côn trùng thờng quan sát thấy nhiễm bệnh hỗn hợp loài virus trở lên nh nhiễm hỗn hợp NPV GV sâu xám mùa đông NPV với CPV Tác động qua lại virus nhiễm bệnh hỗn hợp biểu kiểu: đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào tác động gây nhiễu cho Khi có tợng đồng tác động virus vật chủ làm tăng tỷ lệ chết vật chủ, rút ngắn thời gian để gây chết 50% số lợng vật chủ Điều có ý nghĩa biện pháp sinh học Hiện tợng tác động nhiễu làm giảm hiệu lực gây bệnh virus hiệu sử dụng virus trừ sâu hại trờng hợp thấp Vì vậy, sản xuất chế phẩm virus cần loại trừ virus có tác động nhiễu Chế phẩm NPV không đợc dùng quần thể tự nhiên có bệnh virus CPV, nhóm thờng có tác động nhiễu Các thể vùi virus bảo vệ virion chống lại tác động môi trờng Đây điều kiện để virus vùi tồn lâu nhiều năm tự nhiên Thí dụ, thể vùi NPV gây bệnh tằm nghệ không hoà tan cồn, axeton dung môi hữu khác, không thối thời gian bảo quản lâu dài Thể vùi đa diện cuả virus gây bệnh cho ong xẻ hại vân o sam Picea bảo tồn sức sống xác chết khô vật chủ điều kiện 4-5 C 10 năm Có thể vùi tồn lớp đất canh tác khoảng năm, số trờng hợp tới 25 năm Một số chế phẩm virus trừ sâu Quy trình sản xuất Quy trình sản xuất chế phẩm virus phòng trừ sâu hại đợc tóm tắt sơ đồ hình Nuôi sâu giống Nuôi sâu hàng loạt Chế biến thức ăn nhân tạo Nhiễm bệnh virus cho sâu - Thu sâu chết VR - Nghiền lọc - Ly tâm loại bỏ cặn bà Trộn phụ gia (chất mang, chất bám dính, chất chống thối ) Làm khô Kiểm tra chất lợng, lợng PIB/ml, thử sinh học Đóng gói chế phẩm Hình Quy trình sản xuất chế phẩm NPV dạng bét ChÕ phÈm virus trõ s©u ë ViƯt Nam hiƯn đợc nghiên cứu sản xuất nhóm virus đa điện nhân (NPV) Để sản xuất đợc virus đòi phải có lợng lớn sâu hại vật chủ chúng Do công nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu bao gồm khâu quan trọng là: công nghệ sản xuất hàng loạt sâu vật chủ trình tạo sinh khối virus Để sản xuất số lợng lớn sâu vật chủ ngời ta đà tiến hành nghiên cứu chế tạo thức ăn cho sâu vật chủ Trên sở nghiên cứu môi trờng thức ăn nuôi sâu bán tổng hợp nhà khoa học Việt Nam đà xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất hàng loạt sâu vật chủ tạo chế phẩm virus phòng trừ số sâu hại nh sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng Virus đợc nhiễm vào thể sâu vật chủ phát triển đến đạt sinh khối lớn ngời ta tiến hành giết sâu vật chủ xử lý sinh khối virus Sản phẩm tạo chế phẩm dạng nớc dạng bột khô 3.2 Các tiêu chất lợng chế phẩm NPV dạng bột Chế phẩm NPV cần bảo đảm yêu cầu kỹ thuật thể bảng 12 Bảng 12: Yêu cầu chất lợng NPV TT Các tiêu Đơn vị tính Kích thớc hạt 78àm Độ thuỷ phần 7% Độ bám dính đồng Độ pH L−ỵng PIB/mg chÕ phÈm 85 - 90% 1,5 × 107 2.3 Mét sè chÕ phÈm NPV + Chế phẩm Virus NPV sâu xanh sản xuất theo quy trình công nghệ đợc thử nghiệm áp dụng đồng ruộng trừ sâu xanh thuốc Sơn La, Hà Nội, Đồng Nai, Sông Bé, Ninh Thuận, v.v cho kết phòng trừ tốt bảo vệ đợc suất trồng Chế phẩm virus sâu xanh với OMĐ tác nhân sinh học quan trọng hệ thống phòng trừ tổng hợp (PTTH) sâu hại Chế phẩm có giá thành cao ngời nông dân cha quen sử dụng nên phạm vi áp dụng hạn chế + Chế phẩm Virus NPV sâu đo xanh đay: Cho đến cha tìm đợc môi trờng thức ăn nhân tạo nuôi sâu Do để có sâu vật chủ nhân virus phải nuôi thức ăn tự nhiên Vì vậy, chế phẩm virus sâu đo đay đợc sản xuất phơng pháp thủ công nh sau: dùng nguồn NPV sâu đo đay phun lên đồng đay nơi có nhiều sâu, thu gom sâu chết bệnh lại để nghiền lọc lấy dịch virus Sau lại đem phun lên đồng ®ay Cø nh− vËy cã thĨ t¹o chÕ phÈm virus chỗ để trừ sâu đo đay Việc sản xuất sử dụng chế phẩm virus sâu đo đay chỗ biện pháp có triển vọng rẻ tiền, có hiệu kinh tế nên ngời nông dân vùng trồng đay chấp nhận đợc + Chế phẩm virus NPV sâu róm thông: Chế phẩm virus phòng trừ sâu róm thông phơng pháp thủ công nh sản xuất chế phẩm virus sâu đo xanh đay Hiệu diệt sâu róm thông chế phẩm virus đạt 55,2 - 83,3% Chế phẩm đợc áp dụng thành công trừ sâu róm thông Thanh Hoá Sử dụng chế phẩm virus sâu róm thông đà hạn chế sử dụng thuốc hoá học tỷ lệ ký sinh tự nhiên số ong ký sinh sâu róm thông tăng lên Ngoài chế phẩm kể có chế phẩm virus NPV sâu keo da láng đợc sản xuất theo phơng pháp thủ công Chế phẩm đợc sử dụng rộng rÃi Ninh Thuận, Lâm Đồng mang lại hiệu kinh tế xà hội cao II Vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng chuột Khái quát chung vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng chuột Vi khuẩn có khắp nơi trái đất, xâm nhập vào tất phần thể sinh vật nói chung côn trùng nói riêng Chúng khoang miệng, ruột, hệ thống hô hấp, quan sinh dơc, Vi khn cã quan hƯ víi c«n trùng đa dạng đợc chia thành nhóm vi khuẩn hình thành bào tử không hình thành bào tử Vi khuẩn hình thành bào tử bao gồm tất vi khuẩn gây bệnh bắt buộc phần lớn loài gây bệnh không bắt buộc Phần lớn loài gây bệnh không bắt buộc có (hoặc tạo thành) tinh thể độc Vi khuẩn không hình thành bào tử bao gồm loài gây bệnh hoàn toàn không bắt buộc tất loài vi khuẩn có tiềm gây bệnh cho côn trùng Những vi khuẩn gây bệnh bắt buộc vi khuẩn liên quan với loại bệnh định côn trùng Trong tự nhiên, vi khuẩn gây bệnh bắt buộc thờng thích nghi víi mét phỉ ký chđ hĐp Vi khn g©y bệnh không bắt buộc làm tổn hại xâm nhiễm vào mô thể côn trùng mẫn cảm với chúng, nhng xếp chúng vào nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc Trớc xâm nhập vào xoang máu vi khuẩn gây bệnh không bắt buộc thờng sinh sản ruột côn trùng Vi khuẩn có tiềm gây bệnh, bình thờng không sinh sản ruột côn trùng, nhng chúng