TCNCYH 22 (2) - 2003 Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên glycolipid trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh lao Trần Hồng Vân 1 , Văn Đức Hạnh 2 , Vũ Nguyệt Minh 3 và Lê Văn Phủng 1 1 Labo trung tâm, Đại học Y Hà Nội, 2 Sinh viên Y3 A, 3 Sinh viên Y3 D Nghiên cứu này tìm hiểu độ nhạy, độ đặc hiệu và phản ứng chéo của 6 loại kháng nguyên glycolipid tinh chế từ vi khuẩn lao bằng kỹ thuật ELISA trên 168 bệnh nhân. Số bệnh nhân này đợc chia thành 3 nhóm: nhóm I gồm 62 bệnh nhân lao phổi BK (+); nhóm II gồm 53 ngời lành; nhóm III gồm 53 ngời bị các bệnh nhiễm trùng khác ngoài lao. Kết quả cho thấy: Ba loại kháng nguyên tốt nhất là cord factor (DT), trehalose monomycolate (MT) và phenol glycolypid (PA); độ nhạy từ 66,1%- 74,2%, độ đặc hiệu 69%- 73,6%, phản ứng chéo từ 22,6%- 39,6%. Các kháng nguyên khác đều có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn và phản ứng chéo cao hơn. ELISA với kháng nguyên glycolipid đặc hiệu có thể dùng để chẩn đoán lao ngoài phổi và lao phổi BK (-). I. Đặt vấn đề Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về mối nguy cơ bệnh lao đang quay trở lại cùng với tốc độ gia tăng dân số và đại dịch HIV/AIDS trên toàn thế giới . Ước tính số ngời mắc lao mới sẽ là 11,8 triệu vào năm 2005 (tăng 57,8% so với 1990) [2]. Bệnh lao đã thực sự trở thành mối đe doạ đến sức khoẻ, tính mạng nhiều ngời. Tử vong do lao chiếm 1/4 số tử vong do nhiễm khuẩn ở ngời lớn. Việt Nam là 1 trong 22 nớc có bệnh lao trầm trọng trên thế giới [10]. Chẩn đoán bệnh lao trên lâm sàng sẽ đợc khẳng định khi tìm thấy vi khuẩn trong bệnh phẩm bằng các phơng pháp nh nhuộm coi trực tiếp, nuôi cấy phân lập. Nhng trong nhiều trờng hợp không tìm thấy vi khuẩn lao bằng các phơng pháp này do lấy, bảo quản và xử lý bệnh phẩm không tốt. Vì vậy các phơng pháp chẩn đoán gián tiếp nh các xét nghiệm miễn dịch, Mantoux, X quang đã góp phần đáng kể vào chẩn đoán. Ngày nay, miễn dịch học đã đợc áp dụng cả trong theo dõi diễn biến bệnh lao, phòng bệnh và theo dõi khả năng dung nạp thuốc của cơ thể [4]. Một trong những kỹ thuật miễn dịch đợc ứng dụng ngày càng rộng rãi là kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng vi khuẩn lao bằng kỹ thuật ELISA. Từ thập kỷ 70, đã có nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả nớc ngoài và gần đây có một số tác giả trong nớc đã áp dụng kỹ thuật này để phát hiện kháng thể kháng lao; giúp cho chẩn đoán, phát hiện bệnh lao, đặc biệt là với các trờng hợp lao ngoài phổi và lao phổi BK (-) . Tuy vậy, vấn đề quan trọng nhất trong huyết thanh học chẩn đoán lao là chất lợng kháng nguyên; vì Mycobacterium tuberculosis có nhiều loại kháng nguyên và có nhiều kháng nguyên chéo với các Mycobacteria khác [1]. Nhờ những tiến bộ về kỹ thuật mà những kháng nguyên của vi khuẩn cũng dần dần đợc tinh chế tốt hơn để chẩn đoán bệnh lao. 11 TCNCYH 22 (2) - 2003 Đã có nhiều kháng nguyên đợc dùng để chẩn đoán lao nh: Protein 38 kDa, protein 30 kDa, lipoarabinomannan (LAM), glicolipid LDS, DAT, PGL Tb1, kháng nguyên A60 vv với độ nhậy và độ đặc hiệu