TCNCYH 36 (3) - 2005 18 Giám sát căn nguyên virut Viêm Não Nhật Bản, virut west Nile và virut Nam định gây hội chứng não cấp bằng kỹ thuật MAC-ELISA, 2003 2004 Phan Thị Ngà 1 , Đoàn Hải Yến 1 , Phạm Đỗ Quyên 1 Nguyễn Thanh Thuỷ 1 , Huang Claire 2 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng 2 Trung tâm kiểm soát bệnh tật Fort Collins, Colorado Trong năm 2003 2004, có 976 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân hội chứng não cấp (HCNC) nhận đợc từ Viện Nhi trung ơng, một số trung tâm Y học dự phòng các tỉnh và Viện Vệ sinh dịch tễ Tây nguyên, để xác định căn nguyên virut gây HCNC bằng kỹ thuật MAC-ELISA với kháng nguyên virut viêm não Nhật bản (VNNB), virut West Nile và virut Nam Định; kết quả cho thấy: - Xét nghiệm 976 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân có HCNC với kháng nguyên virut VNNB, xác định 46,1 %(454/976) trờng hợp bị HCNC là do virut VNNB. - Xét nghiệm 239 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân có HCNC với kháng nguyên virut Nam định, xác định 13,4 % (32/239) trờng hợp bị HCNC là do virut Nam định. - Xét nghiệm 103 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân có HCNC với kháng nguyên virut West Nile, không có trờng hợp nào dơng tính. Cho đến nay virut VNNB vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây HCNC ở Việt nam, với trên 80 % số mắc ở trẻ em dới 15 tuổi. Để khống chế bệnh VNNB cần tăng cờng sử dụng văc xin VNNB cho tất cả trẻ em dới 15 tuổi. Từ khoá: Hội chứng não cấp, viêm não Nhật bản, virut West Nile, virut Nam Định. I. Đặt vấn đề ở Việt Nam, ngoài tác nhân virut đờng ruột, virut VNNB, virut Herpes Simplex typ 1, 2; virut Epstein Barr, còn có ba nhóm virut khác gây HCNC đã đợc phân lập ở miền Bắc Việt nam, trong số này có một nhóm virut đã đợc giải mã gen, xác định là một virut mới, dự kiến xếp vào chi virut Arteri và có tên là virut Nam định [1],[2],[4]. Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng (VSDTTƯ), hàng năm có khoảng 2000 3000 trờng hợp bị HCNC do virut. Trong những năm gần đây, HCNC do virut viêm não Nhật bản (VNNB) đợc khống chế bằng văc-xin trong chơng trình tiêm chủng mở rộng cho trẻ em từ 1 5 tuổi ở một số vùng trọng điểm dịch ở miền Bắc cũng nh các dịch vụ y tế, nhng tỷ lệ trẻ em dới 15 tuổi đợc sử dụng văc- xin VNNB còn thấp nên HCNC do virut VNNB cũng vẫn còn là một vấn đề đáng quan tâm [1]. Mặt khác, những nghiên cứu về dịch tễ sinh học phân tử virut VNNB cũng xác định có sự mới xuất hiện của virut VNNB genotyp 1 ở Việt nam cũng nh một số nớc trong khu vực châu á do chim di c, là một cảnh báo cho sự có thể xuất hiện TCNCYH 36 (3) - 2005 19 virut West Nile ở châu á cũng nh ở Việt nam [3]. Chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu Giám sát căn nguyên virut viêm não Nhật bản, virut West Nile và virut Nam Định gây HCNC bằng kỹ thuật MAC- ELISA, 2003 - 2004 nhằm mục tiêu xác định tác nhân virut nào là nguyên nhân chính gây HCNC ở Việt nam để định hớng cho việc phòng bệnh có hiệu quả. II. đối tợng và phơng pháp 1. Đối tợng Mẫu bệnh