xâm nhập vào xoang máu Những vi khuẩn phát triển đợc môi trờng thức ăn nhân tạo, không chuyên tính với nhóm côn trùng riêng biệt Vi khuẩn sử dụng BPSH trừ dịch hại thuộc Eubacteriales, đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae, Microccaceae, Bacillaceae sè gièng thuéc hä Pseudomonadeceae (bé Pseudomonadales) Hä Pseudomonadeceae gåm loại vi khuẩn hình que, gram âm, không hình thành bào tử Các loài Pseudomonas aeruginosa, P chlororaphis, P fluorescens, vi khuẩn có tiềm gây bệnh cho côn trùng Họ Enterobacteriaceae gồm loài vi khuẩn sống ruột côn trùng Chúng có dạng hình que, gram âm, không hình thành bào tử Phát triển tốt môi trờng dinh dỡng bình thờng Vi khuẩn thuộc họ có loài ký sinh bắt buộc, không bắt buộc hoại sinh Họ Bacillaceae gồm vi khuẩn hình thành bào tử, gram dơng, hình que Có ý nghĩa BPSH loài thuộc giống Bacillus, Clostridium Một số vi khuẩn đợc nghiên cứu ứng dụng phòng chống côn trùng chuột hại 2.1 Vi khuẩn Coccobacillus acridiorum Đây vi khuẩn gây bệnh cho côn trùng đợc D' Herelle nghiên cứu mô tả vào năm 1911 Mexico Vi khuẩn có dạng hình que nhỏ, gram âm đợc gọi tên ban đầu C acridiorum gây bệnh nhiễm trùng máu cho châu chấu, phát triển môi trờng nhân tạo Sản phẩm từ vi khuẩn Coccobacillus acridiorum đợc áp dụng tơng đối thành công Mexico, Colombia, Argentia Theo hệ thống phân loại đại vi khuẩn cã thĨ lµ loµi Enterobacter cloacae var acridiorum 2.2 Vi khuẩn gây bệnh sữa cho ấu trùng bọ Bệnh sữa đợc phát ấu trùng bọ Nhật Bản Popillia japonica từ năm 1921 gồm dạng dạng A B Vi khuẩn gây nên dạng bệnh đợc mô tả với tên Bacillus popolliae (dạng bệnh A) B lentimormus (dạng bệnh B) Trong loài vi khuẩn loài B popolliae phổ biến chiếm 88% trờng hợp đợc ý nghiên cứu Loài B popolliae vi khuẩn ký sinh bắt buộc, gram dơng; bào tử có tính kháng cao với điều kiện bất lợi môi trờng, lây nhiễm bệnh cho bọ qua đờng tiêu hoá Sau xâm nhập vào vật chủ 3-4 ngày vi khuẩn bắt đầu sinh bào tử, tới ngày thứ 13-16 bào tử vi khuẩn đạt tới mức tối đa Trên môi trờng thức ăn nhân tạo vi khuẩn không hình thành bào tử, phải nuôi nhân vi khuẩn ấu trùng bọ Nhật Bản Sau 20 ngày ủ bệnh, mét Êu trïng bä NhËt B¶n tÝch l tíi 20 tỷ bào tử Từ sâu bị bệnh gom vi khuẩn sản xuất thành chế phẩm dạng bột chứa 100 triệu bào tử gam chÕ phÈm 2.3 Vi khuÈn Bacillus cereus Lµ vi khuÈn phổ biến tự nhiên, gram dơng, hình thành bào tử nhng không tạo thành tinh thể độc Tính gây bệnh cho côn trùng vi khuẩn khác Ngời ta cho tính gây bệnh B.cereus chủ yếu liên quan tới tạo thành men photpholipaza loại ngoại độc tố nh Bacillus thuringiensis 2.4 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis Đây vi khuẩn gây bệnh côn trùng quan trọng đợc nghiên cứu sử dụng rộng rÃi để trừ nhiều sâu hại giới Vi khuẩn B thuringiensis hình que, gram dơng, hình thành bào tử tinh thể độc tố Tính độc hay tính diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis phụ thuộc vào độc tố vi khuẩn sinh trình sinh trởng phát triển chúng Theo Kreig, Langenbrusch (1981) có gần 525 loài thuộc 13 côn trùng đà ghi nhận bị nhiễm vi khuẩn B thuringiensis, nhiều cánh vảy (có 318 loài), sau hai cánh (59 loài), cánh màng (57 loài), cánh cứng (34 loài); khác có từ 1-12 loài bị nhiễm vi khuẩn B thuringiensis sinh loại độc tố, là: Ngoại độc tố (-exotoxin), ngoại độc tố (exotoxin), ngoại độc tố (γ-exotoxin), néi ®éc tè δ (δ - endotoxin) Trong loại độc tố này, ngời ta ý nhiều đến nội độc tố định hoạt tính diệt côn trùng vi khuẩn + Ngoại độc tố alpha ( - exotoxin) (phospholipaza C) Năm 1953, lần Toumanoff phát thấy vi khuẩn B.t var elesti sản sinh enzyme lexithinaza Tác động độc enzyme liên quan đến phân huỷ mang tính cảm ứng Phospholipit mô côn trùng, làm côn trùng bị chết Enzyme liên kết với tế bào ruột côn trùng, sau tách đợc hoạt hoá chất không bền nhiệt Chất có trọng lợng phân tử thấp, lipit Độc tố đặc biệt có tác động với loài ong xẻ (Tenthre dimidae) có pH đờng ruột phù hợp với tác động enzyme đà phát chất xác định men Lexithinaza C (Còn gọi phospholipaza C) Nhiều nghiên cứu đà chứng minh liên quan men với hoạt tính trừ sâu đà cho biết men tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào thể côn trùng Ngoại độc tố alpha hoà tan nớc, không bền vững nhiệt độ cao, gọi ngoại độc tố không chịu nhiệt + Ngoại độc tố beta ( - exotoxin): Độc tố đợc Halt Arkawwa (1959) tìm nuôi ấu trùng ruồi nhà thức ăn có chứa B thuringiensis Độc tố tách đợc từ môi trờng nuôi cấy B thuringiensis Thành phần ngoại độc tố beta gåm adenin, riboza vµ phospho víi tû lƯ 1:1:1 Ngoại độc tố beta hoà tan nớc, bền vững nhiệt độ cao, chịu đợc nhiệt ®é 120-121oC 10 - 15 phót, v× thÕ gäi ngoại độc tố chịu nhiệt Ngoại độc tố beta gọi Thuringiensis Không phải tất chủng tạo thành ngoại độc tố beta Một số B.t không sinh tinh thể độc nhng sinh ngoại độc tố Hoạt tính ngoại độc tố bắt đầu xuất giai đoạn vi khuẩn phát triển mạnh, trớc hình thành bào tử Ngoại độc tố Nucleotit có trọng lợng phân tư thÊp (707-850), cã c¸c adenin, riboza, phospho víi tû lệ Tác động độc kìm hÃm nucleotidaza ARN- polymeraza phụ thuộc ADN, enzyme gắn với ATP dẫn tới việc ngừng tổng hợp ARNt Ngoại độc tố có tác dụng céng h−ëng víi néi ®éc tè δ, sau néi độc tố có tác dụng gây giập vỡ, phá huỷ hoàn toàn biểu mô ruột côn trùng mẫn cảm, ngoại độc tố nhanh chóng xâm nhập vào huyết tơng máu, tới quan gây thay đổi sinh lý dẫn tới chết nhanh ấu trùng Ngoại độc tố có hiệu việc chống sâu non côn trùng mẫn cảm Nó gây trì trệ việc chuyển hoá lột xác có tác động trởng