rất khác nhau [7]. Các kháng nguyên protein có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn các kháng nguyên glycolopid nhng bảo quản khó khăn hơn, vì vậy không đợc áp dụng rộng rãi trên thực tế. Gần đây, phòng nghiên cứu vaccine BCG ở Nhật Bản đã đa ra 6 loại kháng nguyên mới, đợc tinh chế từ vi khuẩn lao, bản chất hoá học là glycolipid. Để đánh giá giá trị chẩn đoán lao của kháng nguyên này, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm 2 mục đích: So sánh giá trị chẩn đoán của 6 loại kháng nguyên, tìm ra những kháng nguyên đặc hiệu, có giá trị nhất trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh lao. Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu, phản ứng chéo của kỹ thuật ELISA với kháng nguyên glycolipid. II. Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng Tiến hành nghiên cứu trên huyết thanh của 168 ngời Việt Nam trong đó gồm: Nhóm I: 62 bệnh nhân lao phổi tuổi từ 15- 75 đợc chẩn đoán là lao BK (+) tại Viện lao-Bệnh phổi Hà Nội và bệnh viện Lao Quảng Ninh. Nhóm II: 53 ngời lành tuổi từ 15- 75. Những ngời này đợc coi là lành nếu không mắc bệnh nhiễm trùng nào vào thời điểm lấy mẫu nghiên cứu. Nhóm III: 53 bệnh nhân tuổi từ 15-75, có mắc ít nhất một bệnh nhiễm trùng (không phải lao). 2. Vật liệu Bộ sinh phẩm ELISA lao (BCG Lab, Tokyo, Nhật Bản). Phiến nhựa 96 giếng có gắn 6 kháng nguyên tinh chế, bản chất hoá học là lipid: - Hàng A (P2): Phosphoinositomannoside - Hàng B (DT): 6, 6 -dimycolyltrehalose (cord factor) - Hàng C (MT): Trehalose monomycolate - Hàng D (PA): Phenol glycolipid - Hàng E (MI): Glycolipid - Hàng F (Co): Glycopeptide - Hàng G: Làm nền (Background) cho kháng nguyên DT và PA (hàng B và D). - Hàng H làm nền cho kháng nguyên P2, MT, MI và Co (các hàng A, C, E, F). Ngời làm xét nghiệm không đợc biết bản chất kháng nguyên của từng hàng. Các hoá chất kèm theo: Đệm PBS (viên nén)-T (Tween 20), đệm citrate-phosphate; cộng hợp: (HRP- Goat Anti- Human IgG), H 2 O 2 và o-phenylendiamine (OPD). 3. Phơng pháp Huyết thanh: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch, không chống đông. Tách huyết thanh rồi giữ trong tủ lạnh sâu -70 C cho đến khi làm phản ứng. Kỹ thuật ELISA (Enzymed-Linked Immunosorbent Assay): Những giếng có sẵn gắn kháng nguyên lao cho tiếp xúc với kháng thể kháng lao có trong huyết thanh ngời bệnh, cho thêm chất cộng hợp (kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase) tạo nên một phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể-Kháng kháng thể-Enzyme. Kết quả đợc phát hiện nhờ màu sắc đợc tạo ra do phản ứng của enzyme với cơ chất cho thêm vào. Trong kỹ thuật này, dung dịch có mầu vàng, phổ hấp phụ màu của dung dịch đo đợc ở bớc sóng 490/620 nm. Cờng độ màu tỷ lệ với nồng độ kháng thể kháng lao trong huyết thanh ngời bệnh. 12 TCNCYH 22 (2) - 2003 Kỹ thuật tiến hành: - Cố định kháng nguyên: cho 150 àL dung dịch PBS-T vào mỗi giếng, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Huyết thanh bệnh nhân: cho 50 àl huyết thanh bệnh nhân đã pha loãng 1/201 vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ sau đó rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-T. - Cộng hợp: thêm 50 àl cộng hợp (1/500) vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng 1 giờ, sau đó rửa 3 lần bằng dung dịch PBS-T. - Cơ chất: thêm 50 àl dung dịch OPD (1 mg/ml) có chứa sẵn H 2 O 2 0,06%, để 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Dừng phản ứng: thêm 50 àl H2SO4 1N. - Đọc kết quả ở bớc sóng 490/620 nm. Xử lý số liệu: Dùng chỉ số mật độ quang để so sánh (OD này đã đợc trừ đi OD chứng), sử dụng toán thống kê y học trên máy vi tính bằng chơng trình Epi.Info 6.4. Công thức tính nh sau: Số dơng tính thật (I) x 100 Độ nhậy = (%) Tổng số nhóm bệnh (I) Số âm tính thật (II) x 100 Độ đặc hiệu = (%) Tổng số nhóm lành (II) Số dơng tính giả (III) x 100 Độ phản ứng chéo = (%) Tổng số nhóm (III) Giá trị ngỡng dơng tính đợc tính bằng giá trị OD thấp nhất trong bệnh lao (nhóm I) mà từ đó trở lên tập trung 95% bệnh nhân lao. III. Kết quả. Bảng 1. phân bố OD ở 3 nhóm nghiên cứu. OD (min - max) Nhóm P2 DT MT PA MI Co I (n=62) 0 - 3,092 0-3,392 0-2,733 0-1,961 0-2,130 0-0,882 II (n=53) 0- 1,767 0-0,753 0-0,805 0-0,535 0-0,884 0-0,963 III (n=53) 0-0,626 0-0,249 0-0,129 0-0,432 0-0,991 0-1,227 Nhóm I có OD cao nhất, trong số đó, kháng nguyên DT có OD tập trung nhiều nhất là từ 1 trở lên; trong khi đó, các kháng nguyên P2, MI và Co cũng có mẫu cho OD cao (3,092), nhng chỉ có 1 mẫu duy nhất, số còn lại, tập trung ở khu vực OD thấp (0,2 trở xuống). ở nhóm II, các kháng nguyên DT, MT và PA cho kết quả OD thấp nhất so với các kháng nguyên còn lại. ở nhóm III, các kháng nguyên DT, MT và PA cũng cho kết quả OD thấp nhất so với các kháng nguyên khác. 13 TCNCYH 22 (2) - 2003 Bảng 2. Độ nhậy, độ đặc hiệu và phản ứng chéo của từng kháng nguyên % Số (+) trong nhóm Kháng nguyên I (n=62) II (n=53) III (n=53) Độ nhạy Độ đặc hiệu Phản ứng chéo P2 39 13 16 62.9 75.5 30.2 DT 46 9 21 74.2 83.0 39.6 MT 41 14 21 66.1 73.6 39.6 PA 43 16 12 69.4 69.8 22.6 MI 19 15 23 30.6 71.7 43.4 Co 29 20 26 46.8 62.3 49.1 Ba kháng nguyên DT, MT và PA có độ nhạy cao nhất, đặc biệt là kháng nguyên DT cả hai chỉ số nhạy và đặc hiệu đều cao nhất. IV. Bàn luận Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng 6 loại kháng nguyên lipid tinh chế vi khuẩn lao, theo thông báo của cơ sở sản xuất kháng nguyên, có 3 kháng nguyên đặc hiệu cho M. tubercubosis (DT, MT và PA) và 3 kháng nguyên khác (P2, MI và Co) thì ít đặc hiệu hơn. Chúng tôi đã lu ý nhận xét này sau khi có kết quả nghiên cứu. 1. Kết quả xét nghiệm ELISA với 3 nhóm đối tợng nghiên cứu Nồng độ kháng thể của nhóm I tăng hơn hẳn ( OD = 1,315) so với nhóm II (0,35) và nhóm III (0,236). Mặt khác, số bệnh nhân cho kết quả ELISA dơng tính với từng loại kháng nguyên cũng lớn và lớn nhất trong số 3 nhóm nghiên cứu. Điều đó cho thấy, mức độ dơng tính phụ thuộc vào kháng nguyên và kháng thể dịch thể trong lao tuy không có vai trò tiêu diệt vi khuẩn lao [1] nhng có giá trị để chẩn đoán bệnh lao. Bảng 2 đã chỉ ra 3 kháng nguyên có độ nhạy cao nhất (DT, MT và PA) và các kháng nguyên MI và Co có độ nhạy thấp