TCNCYH 26 (6) - 2003 Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuyệt đối của tiểu quần thể lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) ở nhóm ngời bình thờng tại thành phố hồ chí Minh bằng máy FASCALIBUR Trần Khiêm Hùng Phòng Miễn dịch tế bào, Viện Pasteur TP. HCM Mục tiêu là xác định các giá trị bình thờng của tiểu quần thể lympho, trên cơ sở đó làm số li ệu tham chiếu cho bệnh nhân đến làm xét nghiệm tại viện Pasteur Thành phố H Chí Minh v à tiến hành so sánh các giá trị này với các giá trị của ngời Iran. Ph ơng pháp áp dụng: lấy máu ngời bình thờng (n=47) chống đông bằng EDTA. ủ máu v ới hai nhóm kháng thể của BD chứa trong hai ống khác nhau: CD3/ CD8/ CD45/ CD4 ; CD3/ CD16,56 / CD45/ CD19. Sau khi x ử lý mẫu đợc cho qua máy FASC, phân tích, tính toán, thống kê. Cuối cùng xác định các giá trị T CD3, T CD4, T CD8, B, NK ở từng mẫu riêng biệt. K ết quả: T CD3: % (X = 68, SD: 7.94) . Tuyệt đối (X = 2412, SD: 691); T CD4: % (X = 35.7, SD: 6.2) . Tuy ệt đối (X = 915, SD: 339); T CD8: % (X = 25.85, SD: 5.46) . Tuyệt đối (X = 626, SD: 245); B: % (X = 7.97, SD: 2.79). Tuy ệt đối (X = 194, SD: 93); NK: % (X = 20.1, SD: 7.18) . Tuy ệt đối (X = 477, SD: 203); Tỉ lệ T CD4/ T CD8: X =1.53, SD: 0.46. K ết luận: Khi so sánh với các giá trị của quần thể Iran, thì chỉ có tỉ lệ % NK của nhóm nghi ên cứu là cao còn những giá trị còn lại đều thấp hơn. i. ặt Vấn đề Đị nh giá trị của tiểu quần thể lympho rất c ó giá trị trong một số trờng hợp sau: + Định lợng lympho T CD4 để biết đợc b ệnh nhân nhiễm HIV đang ở giai đoạn nào v à làm cơ sở cho việc quyết định và theo dõi điều trị. + X ác định tình trạng thiếu hụt NK ở nh ững ngời nhiễm virus Herpes tái đi tái lại. + X ác định tình trạng của hệ thống miễn d ịch [1, 2]. Tuy nhi ên các số liệu tham chiếu cho ng ời bình thờng hầu nh chỉ dùa trên các s ố liệu của ngời nớc ngoài. Trên ngời Vi ệt Nam thì rất ít, hoc thiu s liu theo vùng a lý. M ặc khác, còn một vấn đề rất quan trọng l à hiện nay tại Việt Nam vẫn cha có một hệ th ống kiểm tra chất lợng bên trong, bên ngo ài (internal quality control and external quality control) đối với máy FASCalibur nham đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm. M ặc dầu cho tới bây giờ FASCalibur là một c ông cụ rất đáng tin cậy nhờ vào việc sử d ụng các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang v à có thể phối hợp 4 chất huỳnh quang kh ác nhau cùng một lúc khi thử nghi ệm. 27 TCNCYH 26 (6) - 2003 Do đó việc xây dựng một bộ giá trị tham chi ếu cho tiểu quần thể lympho của phòng mi ễn dịch tế bào (viện Pasteur TP.HCM) có gi á trị thực tiễn. H ơn thế nữa chúng tôi cũng muốn so s ánh các giá trị của nhóm nghiên cứu với nh ững nhóm dân số khác để xem tỷ lệ của ti ểu quần thể lympho có thay đổi gì hay kh ông? ii. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Vật liệu, đối tợng nghiên cứu: - ống ch ống đông bằng EDTA-TRI K cung c ấp bởi LMD Paris. - ống nghi ệm 5ml, cỡ 12 575mm do hãng BD cung c ấp. - Kh áng thể của BD: + CD3 (FITC)/ CD8 (PE) / CD45 (PerCP) / CD4 (APC). + CD3 (FITC) / CD16,56 (PE) / CD45 (PerCP) / CD19 (APC). - Dung d ịch ly giải hồng cầu . - M áy FASCalibur của BD. - Ph ần mềm cellquest, excel - M ẫu máu có đợc lấy từ những ngời hi ến máu nhiều lần tại hội chữ thập đỏ TP.HCM. + Tu ổi từ 19 đến 50 tuổi bao gồm 40 nam v à 8 nữ. + C ác xét nghiệm: kháng thể bất thờng, VDRL, KSTSR, HCV, HIV, HbsAg đều âm t ính. + Công th ức máu trong giới hạn bình th ờng. V ì tiến hành lấy máu trớc khi xét nghi ệm, sau khi có kết quả trong mẫu nghi ên cứu loại trừ một trờng hợp vì có HbsAg (+). N ên cỡ mẫu thật sự chỉ là 47. 2. Ph ơng pháp: + X ử lý mẫu: * 1 ml m áu tơi chống đông bằng EDTA đợc xử lý trong vòng 4 giờ. * 100 àl m áu chống đông vào mỗi ống nghi ệm và ủ trong vòng 30. - ống 1: c ó 5 àl kháng thể CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4(APC). - ống 2: c ó 5 àl kháng thể CD3 (FITC)/ CD16,56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19(APC). * H ồng cầu bị ly giải bằng 1 ml dung dịch ly. * Trung h òa bằng 1ml dung dịch PBS. * Ly t âm 2000 rpm/1 trong vòng 4 phút. B ỏ dịch nổi, thêm vào 500 àl dung dịch PBS, l ắc đều và các tế bào đợc phân tách sau đó bằng máy FASC. + M ẫu đợc chạy bằng máy FASCalibur, s ản phẩm của hãng BD (Hoa Kĩ). * M áy có 2 đèn laser. - Xanh: cung c ấp ánh sáng ở bớc sóng 488 nm. - Đỏ: cung cấp ánh sáng ở bớc sóng 620 nm. * C ó 6 cảm thụ quan nhận cảm ánh sáng ph át xạ và những cảm thụ quan này cho ta bi ết đợc: - FSC: h ình thái của tế bào. - SSC: c ấu trúc của tế bào. - Fl1: b ắt màu huỳnh quang FITC. - Fl2: b ắt màu huỳnh quang PE. - Fl3: b ắt màu huỳnh quang PerCP. - Fl4: b ắt màu huỳnh quang APC. + M ẫu đợc phân tích bằng sơ đồ chạy trong ch ơng trình Cellquest. % TCD8, TCD4, TCD3 d ùa vào kháng th ể CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4 (APC) v à có cách tính nh sau: 28 TCNCYH 26 (6) - 2003 R1 Sample ID: 160402/6-X7 Quad Events % Gated UL 614 8.01 UR 2492 32.52 LL 1909 24.91 LR 2648 34.56 Sample ID: 160402/6-X7 Quad Events % Gated UL 28 0.37 UR 2665 34.78 LL 2492 32.52 LR 2478 32.34 R2 UL LR UR=32.52% A B C D E F UL UR=34.78% LR Hình 1: Phơng pháp xác định tỷ lệ % TCD4, TCD8. A- D ùng cửa sổ x=SSC, y=Fl3-CD45 để lo ại trừ hồng cầu cha ly giải, mảnh vỡ của t ế bào bằng cách giới hạn các tế bào cần ph ân tích trong khu vực R1. Vì thế quần thể lympho ph ân tích sau này thuần nhất hơn. B- C ửa sổ thứ 2 (x=FSC, y=SSC) bắt ngu ồn từ vùng R1. Thấy rõ 3 nhóm dân số: lympho, b ạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt. Gi ới hạn dân số lympho trong vùng R2 C- C ửa sổ thứ 3 (x=Fl1-CD3, y=Fl2-CD8) b ắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2. Kết h ợp với phần thống kê của cửa sổ này (hình 1 E) cho ta bi ết đợc tỉ lệ phần trăm của TCD8 =% v ùng UR cho Fl1 và Fl2. Trong h ình là 32.52%. D- C ửa sổ thứ 4 (x=Fl1-CD3, y=Fl4-CD4) b ắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2. Kết h ợp với phần thống kê của cửa sổ này (hình 1 F) cho ta bi ết đợc tỉ lệ phần trăm của TCD4 =% v ùng UR cho Fl1 và Fl4. Trong h ình là 34,78%. V à tỉ lệ % CD3 = % UR + % LR. Các số li ệu có thể lấy ở cửa sổ 3 hay 4. % NK, B d ựa vào kháng thể CD3 (FITC)/ CD16.56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19(APC) v à có cách tính nh sau: 29 TCNCYH 26 (6) - 2003 Sample ID: 160402/5-X 7 Quad Events % Gated UL 1632 20.90 UR 243 3.11 LL 789 10.11 LR 5143 65.88 R1 R2 Sample ID: 160402/5-X 7 Quad Events % Gated UL 169 2.16 UR 13 0.17 LL 2243 28.73 LR 5382 68.94 LR A B C D E F LR UR UR UL=2.16% UL=20.9% Hình 2: Phơng pháp xác định tỷ lệ % B, NK. A- D ùng cửa sổ x=SSC, y=Fl3-CD45 để lo ại trừ hồng cầu cha ly giải, mảnh vỡ của t ế bào bằng cách giới hạn các tế bào cần ph ân tích trong khu vực R1. Vì thế quần thể lympho ph ân tích sau này thuần nhất hơn. B- C ửa sổ thứ 2 (x=FSC, y=SSC) bắt ngu ồn từ vùng R1. Thấy rõ 3 nhóm dân số: lympho, b ạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt. Gi ới hạn dân số lympho trong vùng R2 C- C ửa sổ thứ 3 (x=Fl1-CD3, y=Fl2- CD16.56) b ắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2. K ết hợp với phần thống kê của cửa sổ n ày (hình 2 E) cho ta biết đợc tỉ lệ phần tr ăm của NK=% vùng UL cho Fl1 và Fl2. Trong h ình là 20.9%. D- C ửa sổ thứ 4 (x=Fl1-CD3, y=Fl4- CD19) b ắt nguồn từ hội của vùng R1 và R2. K ết hợp với phần thống kê của cửa sổ này (h ình 2 F) cho ta biết đợc tỉ lệ phần trăm c ủa B=% vùng UL cho Fl1 và Fl4. Trong h ình là 2.16%. 2. Phơng pháp thống kê: D ùng phần mềm Excell để xác định giá tr ị trung bình, độ lệch chuẩn của các thông s ố. D ùng phép kiểm t để so sánh trung bình c ủa 2 nhóm dân số. Trớc tiên xác định t t ính, với trị số t này tra bảng phân phối t với độ t do (n 1 +n 2 -2) để ớc lợng giá trị p (p value). n 1 , n 2 là cỡ mẫu của 2 nhóm dân số t ơng ứng. 30 TCNCYH 26 (6) - 2003 iii. Kết quả Bảng 1: Tỷ lệ phần trăm, giá trị tuyệt đối của tiểu quần thể lympho ở nhóm dân số TP.HCM Loại tế bào % Tuyệt đối T CD3 X: 68, SD: 7.94 X: 2412, SD: 691 T CD4 X: 35.7, SD: 6.2 X: 915, SD: 339 T CD8 X: 25.85, SD: 5.46 X: 626, SD: 245 B X: 7.97, SD: 2.79 X: 194, SD: 93 NK X: 20.1, SD: 7.18 X: 477, SD: 203 Tỉ lệ TCD4/TCD8 X: 1.53, SD: 0.46 Khi so sánh kết quả này (HCM) với số liệu ngời Iran [3] chỉ giới hạn ở tỷ lệ phần trăm (xem b ảng 