thành phát triển từ ấu trùng đà ăn phải độc tố dới ngỡng gây chết + Nội độc tố( - endotoxin): Nội độc tố dạng tinh thể chứa vi khuẩn với bào tử vi khuẩn Mỗi tế bào vi khuẩn hình thành bào tử đầu tinh thể nội độc tố đầu Sau thành tế bào vi khuẩn tiêu huỷ tinh thể độc tố bào tử đợc tự môi trờng nuôi cấy lắng đọng với Trong trình hình thành bào tử tinh thể nội độc tố đợc hình thành Sự hình thành tinh thể nội độc tố liên quan với hình thành bào tử giai đoạn đầu trình sinh bào tử Sau việc hình thành bào tử tinh thể nội độc tố xảy ®éc lËp víi (Nishimura, Nichiisutsuji - Uwo, 1980) Những kết nghiên cứu gần Rn Gaixin, Feng Xichang Feng Weixiong (1983) cho thấy tinh thể nội độc tố khác hình dạng theo hình dạng chia chúng thành loại sau: dạng nhị tháp, dạng hình cầu, dạng hình vuông, dạng không ổn định dạng hình lõm Còn Tôan thông báo vi khuẩn B.thuringiensis var Kurstaki tạo thành dạng tinh thể dạng nhị tháp dạng hình lập phơng (Kandybin, 1989) Tinh thể nội độc tố delta không khác hình dạng khác phân tử lợng Theo phân tử lợng, tinh thể chia thành nhóm: nhóm có phân tử lợng 140.000 160.000; 60.000 - 130.000 40.000 - 50.000 * Cơ chế tác động vi khuẩn B thuringiensis lên côn trùng: Tác động diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis tổng hợp Theo đặc điểm cách xâm nhiễm gây tổn thơng cho côn trùng xếp B thuringiensis thuộc nhóm vi sinh vật có tác động đờng ruột Đờng nhiễm trùng quan tiêu hoá Chỗ phá huỷ vi khuẩn ruột côn trùng Yếu tố gây chết sâu có chế phẩm B thuringiensis tinh thể nội độc tố delta Các tinh thể nội độc tố đợc côn trùng ăn với thức ăn Trong ruột côn trùng, dới tác ®éng cđa hƯ men c¸c tinh thĨ néi ®éc tè đợc phân giải sinh độc tố Thành phần độc tố đợc tạo thành ruột côn trùng phụ thuộc vào men dịch ruột côn trùng Bộ men không giống loài côn trùng khác Do đó, có khác tính mẫn cảm loài côn trùng với dòng vi khuẩn B thuringiensis Với phân huỷ tinh thể nội độc tố tạo thành độc tố độc tố tác động lên màng bao chất dinh dỡng biểu mô ruột trình bệnh lý bắt đầu Các tế bào biểu mô bắt đầu trơng trở nên mủn Đầu tiên tế bào hình trụ bị tổn thơng Những thay đổi màng tế bào ghi nhận đợc 15 phút sau côn trùng ăn phải thức ¨n cã vi khuÈn B thuringiensis Sau 2-3 giê tế bào hình trụ, hình chén đà tạo thành vết nứt, tế bào bị nhăn nheo vỡ Sự phá vỡ trao đổi chất tế bào biểu mô ruột dẫn đến ion lọt từ khoang ruột sang dịch máu Chứng liệt chết xảy không cân ion dịch máu Đồng thời bào tử vi khuẩn từ ruột xâm nhiễm vào dịch máu sinh sản nhanh gây nhiễm trùng máu Đối với côn trùng có tính mÉn c¶m cao víi B thuringiensis nh− t»m (Bombyx mori) bào tử đóng vai trò nhỏ bé vai trò tác động B thuringiensis lên côn trùng Bởi trờng hợp không đủ thời gian để bào tử mọc mầm xâm nhiễm côn trùng đà chết nội độc tố (Sundara Babu, 1985) 2.5 Vi khuẩn Serratia marcescens Đây vi khuẩn hình que, gram âm, không hình thành bào tử, ký sinh không bắt buộc côn trùng Tính gây bệnh cho côn trùng vi khuẩn đợc ghi nhận tài liệu từ năm 1886 (Masera, 1936) Vi khuẩn S marcescens đà gây dịch cho bọ Melolontha melolontha, tằm đợc sử dụng thành công trừ sâu đục thân ngô Vi khuẩn có tính gây bƯnh cao cho ch©u chÊu Melanoplus bivittatus, mét sè rƯp sáp Pseudococcus, sâu non Pieris brassicae, Lymantria dispar, Euproctis chrysorrhoea, Agrotis segertum, bä xÝt Eurygaster 2.6 Vi khuÈn Salmonella enteridis Đây vi khuẩn gây bệnh thơng hàn chuột số loài gặm nhấm khác Vi khuẩn S enteridis ký sinh bắt buộc, gram âm, không hình thành bào tử Vi khuẩn S enteridis phân lập đợc từ xác chết chuột trận dịch từ năm 1893 đến 1897 Nga năm 1893 Pháp Năm 1950, Prokhorov đà phân lập đợc chủng gây bệnh cho chuột, ký hiệu No5170 Vi khn nµy cã tÝnh chän läc rÊt cao thĨ với loài gậm nhấm, chúng không nguy hiểm cho ngời động vật nuôi nhà (ngựa, trâu bò, lợn, gà, vịt, ngỗng, chó, mèo ) Tính ®éc cđa vi khn S enteridis thay ®ỉi liªn tục cấy truyền môi trờng thức ăn nhân tạo nh bảo quản dài hạn môi trờng Đặc biệt tính độc giảm nhanh môi trờng bị acid hoá Một số chế phẩm vi khuẩn phòng trừ sâu bệnh 3.1 Chế phẩm B.t Sản xuất Bt đợc thực hai phơng pháp lên men chìm lên men xốp Trong công nghệ lên men xốp thờng dùng hạt chất rắn, khả hấp thụ chất dinh dỡng bề mặt Các hạt chất rắn đóng vai trò nguồn chất dinh dỡng, ví dụ: cám lúa mỳ, bột ngô, bánh hạt loại dầu đơn giản đóng vai trò nh chất mang vô Sản xuất Bt quy mô lớn phơng pháp lên men xốp thờng gặp nhiều khó khăn nh cung cấp khí cho môi trờng, ngăn chặn tạp nhiễm, điều chỉnh lên men thu hoạch Phơng pháp lên men xốp thờng có sản lợng thấp so với lên men chìm phơng pháp thực tế để sản xuất chế phẩm thơng mại Trong phơng pháp lên men chìm, việc nghiên cứu tìm môi trờng dinh dỡng tối u cần thiết Việc sản sinh nội độc tố vi khuẩn thay đổi theo serotyp mà phụ thuộc vào môi trờng nuôi cấy Có chủng phù hợp với loại môi trờng này, cho hoạt tính cao, nhng chủng khác nuôi cấy môi trờng lại cho hoạt tính thấp Vì việc tìm kiếm môi trờng dinh dỡng tối u chất tăng cờng trình trao đổi chất ngời ta phải quan tâm tới thông số trình lên men: nhiệt độ, pH, độ oxy hoà tan, tốc độ thông khí để xác định thời gian thu hoạch tối u Một số nghiên cøu cho biÕt vi khn Bt bÞ thùc khn thĨ (Bacteriophage) xâm nhiễm làm hỏng mẻ cấy, phá huỷ tế bào sinh trởng mạnh Hậu chế phÈm diƯt c«n trïng cã hiƯu st thÊp Sinh khèi (bào tử tinh thể độc) tạo trình lên men đợc tách nhờ ly tâm, đợc làm khô phơng pháp lạnh đông ly tâm vắt Cuối cùng, sản phẩm đợc đóng thành gói sau đà trộn với chất phụ gia khác