phẩm: 976 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân có HCNC do virut nhận đợc từ Viện Nhi trung ơng, một số Trung tâm Y học dự phòng các tỉnh ở miền Bắc, Viện Vệ sinh dịch tễ Tây nguyên, 2003 2004. Sinh phẩm: Kháng nguyên virut West Nile do Trung tâm kiểm soát bệnh tật Fort Collins, Hoa kỳ cung cấp. Kháng nguyên virut VNNB, kháng nguyên virut Nam định do Viện VSDTTƯ cung cấp. Các sinh phẩm và hoá chất cần thiết khác. Dụng cụ: Tấm nhựa 96 giếng đáy bằng của NUNC. Pipet tự động một kênh và 8 kênh. Máy đọc ELISA, các trang thiết bị và dụng cụ cần thiết khác. 2. Phơng pháp Thu thập và chọn mẫu: Các mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ đợc lấy trong ngày bệnh nhân nhập Viện, bảo quản theo thờng quy của phòng thí nghiệm cho đến khi làm xét nghiệm. Chọn mẫu để xét nghiệm: Các mẫu huyết thanh hoặc dịch não tuỷ có đủ thông tin về ngày mắc bệnh và ngày lấy mẫu đợc làm xét nghiệm với kháng nguyên virut VNNB để loại trừ căn nguyên virut VNNB gây HCNC. Có 239 mẫu mẫu dịch não tuỷ âm tính đợc làm xét nghiệm với kháng nguyên virut Nam định. Có 103 mẫu dịch não tuỷ và huyết thanh bệnh nhân đợc chọn một cách ngẫu nhiên trong số các mẫu âm tính với kháng nguyên VNNB và kháng nguyên virut Nam định đợc kiểm tra với kháng nguyên virut West Nile. Tiêu chuẩn nhận định kết quả theo nguyên lý kỹ thuật MAC-ELISA [6]: OD chứng âm, OD blank < 0.200. OD chứng dơng / OD chứng âm 2 Mẫu xét nghiệm dơng tính khi: OD mẫu xét nghiệm / OD chứng âm 2 III. Kết quả Bảng 1. Xác định căn nguyên virut gây HCNC bằng kỹ thuật MAC-ELISA Kháng nguyên Mẫu xét nghiệm Mẫu dơng tính Mẫu âm tính Tỷ lệ % Virut VNNB 976 454 522 46,1 Virut Nam định 239 32 207 13,4 Virut West Nile 203 0 103 0 Có 976 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân có HCNC thu thập trong năm 2003 và 2004 đợc xét nghiệm bằng kỹ thuật MAC-ELISA với kháng nguyên TCNCYH 36 (3) - 2005 VNNB xác định có 454 mẫu dơng tính, tỷ lệ xác định dơng tính với kháng nguyên virut VNNB là 46,1 %. Trong số 522 mẫu âm tính, có 239 mẫu dịch não tuỷ đợc xét nghiệm với kháng nguyên virut Nam định bằng kỹ thuật MAC-ELISA, xác định có 32 mẫu dơng tính, tỷ lệ xác định dơng tính với kháng nguyên virut Nam định là 13,4%. Chọn ngẫu nhiên 103 mẫu trong số 207 mẫu huyết thanh và dịch não tuỷ của bệnh nhân HCNC có kết quả xét nghiệm âm tính với kháng nguyên virut VNNB và virut Nam định để kiểm tra với kháng nguyên virut West Nile bằng kỹ thuật MAC-ELISA, kết quả không có mẫu nào dơng tính. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 HCNC, VNNB 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Viem nao Nam Dinh HCNC VNNB Viem nao Nam Din h Hình 1. Sự phân bố theo tháng của các trờng hợp HCNC do virut VNNB và virut Nam định, 2003 2004 Các trờng hợp HCNC xác định dơng tính với kháng nguyên virut VNNB, virut Nam định bằng kỹ thuật MAC-ELISA đợc ghi nhận chủ yếu trong các tháng hè ở miền Bắc, tỷ lệ xác định dơng tính với kháng nguyên virut VNNB là 88,7% (403/454) từ tháng 5 đến tháng 7, với kháng nguyên virut Nam định là 78,1 % (25/32) từ tháng 4 đến tháng 6. Bảng 2: Sự phân bố theo nhóm tuổi các trờng hợp bị HCNC do virut VNNB và virut Nam định, 2003 2004 Nhóm tuổi HCNC (%) HCNC do virut VNNB (%) HCNC do virut Nam Định (%) < 1 8,1 2,8 20,6 1 4 24,1 18,6 20,6 5 9 27,8 38,2 24,1 10 14 25,4 32,1 27,5 15 14,5 8,66 6,89 Có 976 trờng hợp HCNC đợc lấy mẫu để xét nghiệm trong năm 2003 2004, trong số này có trên 80 % số mẫu là ở các trờng hợp HCNC dới 15 tuổi. Trong số các trờng hợp bị VNNB, số mắc tập trung chủ yếu ở trẻ em từ 1 đến 14 tuổi chiếm khoảng 90 % tổng số mắc, tuy nhiên số mắc VNNB ở trẻ em dới 1 tuổi rất ít, chiếm 2,8 %, số 20 TCNCYH 36 (3) - 2005 21 mắc VNNB ở trẻ em từ 1 4 tuổi đã giảm, chiếm 18,6 % tổng số mắc. Có 32 trờng hợp bị HCNC do virut Nam định đợc xác định ở các nhóm tuổi, đặc biệt trẻ em dới 1 tuổi có tỷ lệ số mắc là 20,6 %, trẻ em 10 14 tuổi có số mắc cao nhất, chiểm 27,5% tổng số mắc. Bảng 3: Xác định những địa phơng có các trờng hợp bị HCNC do virut VNNB và virut Nam định, 2003 2004 Số TT Tỉnh, Thành HCNC do virut VNNB HCNC do virut Nam Định 1 Bắc Giang 27 4 2 Bắc Ninh 7 2 3 Cao Bằng 1 0 4 Điện Biên 1 0 5 Hà Giang 2 0 6 Hà Nam 15 0 7 Hà Nội 7 1 8 Hà Tây 30 6 9 Hà Tĩnh 6 0 10 Hải Dơng 25 1 11 Hải Phòng 10 3 12 Hng Yên 18 3 13 Hoà Bình 2 1 14 Lai Châu 3 0 15 Lạng Sơn 5 0 16 Lào Cai 10 1 17 Nam Định 25 2 18 Ninh Bình 8 1 19 Nghệ An 8 0 20 Phú Thọ 23 0 21 Sơn La 4 0 22 Thái Bình 81 0 23 Thanh Hoá 41 3 24 Tuyên Quang 6 1 25 Vĩnh Phúc 9 0 26 Quảng Ninh 5 0 27 Yên Bái 3 0 28 Gia Lai 22 1 29 Kon Tum 11 0 30 Đắc Lắc 2 0 TCNCYH 36 (3) - 2005 22 Trong năm 2003 2004 (trừ những trờng hợp không có thông tin về địa chỉ của bệnh nhân hoặc một số địa phơng đã triển khai chẩn đoán VNNB nên không gửi mẫu về Viện để xét nghiệm nh các tỉnh của khu vực miền Trung, miền Nam), trong số 976 bệnh nhân bị HCNC đợc lấy mẫu xét nghiệm tại Viện, kết quả cho thấy bệnh nhân bị HCNC do virut VNNB đợc xác định ở 27 tỉnh thành miền bắc, 3 tỉnh thuộc Tây nguyên; bệnh nhân bị HCNC do virut Nam định đợc xác định ở 12 tỉnh thành ở miền Bắc và ở Gia lai, Tây nguyên. IV. Bàn luận Kỹ thuật MAC-ELISA là một kỹ thuật có độ nhạy và đặc hiệu cao, có thể chẩn đoán phân biệt đợc sự nhiễm các virut trong cùng một họ. Chính vì vậy kỹ thuật này đã đợc ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán xác định các virut Arbo [1],[5],[6]. ứng dụng kỹ thuật MAC-ELISA để xác định căn nguyên virut gây HCNC, xác định 48,4 % là do virut VNNB và 13,4 % do virut Nam định, cha phát hiện đợc trờng hợp nào bị HCNC do virut West Nile. Trong nghiên cứu của Phan Thị Ngà và cộng sự trớc đây, ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vật liệu di truyền của của một số loại virut gây HCNC từ dịch não tuỷ của bệnh nhân ở miền Bắc Việt Nam, xác định có 1/53 mẫu (1,9 %) là do virut đờng ruột, có 7/53 mẫu (12,9 %) là do virut Herpes Simplex typ 1, 2; virut Epstein Barr [2] và 8/53 mẫu (15,1 %) là do virut Arbo. Nh vậy ngoài các tác nhân virut mới đợc phát hiện ở Việt nam, virut VNNB vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây HCNC, mặc dù việc tăng cờng sử dụng vac xin VNNB để phòng bệnh cho trẻ em từ 1 đến 5 tuối trong chơng trình tiêm chủng mở rộng đã đợc thực hiện ở miền Bắc từ năm 1997 [1]. Cho đến thời điểm này căn nguyên virut West Nile cha đợc phát hiện ở Việt Nam, nhng việc giám sát căn nguyên virut West Nile gây HCNC cần tiếp tục duy trì để có thể phát hiện đợc tác nhân gây bệnh kịp thời. Các trờng hợp bị VNNB tập trung chủ yếu ở trẻ em từ 1 đến 14 tuổi chiếm khoảng 90 % tổng số mắc tơng tự nh kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả trong và ngoài nớc [1],[5]. Tuy nhiên số mắc VNNB ở trẻ em từ 1 4 tuổi đã giảm, chiếm 18,6 % tổng số mắc nhờ việc tăng cờng sử dụng văc-xin phòng bệnh cho trẻ em từ 1 đến 5 tuổi trong chơng trình tiêm chủng mở rộng ở một số vùng trọng điểm dịch ở miền Bắc, nếu so với trớc năm 1995, số mắc trong nhóm tuổi này chiếm 37,6% [1]. Nh vậy sử dụng văc xin VNNB để khống chế bệnh rất có hiệu quả, cần tăng cờng sử dụng văc xin để phòng bệnh cho tất cả trẻ em dới 15 tuổi. Virut Nam Định đợc phân lập từ dịch não tuỷ của bệnh nhân HCNC ở Nam Định năm 2002, theo kết quả xác định trình tự vật liệu di truyền, virut đợc xếp vào chi virut Arteri là một virut do muỗi truyền, đây là một virut mới đợc phát hiện ở Việt Nam [4]. Trong nghiên cứu này, có 32 trờng hợp bị HCNC do virut Nam định đợc xét nghiệm bằng kỹ thuật MAC-ELISA, nhận xét thấy các nhóm tuổi đều cảm nhiễm với virut Nam Định, đặc biệt trẻ em dới 1 tuổi có tỷ lệ số mắc là 20,6 %, trẻ em 10 14 tuổi có số mắc cao nhất, chiếm 27,5% tổng số mắc. Các trờng hợp HCNC do virut Nam định đợc TCNCYH 36 (3) - 2005 23 ghi nhận chủ yếu trong các tháng hè ở miền Bắc, trùng với mùa dịch viêm não Nhật bản. Trong nghiên cứu này, bệnh nhân bị HCNC do virut Nam định đợc xác định ở 12 tỉnh thành ở miền Bắc và Gia lai, Tây nguyên (bảng 3), theo kết quả hồi cứu tác nhân virut Nam định gây HCNC từ 1998 2004 cũng đã xác định ở 21 tỉnh thành của miền Bắc và Gia lai, Tây nguyên [4]. Virut Nam định đợc phân lập ở miền Bắc, miền trung từ bệnh nhân, từ muỗi đã đợc ghi nhận [4], cho thấy việc giám sát tác nhân virut Nam định gây HCNC ở miền Trung, miền Nam cần đợc đề cập tới trong các nghiên cứu tiếp theo. V. Kết luận Giám sát một số căn nguyên virut gây HCNC bằng kỹ thuật MAC-ELISA ở Việt Nam năm 2003 2004, xác định 46,1 % (454/976) căn nguyên virut gây HCNC là do virut VNNB, 13,4 % (31/239) là do virut Nam Định và cha phát hiện đợc căn nguyên virut West Nile gây HCNC ở Việt Nam. Nh vậy cho đến nay virut VNNB vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây HCNC ở Việt Nam Đề tài thực hiện tại Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng với sự hợp tác của Khoa Lây, Viện Nhi trung ơng, Viện Vệ sinh dịch tễ Tây nguyên và một số trung tâm Y học dự phòng các tỉnh. Tập thể tác giả xin trân trọng cảm ơn ! Tài liệu tham khảo 1. Phan Thị Ngà, Nguyễn Thị Kiều Anh, Vơng Đức Cờng, Vũ Sinh Nam, Phạm Thị Minh Hằng, Trần Văn Tiến (2002). Giám sát, chẩn đoán viêm não Nhật Bản ở Việt Nam, 2000 - 2001. Tạp chí Y học dự phòng, tập XII, số 4 (55): 5 11. 