kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Khảo sát khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn Địa lan do vi khuẩn Erwinia carotovora Holl. gây ra của Plumbagin và một số dẫn xuất Stadies on plumbagin used to control solf rot disease on Simbidum sp. Nguyễn Thanh Trà 1 , Đặng Vũ Thị Thanh 2 , Lưu Tham Mưu 1 , Dương Anh Tuấn 1 Abstract Plumbagin (5-hydroxy-2methyl-1,4-naphthoquinon) is a naturally occurring naphthoquinon isolated from the root of Plumbago zeylanica L. Plumbago zeylanica is used as a traditional medicine for the treatment of several diseases. Synthesize 4 derivative base on fomula of plumbagin: derivetive 1: 5-axetoxy-2-methyl-1,4-naphthoquinon; derivative 2: 5-acetoxy-3- bromo-2-methyl-1,4-naphthoquinon; derivetive3:5-hydroxy-2,3-epoxid-2-methyl- 1,4naphthoquinon; derivative 4: 5-hydroxy-8-iode-2-methyl-1,4-naphthoquinon. The antimicrobial activity of plumbagin and 4 derivative were evaluated using the microdilution method. The Plumbagin war used to control Erwinia carotovora, causing solf rot disease on Cymbidium sp. in green house. Apter spraying 30 days in 1000 g/ml concentration of plumbagin treatment the diseases incidence reduced 57,1%. I. Mở đầu Plumbagin là một hợp chất thuộc nhóm naphthoquinon có mặt ở hầu hết các loài Plumbago, đặc biệt có nhiều nhất trong rễ cây của chúng [7]. Có hai loài thường gặp ở các nước Nam á và Đông Nam á là Bạch hoa xà và Xích hoa xà trong đó Bạch hoa xà là loài phân bố rộng hơn so với loài xích hoa xà. [1, 4]. Những nghiên cứu invitro cũng như invivo đều khẳng định plumbagin là chất quyết định các hoạt tính sinh học của cây Bạch hoa xà. [2,5]. Các hoạt tính sinh học của plumbagin đã được công bố như: kháng kí sinh trùng [3], gây ngán ăn ở côn trùng [8 ], hay chống ung thư [3 ] Để góp phần định hướng sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên thay thế dần các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hoá học, độc hại với môi trường và sức khoẻ con người. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây địa lan trong nhà lưới của Plumbagin. II.Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 1.Vật liệu Cây Bạch hoa xà được thu hái tháng 10 năm 2005 tại Yên Thuỷ- Hoà Bình và được thẩm định bởi TS. Kim Biên- Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật-Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam. Plumbagin được tách chiết từ lá, sau đó được tổng hợp một số dẫn xuất 1, 2,3,4. Công thức cấu tạo của plumbagin và các dẫn xuất của plumbagin. 1. Viện Hoá học -Viện KH&CNVN. 2. Viện Bảo vệ thực vật - Viện KHNNVN kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 OAC O O OAC O O Br OAC O O I O O O OH O O OH Plumbagin Dẫn xuất 1 Dẫn xuất 2 Dẫn xuất 3 Dẫn xuất 4 Chủng vi khuẩn gây bệnh: Erwinia carotovora. được phân lập từ cây Địa Lan bị bệnh thối nhũn thu thập tại Đà Lạt- Lâm Đồng trên môi trường lựa chọn TTC Chất so sánh hiệu lực phòng trừ: Agromycin 2. Phương pháp 2.