2). Bảng 2: Bảng so sánh các giá trị giữa nhóm dân số TP.HCM với nhóm dân số Iran. HCM (n=47) % Mean SD Iran (n=152) % Mean SD T t ính p TCD3 68 7.94 70.62 7.29 2.11 p < 0.05 TCD4 35.7 6.2 42.11 6.95 5.66 p < 0.001 TCD8 25.85 5.46 28.41 8.58 1.9 0.05 < p < 0.1 CD4/CD8 1.53 0.46 1.61 0.6 0.84 0.2 < p < 0.5 CD19 7.97 2.79 13.72 4.59 8.13 p < 0.001 NK 20.1 7.18 15.81 6.97 -3.66 p < 0.001 IV. Bàn luận Ngoại trừ TCD8, TCD4/TCD8 có p > 0,05 t ức là không có sự khác biệt về trung bình ở hai nh óm dân số trên. Trong khi đó TCD3, TCD4, CD19 đều có sự khác biệt (p < 0,05) v ới tỷ lệ thấp hơn ở nhóm dân số TP.HCM. T ơng tự với NK cũng có sự khác biệt (p < 0,05) nh ng tỷ lệ ở nhóm Iran lại thấp hơn. M ở rộng vấn đề này đối với một số chủng t ộc khác. Với nghiên cứu của Lee BW và c ộng sự nhận thấy tỷ lệ NK ở ngi Đài Loan th ì cao hơn ngi Châu Âu trong khi tỷ l ệ TCD4 thì thấp hơn [4]. Kết luận tơng tự c ũng tìm thấy trên báo cáo của Prime và c ộng sự [3] là tỷ lệ NK ở ngời Trung Hoa cao h ơn ở ngời Châu Âu. Theo Shahpour Shahghasempour khi nghi ên cứu trên ngời Iran (l à quần thể chúng tôi dùng để so sánh v ới nhóm nghiên cứu tại TP.Hồ Chí Minh) [3] th ì NK của ngời Iran cao hơn ngời Châu Âu, trong khi tỷ lệ TCD8 thì thấp hơn. T ừ những thông tin này khiến ngời ta nghĩ đến khả năng là tỷ lệ của tiểu quần thể lympho sự thay đổi khi có sự khác biệt về ch ủng tộc. M ặc khác với tỷ lệ NK của nhóm nghiên c ứu cao hơn hẳn khi so với nhóm ngời Iran, Ch âu Âu, trong khi TCD3, TCD4, CD19 đều th ấp hơn. Với sự khác biệt này khiến ngời ta suy ngh ĩ nh thế nào về vai trò của đáp ứng miễn dịch tự nhiên (thông qua NK) ở qu ần thể này? Sự cao hơn về tỷ lệ NK có gi úp ích gì cho các cá thể trong việc giúp cơ th ể chống lại những tác nhân gây hại? để tr ả lời cho những câu hỏi trên chúng ta cần nghi ên cứu lại vấn đề này với cỡ mẫu rộng h ơn nhằm xác lập lại thật sự tỷ lệ NK ở ng ời bình thờng tại TP.HCM cao hơn 31 TCNCYH 26 (6) - 2003 nhóm ngời Iran, Châu Âu. Thậm chí cần nghi ên cứu sâu hơn về chức năng của NK, kh ảo sát một số CD bề mặt của NK nh: CD1.7.1, CD158a, KAR, KIR P70, CD28, HLA-DR l à những CD cho biết đợc tình tr ạng hoạt động, kích hoạt của tế bào NK v. Kết luận Sau khi xử lý mẫu đợc cho qua máy FASC, ph ân tích, tính toán, thống kê. Cuối c ùng xác định các giá trị T CD3, T CD4, T CD8, B, NK ở từng mẫu riêng biệt. K ết quả: T CD3: % (X = 68, SD: 7.94) . Tuy ệt đối (X = 2412, SD: 691); T CD4: % (X = 35.7, SD: 6.2) . Tuy ệt đối (X = 915, SD: 339); T CD8: % (X = 25.85, SD: 5.46) . Tuy ệt đối (X = 626, SD: 245); B: % (X = 7.97, SD: 2.79). Tuy ệt đối (X = 194, SD: 93); NK: % (X = 20.1, SD: 7.18) . Tuy ệt đối (X = 477, SD: 203); T ỉ lệ T CD4/ T CD8: X =1.53, SD: 0.46. Khi so s ánh với các giá trị của quần thể Iran, th ì chỉ có tỉ lệ % NK của nhóm nghiên c ứu là cao còn những giá trị còn lại đều thấp h ơn. Tài liệu tham khảo 1. Flow cytometry protocols . Mark J.Jaroszeski, Richard Heller. Humana Press. 