2. Phan Thị Ngà, Mary B. Crabtree (2004). ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 30 số 4 : 15 20. 3. Nga P. T., del Carmen Partquet M. , Cuong V. D., Ma S. P., Hasebe F., Inoue S., Makino Y. Takagi M., Nam V. S., Morita K. (2004). Shift in Japanese Encephalitis Virus (JEV) genotype 1 circulating in northern Vietnam: Implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to East Asia. J. Gen Virol 85: 1625 1631. 4. Phan Thị Ngà (2005). Phát hiện virut Arbo mới gây hội chứng não cấp, định hớng xây dựng kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2003 2005. 5. Lowry P. W., Truong D. H., Hinh L. D., Ladinsky J. L., Karabatsos N., Cropp C. B., Martin D., Gubler D. J. (1998). Japanese encephalitis among hospitalized pediatric and adult patients with acute encephalitis syndrome in Hanoi, Vietnam 1995. Am. J. Trop. Med. Hyg. 58: 324 329. 6. Martin D. A., Muth D. A., Brown T. Johnson A. J., Karabatsos N. and Roehrig J. T. (2000). Standardization of Immunoglobulin M Capture enzyme- Linked Immunosorbent Assays for Routine Diagnosis of Arboviral Infections. Journal of Clinical Microbiology: 1823 1826. TCNCYH 36 (3) - 2005 24 Summary applying mac-elisa for etiological surveillance of Japanese encephalitis, west Nile and nam dinh viruses cause acute encephalitis syndrome, 2003 - 2004 During 2003 – 2004, in total 976 sera and cerebrospinal fluid samples of acute encephalitis syndrome (AES) patients were collected from Pediatric hospital, several Center of Preventive Medicine and National Institute of Hygiene and Epidemiology, Tay nguyen for screening viral etiologies which cause AES by MAC-ELISA with Japanese encephalitis (JE), West Nile and Nam dinh virus antigens. The results showed that: - Examination of 976 sera and cerebrospinal fluid samples of AES patients by JE virus antigen, 46,1 % (454/976) cases were confirmed to be JE virus infection. - Examination of 239 cerebrospinal fluid samples of AES patients by Nam dinh virus antigen, 13,4 % (32/239) cases were confirmed to be Nam dinh virus infection. - Examination of 103 sera and cerebrospinal fluid samples of AES patients by West Nile virus antigen, non positive result was confirmed with this antigen. To date, JE virus is leading etiology cause AES in Vietnam with over 80 % cases in children under 15 years old. It should be intensive JE vaccination for all children under 15 years old in order to control JE soon. . TCNCYH 36 (3) - 2005 18 Giám sát căn nguyên virut Viêm Não Nhật Bản, virut west Nile và virut Nam định gây hội chứng não cấp bằng kỹ thuật MAC- ELISA, 2003 2004 Phan Thị Ngà 1 ,. nghiên cứu Giám sát căn nguyên virut viêm não Nhật bản, virut West Nile và virut Nam Định gây HCNC bằng kỹ thuật MAC- ELISA, 2003 - 2004 nhằm mục tiêu xác định tác nhân virut nào là nguyên nhân. dịch tễ Tây nguyên, để xác định căn nguyên virut gây HCNC bằng kỹ thuật MAC- ELISA với kháng nguyên virut viêm não Nhật bản (VNNB), virut West Nile và virut Nam Định; kết quả cho thấy: - Xét nghiệm