Đối với chế phẩm dạng bột khô (tiện lợi phổ biến nhất) dùng chất độn nh tinh bột, lactoza, hoạt thạch, cao lanh Để tăng thêm ®é dÝnh cña chÕ phÈm, ng−êi ta dïng mét sè chÊt nh− bét mú, dextrin, cazein ChÕ phÈm Bt dạng sữa nh thuốc sữa Thuricide 90 TS ổn định bền lâu Trong trình sản xuất tách bào tử tinh thể (ly tâm sinh khối) không cần sấy khô mà đa vào nhũ tơng (nớc chứa dầu) Ngoài phơng pháp ly tâm, ngời ta dùng phơng pháp acid hoá dịch nuôi đến pH 6,0 6,2, sau chuyển sang giai đoạn tách Sau tách nhận đợc dạng bột nhÃo độ ẩm 85% với hiệu suất 100kg/m3 dịch nuôi với lợng bào tử 20.103/g Dịch nuôi cấy đà tách vi khuẩn sử dụng lại lần nữa, nhng không lặp lại nhiều lần tích luỹ nhiỊu chÊt øc chÕ sinh tr−ëng, nhiªn cã thĨ dùng làm nguyên liệu sản xuất nấm men chăn nuôi Điều đảm bảo việc rút gọn khối lợng trình công nghiệp, giảm lợng nớc thải, tăng giá trị kinh tế trình Giai đoạn cuối tách để giải phóng bào tử tinh thể khỏi màng tế bào, ngời ta đa vào thiết bị đặc biệt, chuyên dùng, trộn với bột nhÃo 30 phút để trộn cho bào tử tinh thể đồng Sau đa bột nhÃo vào sản xuất chế phẩm, thành phẩm dạng bột nhÃo dạng khô Để sản xuất loại nhÃo ngời ta trộn sinh khối bào tử tinh thể độc với CMC (Cacboxymetyl celulose), phân tử CMC hấp thụ tinh thể bào tử Sản phẩm dạng dung dịch nhớt, không làm cho bào tử chết Sản xuất dạng có tính u việt nh giảm lợng thời gian để tiến hành sấy Dạng khô đợc sấy máy sấy phun đều, độ ẩm 10% trộn với cao lanh Tổng số bào tử tinh thể độc liên quan đến hoạt tính diệt côn trùng Do phơng pháp tiến hành đếm số lợng bào tử sống chế phẩm Bt., so sánh số lợng bào tử với hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm sinh học Số lợng nội độc tố đợc xác định biểu thị đơn vị quốc tế (IU) dựa tiêu chuẩn quốc tế E-61 Nghiên cứu thuốc trừ sâu vi sinh vật Bt đợc bắt đầu gần nớc phát triển, nơi mà việc sử dụng Bt so với thuốc trừ sâu hoá học Mặc dù việc sử dụng Bt hầu hết nớc phát triển phụ thuộc vào việc nhập khẩu, nhiên số nớc đà nghiên cứu sản xt Bt cđa hä: Trung Qc vµ Ai CËp lµ hai nớc tiên phong việc Ai Cập ngời ta đà tiến hành ghép gen sinh độc tố vào vi khuẩn cố định đạm sản phẩm tạo vừa có khả diệt trừ Spodoptera littoralis vừa có khả cố định nitơ Sản xuất Bt Ai Cập đợc tổ chức quy mô pilot nồi lên men với dung tích 5m3 đặt nhà máy đờng rợu Hwandia, Giza Trung Quốc sản xuất quy mô lớn đợc thực hai phơng pháp lên men chìm thùng lên men xốp Cám lúa mì, bột ngô, đậu tơng, bánh hạt loại dầu, cám lạc thành phần môi trờng sử dụng sản xuất Bt Trong nhà máy nhỏ Hồ Bắc, sản lợng Bt tăng từ 26 năm 1983 đến 90 năm 1984, 160 năm 1985, 260 năm 1986, 360 năm 1987, 472 năm 1988, 732 năm 1989 đến 900 năm 1990 Bt ngày đợc sử dụng rộng rÃi 30 tỉnh để diệt trừ côn trùng gây dịch khác cho nông nghiệp công nghiệp, diệt trừ nhân tố gây bệnh cho ngời Tổng sản lợng Bt ớc tính năm 1990 1.500 tấn, phần sản phẩm Bt địa phơng đợc xuất sang Thái Lan Đông Nam Trung Quốc, Bt đợc sản xuất hàng loạt với phơng pháp đơn giản thích hợp cho nông dân số công nghệ đà trở nên phổ biến Hơn triệu hecta đà canh tác đợc bảo vệ b»ng thc trõ s©u vi sinh Bt ViƯc sư dơng Bt nớc phát triển bị hạn chế lý kinh tế, ngời ta muốn sản xuất Bt địa phơng với giá thành thấp, nhng hoạt tính diệt sâu cao Các môi trờng lên men khác gồm sản phẩm phụ công nghiệp nông nghiệp đà đợc sử dụng để sản xuất Bt số nớc phát triển nh Mehicô, Hàn Quốc, Nigeria, Brazin ấn Độ Bảng 14: Thành phần môi trờng lên men đợc sử dụng để sản xuất Bacillus thuringiensis số nớc phát triển (Salama, 1993) Tên nớc Thành phần môi trờng Tác giả Mêhicô Rỉ đờng, bột đậu tơng, bột ngô, CaCO3 + H2O Roldan Cs, 1998 Hàn Quốc Bột cá, đậu tơng, cám đỏ, bà vừng, gạo, cám Yoon Cs, 1987 Trung Quốc Cám lúa mỳ, trấu, bột chanh, bánh đậu tơng loại dầu bánh hạt loại dầu, cám lúa mỳ bột ngô Hussey, 1981 - Wang Tao, 1998 Nigieria Bột sắn lên men, ngô, đậu đũa Ejiofar & Okager,1989 Brazil Phụ phẩm công nghiệp giấy gỗ thêm tinh bột tan Moscardi,1988 ấn Độ Bột chanh bột đậu tơng thêm tinh bột tan rỉ đờng Mummgatti Raghunathan, 1990 Từ năm 1970 Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất Bt Viện Công nghiệp thực phẩm, Viện bảo vệ thực vật, Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Trung tâm vi sinh, Tổng công ty hoá chất sản xuất loại chế phẩm quy mô công nghiệp với chủng Bacillus thuringiensis var Kurstaki Bớc đầu chế phẩm Bt đà đợc đa vào sử dụng trừ số sâu hại nh sâu tơ, sâu xanh b−ím tr¾ng, v.v 3.2 ChÕ phÈm vi sinh vËt phßng trõ cht ChÕ phÈm vi sinh vËt diƯt cht Liên Xô (cũ) Bacterodensid sản phẩm đợc sản xt tõ vi khn Salmonella enteriditis Isatchenko cã t¸c dơng gây bệnh làm chết loại chuột nhà, chuột ®ång, cht cèng, cht ®en ChÕ phÈm ®· ®−ỵc sử dụng rộng rÃi Liên Xô (cũ), Mông Cổ Cu Ba, mang lại hiệu phòng trừ chuột cao Tại Việt Nam chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột mang tên BIORAT (công ty BIOFARM - Cu Ba), MIROCA (ViƯn Khoa häc kü tht n«ng nghiƯp ViƯt Nam), B¶ diƯt cht sinh häc (ViƯn B¶o vƯ thùc vật) đà đợc thử nghiệm đối tợng chuột Việt Nam Kết cho thấy chế phẩm có tác dụng tốt việc gây ốm làm chết loại chuột, lại không gây ảnh hởng xấu đến gia súc, gia cầm Sản phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột đà đợc đăng ký vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật đợc phép sử dụng Việt Nam đợc ứng dụng rộng rÃi nhiều địa phơng nớc Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột đợc tóm tắt h×nh 10 Chđng VSV KiĨm tra KiĨm tra ChÊt mang Nhân giống cấp