2. Practical flow cytometry. Howard M. Shapiro, M.D.Wiley Liss.1995. 3. Enumeration of peripheral blood lymphocyte subsets in a healthy iranian population. Shahpour Shahghasempour, Mitra Gerami, Zinat Entezami. Archives of Iranian Medecine, 2001; 4(2): 80-83. 4. Age and sex related changes in lymphocyte subpopulation of healthy Asian subjects from birth to adulthood. Lee BW, Yap HK, Chew FT, Quah TC, Prabhakaran K, Chan GS, Wong SC, Seah CC. Cytometry 1996 Mar 15; 26 (1):8-15. Summary LYMPHOCYTE SUBPOPULATION IN HEALTHY ADULTS DONORS OF HO CHI MINH CITY VIET NAM The primary objective of this study was to establish reference ranges for the lymphocyte subsets (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) in the peripheral blood of healthy adults donors. This reference ranges is used like target values for the patients at Pasteur Institute-HCMC and then compare the results with those obtained in a group of healthy adults Iranian population. The samples obtained from the 47 healthy adults donors were stained with two premixed monoclonal antibodies:CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4 (APC); CD3 (FITC)/ CD16-56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19 (APC). After stain, whole blood is passed lyses procedures, wash and final they were analyzed by flow cytometry. The results: T CD3: % (X= 68, SD: 7.94) . Absolute (X = 2412, SD: 691); T CD4: % (X = 35.7, SD: 6.2) . Absolute (X = 915, SD: 339); T CD8: % (X = 25.85, SD: 5.46) . Absolute (X = 626, SD: 245); B: % (X = 7.97, SD: 2.79) . Absolute (X = 194, SD: 93); NK: % (X = 20.1, SD: 7.18) . Absolute (X = 477, SD: 203); Ratio T CD4/ T CD8: X =1.53, SD: 0.46. We have the difference clearly in subpopulation NK (population of HCMC is higher than Iranian population). The study demonstrate that on population's HCMC, the innate immunity may have a role protection importance. But we need more study with a larger of sample size to clarify 32 . TCNCYH 26 (6) - 2003 Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuy t đối của tiểu quần thể lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) ở nhóm ngời bình thờng t i thành phố hồ chí Minh bằng máy FASCALIBUR. iii. K t quả Bảng 1: T lệ phần trăm, giá trị tuy t đối của tiểu quần thể lympho ở nhóm dân số TP.HCM Loại t bào % Tuy t đối T CD3 X: 68, SD: 7.94 X: 2412, SD: 691 T CD4 X: 35.7, SD:. giá trị của tiểu quần thể lympho r t c ó giá trị trong m t số trờng hợp sau: + Định lợng lympho T CD4 để bi t đợc b ệnh nhân nhiễm HIV đang ở giai đoạn nào v à làm cơ sở cho việc quy t định