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật invitro. Tiến hành theo phương pháp pha loãng đa nồng độ broth microdilution method của Carson, C.F., et al [6], được áp dụng tại Trường Đại học Antwerp, Vương quốc Bỉ. Plumbagin và các dẫn xuất được pha loãng ở các nồng độ từ 1mg/ml, 0,5mg/ml, 0,25mg/ml…0,002mg/ml. Cho dung dịch có chứa vi sinh vật ở nồng độ 10 5 CFU/ml vào các giếng đã chứa plumbagin. Giếng đối chứng không có vi sinh vật, ủ ở tủ ấm 30 0 C trong 18-20h. Hoạt tính kháng vi sinh vật được đánh giá bằng phương pháp đo độ đục tế bào trên máy quang phổ spectrometer ở bước sóng 405nm. Các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC, MBC, IC50. Chất so sánh Agromycin cũng pha loãng theo dãy nồng độ như Plumbagin. Giá trị IC (nồng độ ức chế vi sinh vật) có thể được tính bằng công thức sau: IC= (mẫu - trắng)/ (điều khiển - trắng) x 100. Xác định MIC ( nồng độ ức chế tối thiểu) bằng cách đọc chỉ số độ đục tế bào so sánh với giếng điều khiển âm (môi trường không có vi sinh vật). IC50 xác định bằng chương trình raw data trên máy tính. Xác định MBC bằng cách kết hợp phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng và phương pháp cấy dung dịch sau khi đọc kết quả trên đĩa thạch nếu có thể. MBC (tại nồng độ này) là giá trị thấp nhất gây chết hoàn toàn vi sinh vật. 2.2. Xác định khả năng trừ bệnh thối nhũn vi khuẩn của plumbagin trên địa lan trong nhà lưới Các cây Địa lan đã xuất hiện triệu chứng bệnh thối nhũn trồng ở chậu vại được dùng để đánh giá khả năng ức chế bệnh thối nhũn vi khuẩn của Plumbagin. Thí nghiệm có 5 công thức, mỗi công thức 15 cây, nhắc lại 3 lần. Công thức thí nghiệm được tiến hành phun Plumbagin nồng độ 500 và 1000 ug/ml và Agromycin nồng độ 500 và 1000ug/ml, công thức đối chứng phun nước. Theo dõi diễn biến của bệnh và đếm số cây chết sau 5 ngày, 10, 20, 25 đến 30 ngày. Số liệu được xử lý theo chương trình SaSS. III. Kết quả và thảo luận 1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn invitro. Vi khuẩn gây bệnh cây Erwinia carotovora được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đưa vào các giếng thử với nồng độ 10 5 CFU/ml. Đọc kết quả sau 18-20h trên máy spectrometer. Tính giá trị IC50, MIC, MBC. Kết quả được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả thử hoạt tính kháng vi khuẩn Erwinia carotovora của plumbagin và các dẫn xuất TT Chất thử Erwinia carotovora IC 50 (g/ml) MIC (g/ml) MBC (g/ml) 1 Plumbagin 201,7 500 - kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 2 Dẫn xuất 1 - - - 3 Dẫn xuất 2 - - - 4 Dẫn xuất 3 - - - 5 Dẫn xuất 4 3,0 3,9 4 6 Agromycin 39,0 62,5 1000 Qua kết quả trên cho thấy plumbagin có giá trị IC50 (ức chế 50% lượng vi sinh vật) ở nồng độ 201,7g/ml, đạt giá trị MIC tại nồng độ 500g/ml, không có giá trị MBC. Dẫn xuất 4 có hoạt tính mạnh thể hiện ở cả 3 giá trị IC50, MIC, MBC  4g/ml, trong khi Agromycin dùng làm chất so sánh có hoạt tính IC50 = 39g/ml và đạt MIC tại 62,5 g/ml, có giá trị MBC tại nồng độ 1000 g/ml. 2. Khả năng ức chế bệnh thối nhũn Địa Lan của plumbagin trong nhà lưới Các cây Địa lan đã xuất hiện triệu chứng bệnh thối nhũn trồng ở chậu vại được dùng để đánh giá khả năng ức chế bệnh của Plumbagin. Thí nghiệm có 5 công thức , mỗi công thức 15 cây, nhắc lại 3 lần. Công thức thí nghiệm được tiến hành phun Plumbagin và Agromycin, công thức đối chứng phun nước. Kết quả thí nghiệm được chỉ ra ở bảng 2. Bảng 2. Khả năng hạn chế sự phát triển của bệnh thối nhũn địa lan (Erwinia carotovora) của plumbagin trong nhà lưới ( Viện BVTV 2006 ) Công thức Chất thử % cây chết sau phun Khả năng hạn chế bệnh (%) 5 ngày 15 ngày 30 ngày 1 Plumbagin 500ug/ml 11,1 a 28,9 a 33,3 b 46,5 2 Plumbagin 1000ug/ml 6,7 b 15,6 b 26,7 bc 57,1 3 Agromycin 500ug/ml 8,9 a 15,6 b 22,2 cd 64,3 4 Agromycin 1000ug/ml 8,9 a 11,1 b 15,6 d 74,9 5 Đối chứng 13,3 a 42,2 a 62,2 a 0 CV(%) 15,77 9,06 5,01 LSD (%) 0,2825 0,2133 0,1324 Kết quả ở bảng 2 đã chỉ ra có sự khác biệt giữa các công thức thí nghiệm và so với đối chứng. Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở công thức đối chứng sau 30 ngày, số cây chết là 62,2%. Tỉ lệ cây chết ở công thức plumbagin 500g/ml giảm còn là 33,3%, công thức plumbagin 1000g/ml tỉ lệ cây chết giảm còn là 26,7%. Agromycin có khả năng hạn chế bệnh tốt, với nồng độ 500g/ml tỉ lệ cây chết sau 30 ngày là 22,2%, ở nồng độ 1000g/ml thì tỉ lệ cây chết chỉ còn 15,6%. Plumbagin 500g/ml khả năng hạn chế bệnh so với đối chứng là 46,5%, khả năng hạn chế bệnh khi dùng plumbagin 1000g/ml so với đối chứng là 57,1%. Agromycin có hiệu lực cao hơn plumbagin với khả năng hạn chế bệnh lên tới 64,3% và 74,9% (bảng 2). Kết quả thí nghiệm phòng trừ bệnh trong nhà lưới đã chỉ ra rằng plumbagin 1000g/ml có khả năng hạn chế bệnh thối nhũn vi khuẩn trên cây địa lan. Khi địa lan mới chớm bị bệnh dùng plumbagin phun cho cây sẽ giảm tỷ lệ cây bị chết 57,1% so với đối chứng. IV. Kết luận & Đề nghị 1. Kết luận Plumbagin là một hợp chất tự nhiên được chiết xuất từ lá cây Bạch hoa xà. Plumbagin và dẫn xuất 4 có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn Erwinia carotovora gây bệnh thối nhũn cây Địa lan, đặc biệt là dẫn xuất 4 có hoạt tính mạnh nhất. Khi địa lan mới chớm bị bệnh dùng plumbagin phun cho cây sau 30 ngày sẽ giảm tỷ kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 lệ cây bị chết 57,1% so với đối chứng. 2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu khả năng sử dụng plumbagin để phòng trừ bệnh thối nhũn trên cây địa lan. TàI LIệU THAM KHảO 1. Đỗ Huy Bích và cộng sự. 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản KH&KT. t ập 1, tr148 2. B. Hazza, R. Sarkar, S. Bhattacharyya, P.K. Ghosh, G. Chel., B. Dinda, 2002. Phytother. Res. 16, p133 3. Chan-Bacab MJ, Pena-Rodriguez LM 2001. Plant natural products with leishmanicidal activity. Nat Prod Rep 18: p 674-688 4. L.S. de Palua, N. Bunyapraphasara and R.H.M.J Lammens. 1999. Plant Resources of South-East Asia. Deckhuys Publishers, Leiden. No 12 (1).p:411 5. N. Didry, L. Dubreuil, F. Trotin, M. Pinkas. 1998. J. Ethnopharmacol. 60, p91. 6. Stuart B. Levy, " The antibiotic Paradox" (New York: Plenum Press) 1992.4 7. Van de Vijver LM 1972. Distribution of plumbagin in Plumbaginaceae. Phytochemistry 11, 324. 8. Villavicencio MA, Perez - Escandon BE. 1992. Plumbago feeding deterrent for three species of Orthoptera. Entomol Mex 86: p191- 198 . cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Khảo sát khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn Địa lan do vi khuẩn Erwinia carotovora Holl. gây ra của Plumbagin và một số dẫn xuất Stadies on plumbagin used to. trường và sức khoẻ con người. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng phòng trừ bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây địa lan trong nhà lưới của Plumbagin. II.Vật liệu và. OAC O O OAC O O Br OAC O O I O O O OH O O OH Plumbagin Dẫn xuất 1 Dẫn xuất 2 Dẫn xuất 3 Dẫn xuất 4 Chủng vi khuẩn gây bệnh: Erwinia carotovora. được phân lập từ cây Địa Lan bị bệnh thối nhũn thu thập tại Đà Lạt-