I Xử lý Nhân giống sản xuất Đóng gói Sinh khối VSV Tiệt trùng Tiêm dịch vào chất nhiễm ủ sinh khối Kiểm tra chất lợng Bảo quản sử dụng Hình 10 Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột Các công đoạn việc sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ chuột bao gồm: + Tuyển chọn b¶o qu¶n chđng gièng vi khn: Tõ mÉu bƯnh tÝch chuột ăn chế phẩm vi khuẩn đợc phân lập theo theo sơ đồ hình 11 Mẫu bệnh tích (Máu, ruột non, ruột già, gan, tuỵ) Làm giàu môi trờng Rapoport cải tiến Nuôi cấy môi trờng thị Nuôi cấy môi trờng dinh dỡng Kiểm tra đặc điểm huyết Kiển tra đặc điểm sinh hoá Đánh giá hoạt tính chuột sống Bảo quản lu giữ Hình 11 Sơ đồ phân lập tuyển chọn vi khn g©y bƯnh cho cht Vi khn sau phân lập bảo quản thạch nghiêng dới điều kiện lạnh thời gian 3-4 tuần, bảo quản môi trờng lòng trứng trắng điều kiện lạnh thời gian 6-12 tháng bảo quản điều kiện đông khô thời gian 3-5 năm Để trì hoạt tính vi khuẩn cần thiết phải thờng xuyên đa vi khuẩn vào thể chuột tái ph©n lËp tõ mÉu bƯnh tÝch + Nh©n sinh khèi vi khuẩn Điều kiện nhân sinh khối S enteriditis Isatchenko đợc xác định : Môi trờng nuôi cấy: nớc chiết ®Ëu 20% + 3g pepton NhiƯt ®é nh©n sinh khèi: 30- 32oC pH môi trờng: 7,0 Thời gian nhân sinh khối: 36 - 48h Mức độ cấp khí: lít/phút/bình 20 lít môi trờng Sau thời gian lên men 36 mật độ vi khuẩn đạt 109 ữ 1010 vi khuẩn/ml + Lựa chọn tạo chất mang phù hợp Chất mang cho chế phẩm phải bảo đảm cho vi khuẩn tồn tốt, không gây ảnh hởng xấu đến môi trờng sử dụng phải nguồn thức ăn mà chuột a thích Tại Liên Xô (cũ) chất mang đợc lựa chọn hạt mạch cho chế phẩm dạng hạt bột xơng cho chế phẩm dạng bột Tại Việt Nam, qua trình nghiên cứu: thóc đồ đợc lựa chọn nguyên liệu làm chất mang cho chế phẩm Thóc đồ có u điểm: sẵn có, dễ chế biến, có sức hấp dẫn chuột cao, bảo đảm cho vi khuẩn sinh trởng phát triển tốt tồn thời gian dài Sản phẩm tạo từ thóc đồ bảo đảm mật độ 109 CFU/g sau tháng sản xuất III nấm gây bệnh côn trùng Khái quát chung nấm gây bệnh cho côn trùng Cũng nh vi khuẩn, nhiều loại nấm có quan hệ cộng sinh hoại sinh với côn trùng, có nhiều loài nấm thực ký sinh, gây tợng bệnh lý dẫn đến huỷ diệt côn trùng Nấm gây bệnh cho côn trùng có ý nghĩa lớn gây chết thờng xuyên với tỷ lệ chết cao cho nhiều loài côn trùng hại tác nhân điều hoà tự nhiên hiệu Côn trùng chÕt nÊm rÊt dƠ nhËn biÕt b»ng m¾t th−êng, sợi nấm mọc qua vỏ thể bao phủ toàn bề mặt thể côn trùng Cơ thể côn trùng bị chết nấm không bị tan rÃ, mà thờng giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bên thể chứa đầy sợi nấm Hầu hết các loại nấm gây bệnh cho côn trùng xâm nhập vào thể vật chủ không qua đờng miệng, mà qua lớp vỏ thể, nghĩa phải có tiếp xúc nguồn nấm với bề mặt thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt thể vật chủ, điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm xâm nhiễm vào bên thể côn trùng qua lớp chitin nhờ áp lực giới hoạt động men nấm Nấm tiết loại men làm mềm lớp vỏ chitin tạo thành lỗ thủng nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng mầm bào tử xâm nhập vào bên thể côn trùng Do khả xâm nhập vào bên thể côn trùng qua lớp vỏ thể nên nấm ký sinh đợc côn trùng chích hút pha phát triển côn trùng nh trứng, nhộng mà vi sinh vật khác không ký sinh đợc Nấm xâm nhập vào bên thể côn trùng qua đờng miệng Từ miệng, bào tử tới ruột qua thành ruột xâm nhiễm vào tế bào nội quan để gây bệnh Xâm nhập kiểu chủ yếu bào tử loài nấm nớc Dới tác động độc tố bµo tư nÊm tiÕt cã thĨ dÉn tíi tợng ngừng nhu động ruột vật chủ Thí dụ, trờng hợp bào tử nấm Aspergillus ruột ong mật Bào tử nấm xâm nhập qua lỗ thở quan sinh dục để vào bên thể côn trùng, nhng Sự xâm nhiễm phát triển nấm thể côn trùng trình phức tạp, gồm ba giai đoạn sau đây: + Giai đoạn xâm nhập: từ bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào xoang thể côn trùng + Giai đoạn phát triển nấm thể côn trùng đến côn trùng chết: giai đoạn sống ký sinh nấm Trong giai đoạn nấm thờng tạo nhiều sợi nấm ngắn Những sợi nấm ngắn đợc phân tán khắp thể theo dịch máu Về phía vật chủ có phản øng tù vƯ nh− sù thùc bµo, xt hiƯn tÕ bào bạch huyết Phản ứng tự vệ thời gian ngắn kìm hÃm xâm nhập nấm vào nội quan Khi sợi nấm xâm nhập vào tất phận chúng đồng thời gây chết vật chủ + Giai đoạn sinh tr−ëng ph¸t triĨn cđa nÊm sau vËt chđ chÕt: giai đoạn hoại sinh nấm ký sinh côn trùng Trong giai đoạn nấm hình thành bào tử conidi, nấm mọc thành sợi bên bề mặt thể vật chủ Sau bào tử đợc tạo thành lớp sợi nấm bề mặt thể vật chủ Các nấm gây bệnh cho côn trùng sinh trởng phát triển để hoµn thµnh mét chu kú sèng cđa chóng: tõ mäc mầm bào tử đến hình thành bào tử Nấm gây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, ký sinh vật chủ giai đoạn định vật chủ, nhiều trờng hợp chúng ký sinh có tính chuyên hoá thức ăn rộng, ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc giống, họ, khác Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thuỷ sống dới nớc đến nhóm nấm bậc cao sống cạn Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt c¶ líp nÊm: NÊm bËc thÊp Phycomycetes, nÊm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes nấm bất toàn Deuteromycetes - Líp nÊm bËc thÊp Phycomycetes: Trong líp nÊm nµy, loài ký sinh côn trùng tập trung ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales Entomophthorales Đặc biệt có họ nấm gồm tất loài ký sinh côn trùng nh Entomophthoraceae Coelomomycetaceae Những giống nÊm ký sinh c«n trïng quan träng cđa líp nÊm bËc thÊp lµ: Coelosporidum, Chytridiopsis (bé Chytridiales), Coelomonyces (bé Blastocladiales) vµ Entomophthora (bé Entomoph thorales) - Líp nÊm tói Ascomycetes: Trong lớp nấm túi có Laboulbiniales nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, loài nấm túi khác nội ký sinh côn trùng Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales) - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm giống có loài gây bệnh côn trùng Đó lµ gièng Septobasidium vµ Uredinella - Líp nÊm bÊt toµn Deuteromycetes: Phần lớn loài nấm bất toàn ký sinh côn trùng thuộc Moniliales Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicaria, Metarhizium, Cephalosporium Sorosporella chứa loài xâm nhiễm vào côn trùng đà tạo thành độc tố gây chết vật chủ khoảng thời gian định Một số nấm gây bệnh côn trùng 2.1 Nấm xanh Metarhizium anisopliae Nấm đợc Metschinikov phát vào năm 1878 bọ hại lúa mì bị bệnh Nấm xanh thờng gây bệnh cho côn trïng sèng ®Êt, thc hƯ vi sinh vËt ®Êt tù nhiªn Conidi cđa nÊm xanh sau 24 giê tiếp xúc với bề mặt thể côn trùng bắt đầu mọc mầm xâm nhập vào bên Trong thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào phận nội quan Sau vật chủ chết, sợi nấm mọc thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hồng nhạt Trên tạo thành conidi màu xanh xám Quá trình phát triển bệnh thể côn trùng lµ 4-6 ngµy t thc loµi vµ ti vËt chđ nh nguồn bệnh ban đầu Vào giai đoạn cuối trình phát triển bệnh lý côn trïng chÕt NÊm M anisopliae cã d¹ng: M anisopliae var major cã bµo tư dµi vµ M anisopliae var anisopliae có bào tử ngắn Nấm xanh sinh ®éc tè destruxin A vµ B NÊm xanh ký sinh 200 loài côn trùng, thuộc bộ: Orthoptera (11 loµi), Dermaptera (1 loµi), Hemiptera (21 loµi), Lepidoptera (27 loµi), Diptera (4 loµi), Hymenoptera (6 loµi) vµ Coloptera (134 loµi) Nấm xanh nuôi cấy môi trờng thức ăn nhân tạo Nhiều loài chi Metarhizium có khả diệt côn trùng thuộc Elaleridae Curculionidae (Coleoptera), ấu trùng muỗi Aedes aegypti Anopheles stephensi Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus (Hill) thc hä Termitidae M anisopliae víi bµo tư dạng trụ khuẩn lạc xanh đen màu tối hồng vỏ quế Khuẩn lạc mọc chậm, môi trờng OA sau 10 ngày nuôi cấy 20oC cã ®−êng kÝnh 2cm M anisopliae cã hai thø (varieties) với đặc điểm: Bào tử túi nhỏ M anisopliae var anisopliae víi kÝch th−íc bµo tư tói 3,5-(5,0) - 8,0(-9,0) ì 2,5 - 3,5 (- 4,5)àm Bào tư tói lín lµ M anisopliae var major víi bµo tử túi dài 10,0 - 14,0(-180) àm Để phân biệt hai thứ này, đà có nghiên cứu hut häc kh¸c cđa M anisopliae var anisopliae vµ M anisopliae var major, M anisopliae M anisopliae lµ chủng gây bệnh mạnh cho côn trùng thuộc Coleoptera Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaridae Curculionidae bị nhiễm bệnh M anisopliae Nấm phân bố rộng tự nhiên Đà có nhiều nghiên cứu vỊ sù ph©n bè cđa chóng: Nepal, New Zealand, New Caledonia (IMI), Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ) (IMI) nơi côn trùng phân lập đợc M anisopliae: nang Mematod (Heteroderas chachatii Globodera rostochensis), hạt đồng ®Êt trång ë Canada, ®Êt trång chuèi ë Honduras, ®Êt trồng dâu Brazil, đất đồng cỏ New Zeland (IMI) Ngay nơi có thời tiết khắc nghiệt nớc Đức, đất rừng sau đốt cháy, chất thải hữu (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích sông (IMI), đất đầm lầy trồng đớc, tổ số loài chim rễ dâu tây phân lập đợc M anisopliae Đặc điểm sinh lý, sinh hoá M anisopliae: - Không thể sinh trởng tốt chất kitin - Sống đợc nhiệt độ thấp (8oC), biên ®é cđa ®é Èm réng, ë n¬i tÝch l nhiỊu CO2 vµ thiÕu O2 chóng cã thĨ sèng sãt tíi 445 ngày Khi hoại sinh đất, bào từ dính bị ức chế nảy mầm khu hệ nấm đất, ®ã cã chđng Aeromonas (thÝ nghiƯm in vitro) - dới 10oC 35oC hình thành bào tử xảy - Nhiệt độ tốt cho nảy mầm bào tử 25 - 30oC vµ chÕt ë 49oC 10 - NhiƯt ®é tèt nhÊt cho sù sinh tr−ëng lµ 25oC vµ pH 3,3 - 8,5 - M anisopliae có khả phân giải tinh bột, celluloza kitin (lông da côn trùng) 2.2 Nấm bạch cơng Beauveria bassiana Bệnh nấm đợc nghiên cứu tơng đối sớm Cuối kû XIX ë Hoa Kú ®· dïng nÊm B bassiana để trừ loại bọ xít cánh trắng Nấm B bassiana có đất nấm M anisopliae Sau tiếp xúc với bề mặt thể vật chủ, conidi nấm B bassiana bắt đầu mọc mầm xâm nhập vào bên thể vật chủ Quá trình sau vật chủ bị nhiễm conidi khoảng 10 kéo dài vài ngày Sau xâm nhập vào thể vật chủ, nấm bắt đầu sinh trởng phát triển Nấm tiêu diệt dần tế bào bạch huyết bị công giai đoạn đầu xâm nhiễm thể ký chủ Khi nấm tiêu diệt hết tế bào bạch huyết côn trùng vật chủ chết Nấm tiếp tục sinh trởng phát triển Lợng sợi nấm bên thể vật chủ ngày tăng xác côn trùng trở nên rắn lại Khi gặp độ ẩm thuận lợi, sợi nấm mọc bề mặt thể vật chủ tạo thành conidi Côn trùng bị nhiễm B bassiana điều kiện 25oC chÕt sau -7 ngµy NÊm B bassiana tiÕt ®éc tè Beauvericin NÊm B bassiana cã phỉ ký chđ rộng Chỉ riêng vùng Bắc châu Mỹ đà ghi nhận đợc 175 loài côn trùng ký chủ nấm Nấm B bassiana nuôi cấy môi trờng thức ăn nhân tạo 2.3 Nấm châu chấu Entomophaga grylli Nấm E grylli chuyên tính loài ch©u chÊu, cã ý nghÜa thùc tiƠn rÊt lín Sau dịch nấm gây ra, quần thể châu chấu giảm 80 - 90% Nó gây thành dịch lớn cho nhiều loài côn trùng cánh thẳng Trong trình phát triển bệnh, nấm E grylli phân huỷ toàn mô thể vật chủ Sợi nấm xâm nhập vào tất phận, kể chân côn trùng, trừ trứng buồng trứng không bị nấm xâm nhập Châu chấu bị bệnh thờng bò lên phía cỏ bám chết với t đầu hớng lên phía Xác chết tồn cỏ lâu Sau côn trùng chết, bề mặt xác chết tạo thành conidi Châu chấu khoẻ tụ tập quanh xác chết sau đêm bị nhiễm conidi nấm Nấm E grylli khó nuôi cấy quy mô lớn, loài nấm Entomophaga nói chung không nuôi cấy môi trờng thức ăn nhân tạo, mà nuôi cấy qua vật chủ sống Các conidi nấm tồn lâu điều kiện tự nhiên Quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu hại từ nấm 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng giống nấm Môi trờng phân lập tuyển chọn nấm thờng chứa: glucoza, pepton, oxagall, chloramphenicol actidione Các chất kháng sinh đợc bổ sung vào môi trờng nhằm ức chế vi khuẩn Để bào tử đợc hình thành tốt nhất, nguồn cacbon phù hợp saccaro asparagin glyxin Trong sản xuất công nghiệp ngời ta chọn môi trờng chứa glucoza saccaroza có bổ sung cao ngô, cao men hay cao đậu tơng Tỷ lệ C/N đợc coi tối u đạt 10/1 3.2 Các phơng pháp lên men a) Lên men chìm: Bằng phơng pháp lên men chìm dễ dàng thu đợc sinh khối, bào tử, tinh thể độc sản phẩm khác nh chất kháng sinh, độc tố dạng hòa tan môi trờng dinh dỡng vi sinh vật diệt sâu hại côn trùng gây hại Lên men chìm thu đợc nhiều sản phẩm Đồng thời việc sản xuất phơng pháp lên men chìm dễ áp dụng khí hoá, tự động hóa, diện tích mặt không lớn ống giống nuôi 5-7 ngày Nhân giống bình 250ml máy lắc 200 vg/phút nhiệt ®é 28- 30oC, 24 giê Lªn men hƯ thống tự động khoảng 7- lít môi trờng khuấy 550 vg/ to = 28 - 30oC, 72 Ly tâm lạnh 3000 vg/phút 40 phút Sinh khối + chất phụ gia Sấy khô, đóng bao nhÃn, bảo quản - 100C kiểm tra chất lợng - sử dụng Hình 12 Quy trình lên men chìm tạo chế phẩm nấm diệt sâu Nấm nuôi ống thạch nghiêng hay đĩa petri -10 ngày ỏ nhiệt độ 28-30oC Bột bào tử túi Môi trờng dịch nấu sôi 100oC 30' Các chậu thủy tinh lớn có lớp dịch môi trờng - 1,5cm Chậu sấy 100oC,30 phút Nuôi 12 ngày, toC = 25 - 30oC ThÊm cho r¸o n−íc + chÊt phơ gia NghiỊn nhá Sấy khô 30 - 35oC, ngày Đóng bao nhÃn, kiểm tra chất lợng Bảo quản - 10oC sử dụng Hình 13 Quy trình lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm diệt sâu côn trùng có hại b) Lên men bề mặt không vô trùng: Trong điều kiện thiếu trang thiết bị ngời ta lên men bề mặt không vô trùng để thu đợc chế phẩm diệt sâu côn trùng có hại từ số chủng nấm Nhằm h¹n chÕ sù nhiƠm t¹p cđa vi sinh vËt l¹ trình nuôi cấy, môi trờng nuôi cấy đợc ®un s«i ë 100oC 30 phót, sau m«i tr−êng ngi, ng−êi ta bỉ sung kh¸ng sinh (Streptomycin) víi nồng độ 0,01% (hình 13) c) Lên men xốp: Có thể sử dụng phơng pháp lên men xốp tạo chế phẩm vi sinh vật diệt sâu, côn trùng có hại từ vi nấm, sau bổ sung dịch dinh dỡng vào chất lựa chọn khác nh bột đậu nành, bà đậu phụ, cám, gạo, lúa, mày ngô, ngời ta tiến hành nhiễm giống nấm cho lên men Khi sinh khối nấm đạt cực đại tiến hành thu hồi sinh khối, xử lý tạo sản phẩm chứa bào tử hệ sợi nấm Các chủng nấm có khả diệt côn trùng, sâu hại thờng đợc nhân sinh khối phơng pháp lên men xốp là: B bassiana; M anisopplie ống giống - ngày Môi trờng dịch thể, lắc 200 vòng/phút, nuôi tO = 28-30ƠC Môi trờng xốp bình 250ml, nuôi 4- ngày tO= 20 - 32ÔC Môi trờng xốp chậu thuỷ tinh so s¸nh (khư trïng 100OC 30- 40 phót) + 10% giống Nuôi 10 ngày tOC= 28 - 30OC Độ ẩm khoảng 90 - 95% Làm khô nhiệt độ phòng Có quạt Độ ẩm 10% sấy 40ÔC Nghiền nhỏ Đóng bao nhÃn Kiểm tra chất lợng Bảo quản - 10OC tối sử dụng Hình14 Quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm diệt sâu côn trùng gây hại Hiệu phòng trừ sâu hại chế phẩm nấm Nấm Metarhizium anisopliae Beauveria đợc nghiên cứu sản xuất để trừ số sâu hại quan trọng nông nghiệp Hiệu lực chế phẩm đà thử rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu điều kiện phòng thí nghiệm nhà lới Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 - 58,8%, rầy lng trắng 64 - 92%, rầy xanh 75 - 96% sâu đo xanh hại đay 43,9 - 64,2% Hiệu lực diệt loài rầy hại lúa ®ång ruéng cña nÊm B bassiana biÕn ®éng tõ 33 - 75% tuỳ theo vụ năm khác Hiệu lực nấm kéo dài 3-4 tuần sau phun nấm, cần phun nấm lần vụ đủ để quản lý loài rầy hại lúa vụ Dùng nấm B bassiana để quản lý loài rầy hại lúa đà làm tăng st tõ 19 tíi 95% so víi ®èi chøng (t theo vụ năm) Nấm B bassiana không gây ảnh hởng cho lúa không gây hại thiên địch sâu, rầy hại lúa Nấm M anisopliae có khả gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý nấm M flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau ngày Chế phẩm nấm diệt châu chấu đợc tiến hành Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết tơng đối tốt, nhng không đồng IV Nguyên sinh động vật ký sinh côn trùng Khái quát nguyên sinh động vật ký sinh côn trùng Côn trùng động vật chủ trung gian phần lớn nguyên sinh động vật ký sinh Ngời ta cho rằng: nguyên sinh động vật có khả dùng để tạo thuốc trừ sâu sinh học với tác động nhanh thời gian ngắn, nhng đóng vai trò quan trọng hệ thống PTTH sâu hại nhờ tác động yếu chúng mà quần thể côn trùng hại giảm bớt phần, côn trùng vật chủ trở nên mẫn cảm tác nhân sinh học khác (virus, vi khuẩn, ), với thuốc hóa học trừ sâu (do cần dùng thuốc hóa học liều lợng thấp bình thờng) BPSH trừ sâu hại chủ yếu quan tâm tới loài nguyên sinh động vật có tác động làm giảm sức sinh sản sức sống côn trùng vật chủ Nguyên sinh động vật gây bệnh côn trùng bao gồm: - Lớp trùng roi Flagellata: Những loài ký sinh côn trùng thuộc họ Trypan osomatidae đặc biệt lµ gièng Leptomonas, Herpetomonas, Crithidia vµ Blastocrithidia Loµi trïng roi Leptomonas pyrrhocoris g©y bƯnh cho bä xÝt Pyrrhocoris apterus, sâu hại sáp ong Galleria mellonella, bọ cánh cứng Tenebrio molitor, ruồi Calliphora sp Loài Leptomonas pyraustae ký sinh sâu đục thân ngô Các loài thuộc giống Herpetomonas thờng ký sinh côn trùng hai cánh, cánh vảy cánh màng - Lớp trùng chân giả Sarcodina: Phần lớn trùng amip ký sinh côn trùng thuộc họ Amoebidae Endamoebidae Loµi Malamoeba locustae (hä Amoebidae) ký sinh ë èng Manpigi biểu mô ruột 40 loài châu chấu Kết nghiên cứu cho thấy loài trùng amip M locustae sử dụng trừ loài châu chấu hại trồng - Lớp trùng bào tử Aporozoa: Gồm nhiều loài gây bệnh cho côn trùng, thờng ký sinh tế bào Côn trùng bị nhiễm nặng chết Các nguyên sinh động vật thuộc nhóm có giai đoạn ngủ nghỉ đợc gọi bào tử, có khả chống chịu tác động yếu tố môi trờng Đây điều kiện tốt cho trùng bào tử tồn thể vật chủ để lây lan bệnh Lớp trùng bào tử gồm có: + Đại diện phụ Eugregarinaria (thuộc Gregarinomorpha) ký sinh thông thờng côn trùng hại thực vật côn trùng kho, thuộc gièng Gregarina (G cuneata, G polymorpha, G steini) ký sinh bọ cánh cứng Tenebrio molitor, loài G vizri ký sinh bä Zabrus tnenbrioides, loµi G typographi ký sinh mät Ips typographus Các loài trùng bào tử thuộc phụ Schizogrega-rinaria cđa bé Gregarinomorpha lµ ký sinh rÊt nguy hiĨm cho côn trùng Thí dụ: Mattesia dispora ký sinh sâu Ephestia kuhniella; M trogodermae, B thuringiensis ký sinh mät cøng ®èt Trogoderma granarium + Bé trïng Coccidiomorpha cã gièng Adelina ký sinh thể côn trùng Loài Adelina tribolii ký sinh mät Tribolium castaneum vµ T confusum Loµi A mesnili ký sinh sâu Ephestia kuhniella, Tineola biselliella Plodia interpunctella Loµi A melolonthae ký sinh bä Melolontha melolontha + Bộ trùng bào tử nhỏ Microsporidia có nhiều loài gây bệnh cho côn trùng có ý nghĩa thực tiễn BPSH trừ sâu hại Chúng ký sinh bên tế bào vật chủ, phá huỷ nhiều loại mô thể côn trùng bị bệnh Ngời ta đà biết mô tả khoảng 200 loài trùng bào tử nhỏ ký sinh côn trùng Trùng bào tử nhỏ ký sinh nhiều nhóm côn trùng nhng cha gặp ký sinh côn trùng chích hút thực vật côn trùng BMăT Một số loài trùng bào tử nhỏ chuyên tính nh Nosema apis, N bombycis Một số khác lại đa thực nh loài Plistophora schubergi ký sinh 20 loài cánh vẩy thuộc họ Đặc điểm quan trọng trùng Microsporidia tạo thành bào tử nhỏ Sự lây nhiễm cho vật chủ nhờ bào tử Số lợng bào tử túi bào tử phụ thuộc vào loài giống nguyên sinh động vật Các loài thuộc giống Nosema có mét bµo tư mét tói bµo tư Loµi Nosema bombycis N apis tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho tằm ong mật (tơng ứng) Loài N locustae ký sinh số châu chấu đợc nghiên cứu để trừ châu chấu - Lớp thảo trùng Ciliophora: Nhiều loài thảo trùng ký sinh côn trùng, nhng số có khả gây bệnh cho côn trùng Thảo trùng gây bệnh chủ yếu cho côn trùng sống nớc: ấu trùng muỗi thuộc họ Chironomidae Culicidae Trong ấu trùng muỗi Chironomus plumosus bị nhiễm nặng có 100.000 - 200.000 cá thể thảo trùng loài Tetrahymena chironomi Khả sử dụng nguyên sinh động vật trừ sâu hại Trong số tất nguyên sinh động vật ký sinh côn trùng có trùng bào tử cỡ nhỏ Microsporidia có khả để phát triển BPSH trừ côn trùng hại Trùng bào tử nhỏ lây truyền theo cách chính: qua miệng, qua vết thơng vỏ thể vào dịch máu qua trứng Để có nguồn nguyên sinh động vật dùng bổ sung vào môi trờng sống côn trùng, nhân nuôi trùng amip Melamoeba locustae loài muỗi Melanoplus differentialis Sản xuất bào tử trùng Mattesia grandis Glugea gasit bọ vòi voi hại Anthonomus grandis; sản xuất bào tử trùng Nomesa serbica, N lymantriae, N muscularis sâu róm Lymantria dispar Nosema locustae đợc sản xuất thành chế phẩm trừ côn trùng có hiệu cao V Tuyến trùng ký sinh côn trùng (Nematode) Đặc điểm tuyến trùng ký sinh côn trùng Theo Poinar, 1975 có khoảng 1000 loài 19 côn trùng ký chủ tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh côn trùng có kích thớc thể khác nh loài có thân dài tới 30cm thuộc họ Mermithidae, loài có thân ngắn đạt 0,2mm thuộc gièng Neoaplectana Cã nhãm tun trïng lín lµ : - Tuyến trùng sống ống tiêu hoá côn trïng; - TuyÕn trïng b¸n ký sinh; - TuyÕn trïng ký sinh b¾t buéc Mét sè tuyÕn trïng ký sinh côn trùng + Tuyến trùng bán ký sinh loại côn trùng sống ký sinh hoại sinh ấu trùng tuyến trùng xâm nhập vào thể qua đờng lỗ thở đờng miệng theo thức ¨n Cïng víi vi khn tun trïng ph¸t triĨn thÕ hệ gây chết côn trùng sử dụng xác chết vật chủ làm thức ăn Tuyến trùng chØ cã mét hä Steinernematidae gåm cã hai gièng : Steinernema Neoaplectane + Tuyến trùng ký sinh bắt buộc không gây chết vật chủ: Chu kỳ phát triển tun trïng trïng víi chu kú ph¸t triĨn cđa ký chủ trứng tuyến trùng qua thực quản vào ruột côn trùng phát triển, ấu trïng ti xt hiƯn vµ chun xng rt sau để tiếp tục phát triển Tuyến trùng đẻ trứng, trứng đợc thải với phân vật chủ + Tuyến trùng ký sinh bắt buộc gây chÕt ký chđ: Nhãm nµy gåm tun trïng ký sinh khoang thể côn trùng, tuyến trùng hoàn thành toàn chu kỳ phát triển Chúng sử dụng vật chủ làm nguồn dinh dỡng cho thân chúng gây chết ký chủ Tuyến trùng nhóm thuộc họ Mermithidae Tetradonematidae ... lạc thành phần môi trờng sử dụng sản xuất Bt Trong nhà máy nhỏ Hồ Bắc, sản lợng Bt tăng từ 26 năm 19 83 đến 90 năm 19 84, 16 0 năm 19 85, 260 năm 19 86, 360 năm 19 87, 472 năm 19 88, 732 năm 19 89 đến. .. Quốc, Nigeria, Brazin ấn Độ Bảng 14 : Thành phần môi trờng lên men đợc sử dụng để sản xuất Bacillus thuringiensis số nớc phát triển (Salama, 19 93) Tên nớc Thành phần môi trờng Tác giả Mêhicô Rỉ... men 36 mật độ vi khuẩn đạt 10 9 ữ 10 10 vi khuẩn/ml + Lựa chọn tạo chất mang phù hợp Chất mang cho chế phẩm phải bảo đảm cho vi khuẩn tồn tốt, không gây ảnh hởng xấu đến môi trờng sử dụng phải