nhất. Nh vậy, ba loại kháng nguyên đầu có thể đợc chọn lọc làm kháng nguyên cho chẩn đoán lao. Tuy nhiên, một số bệnh nhân nhóm I cho kết quả âm tính, đây là âm tính giả. Điều này có thể do đáp ứng miễn dịch kém ở các bệnh nhân này (suy giảm miễn dịch do quá yếu, do AIDS). Tuy vậy, trong nghiên cứu này, khi chọn bệnh nhân, chúng tôi cha có điều kiện sàng lọc những bệnh nhân này. 2. Xét nghiệm ELISA với nhóm bệnh nhân lành (nhóm II) Nồng độ kháng thể (đợc biểu hiện thông qua OD) của nhóm II, III thấp hơn nhóm I. Tuy vậy, đối với mỗi loại kháng nguyên, đều có một số lợng ngời lành cho kết quả dơng tính (Bảng 2). Điều này có thể lý giải qua tỷ lệ nhiễm lao cao ở cộng đồng (1/3 nhân loại nhiễm lao), tuy không có biểu hiện bệnh, nhng có kháng thể, đó là kết quả của những lần nhiễm lao trớc. Thứ hai là do phản ứng chéo với các Mycobacteria không gây bệnh do có cấu trúc kháng nguyên tơng đồng. Nh vậy, tìm kiếm một kháng nguyên đặc hiệu hơn vẫn là cần thiết và chắc chắn là điều khó khăn. 3. Xét nghiệm ELISA với nhóm bệnh nhân mắc nhiễm trùng khác ngoài lao (nhóm III) OD trung bình của nhóm II và III thấp hơn nhiều so với nhóm I và số lợng bệnh nhân ở nhóm III cho kết quả dơng tính cao hơn nhóm II (ngời lành). Đó là do hiện tợng đáp ứng 14 TCNCYH 22 (2) - 2003 miễn dịch chéo của cơ thể với các kháng nguyên tơng đồng với Mycobacteria hoặc là do đáp ứng với nhiễm lao từ trớc nh trong nhóm II (ngời lành). Trong sáu kháng nguyên đã thử, các kháng nguyên DT, MT và PA có tỷ lệ phản ứng chéo thấp nhất. 4. So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA với các loại kháng nguyên nghiên cứu Kháng nguyên MI và Co có độ nhậy thấp nhất (30,6-46,8%), độ phản ứng chéo cao nhất (43,4%-49,1%) trong 6 loại kháng nguyên. Hai loại kháng nguyên này đặc hiệu hơn cho M. avium (thông tin cá nhân). Kháng nguyên DT, MT và PA có độ nhậy, độ đặc hiệu cao tơng đối đồng đều, độ phản ứng chéo có phần thấp hơn so với hai loại kháng nguyên kể trên. Nghiên cứu của Steel B.A và CS (1991) đã sử dụng 3 loại kháng nguyên glycolipid LDS, DAT và PGLTb1 của vi khuẩn lao để chẩn đoán lao phổi bằng ELISA đợc độ nhậy 50- 60%, độ đặc hiệu 98% [9]. Chiang L. H (1996) nghiên cứu huyết thanh của 507 bệnh nhân gồm lao BK (+), lao phổi có vôi hoá, bệnh phổi không phải lao và nhóm ngời khoẻ mạnh bình thờng ở Đài Loan sử dụng kháng nguyên 38 kDa đạt độ nhậy 51% [8]. Theo Sada E. D (1990) khi dùng kháng nguyên LAM (lipoarabinomannan) để chẩn đoán lao phổi bằng kỹ thuật ELISA cho thấy, độ nhậy 72% và độ đặc hiệu 91% [8]. Nghiên cứu của Bùi Đức Luận (1996) về khả năng đáp ứng miễn dịch bằng xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng thể kháng lao trong huyết thanh bệnh nhân lao phổi kết hợp lao ngoài phổi bằng kháng nguyên siêu nghiền và kháng nguyên tiết thô, tác giả cho thấy, độ nhậy của các loại kháng nguyên này từ 90- 95%, độ đặc hiệu từ 94-100% [3]. Năm 1997, Doãn Trọng Tiên, Trần Văn Sáng và các cộng sự đã sử dụng kháng nguyên tiết và kháng nguyên siêu nghiền của 2 chủng vi khuẩn lao (M. avium; M. tubeculosis) đã rút ra kết luận: nồng độ kháng thể ở ngời già và ngời trởng thành mắc lao đều cao hơn so với ngời già không mắc lao; trong lâm sàng có thể dùng phản ứng ELISA chẩn đoán lao ngời già [5]. Nh vậy ứng dụng kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán các thể bệnh lao ngày càng đợc phổ biến rộng rãi hơn, do có độ tin cậy cao. Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả phù hợp với nghiên cứu kể trên. V. Kết luận Với kỹ thuật ELISA dùng kháng nguyên glycolipid đã góp phần phát hiện sớm bệnh lao trên lâm sàng đặc biệt là các thể lao ngoài phổi và lao phổi BK(-). Ba loại kháng nguyên glycolipid tinh chế từ vi khuẩn lao có thể sử dụng để làm xét nghiệm ELISA chẩn đoán bệnh lao là Cord factor DT, MT và PA. Các kháng nguyên này có độ nhậy từ 66,1%- 74,2%, độ đặc hiệu 69,8%- 83,0% và phản ứng chéo 22,6%- 39,6%. Hy vọng rằng, 3 loại kháng nguyên này sẽ đợc nghiên cứu sâu hơn để có thể thực sự đợc ứng dụng trong xét nghiệm ELISA chẩn đoán bệnh lao. Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Labo BCG (Tokyo, Nhật Bản) đã cung cấp các sinh phẩm cho phản ứng ELISA; Viện Lao và Bệnh phổi, Bệnh viện Lao Hà Nội, Bệnh viện Lao Quảng Ninh đã cung cấp huyết thanh các bệnh nhân lao phổi BK (+). Tài liệu tham khảo 1. Lê Huy Chính (2001), Họ Mycobacteriaceae. Vi sinh y học. Nhà xuất bản Y học, 207-214. 2. N.V Cồ, B.Đ Dơng, H.S Dỡng, Đ. Hứa, N.T Hơng, N.N Lan, P.D Linh, P.T Quang, P.T Thiệp, L.B Tung và L.N Vân (1996), Hớng dẫn thực hiện chơng trình chống lao quốc gia. Chơng trình chống lao quốc gia Viện lao và bệnh phổi, Hà nội, 3. Bùi Đức Luận (1996), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và miễn dịch học ở bệnh nhân 15 TCNCYH 22 (2) - 2003 lao phổi kết hợp lao ngoài phổi. Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội. 4. Trần Văn Sáng (2000), Sinh học phân tử và miễn dịch học trong bệnh lý hô hấp, Nhà xuất bản Y học, 109. 5. Doãn Trọng Tiên (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và khả năng đáp ứng miễn dịch ở ngời già lao phổi. Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội, 104. 6. Chiang I.H, Bai K .J., Suo J. et al (1996), Serological diagnosis of the tuberculosis by ELISA with M. tuberculosis antigen (38 kDa). The 4 th congress of the Asian Pacific Society of respiratory. Abstracts handbook, 72. 7. Dautzenberg B (1994), Epidemiologie de la tuberculose, present et futur proche, 11e congres de pneumologie de langue Francaise (22-25 Jun 1994), Volume des rapports, Nancy- Frace, 165-168. 8. Sada E.D., Daniel T.M., Ferguson L.E (1990), An ELISA for the serodiagnosis of tuberculosis using 30 kDa antigen of Mycobacterium tuberculosis, J Infect Dis, 162: 928-931. 9. Steel B., Daniel T.M (1991), Evaluation of the potential role of serodiagnosis of tuberculosis in clinic in Bolivia by decision analysis, Am. Rev. Respir. Dis, 143: 713-716. 10. World Health Organization (1998), Epidemiological Review of tuberculosis in the Western Pacific Region 1998. World Office for the Western Pacific, Manila, 2- Summary sensitivity and specificity of glycolipid antigens in serodiagnosis of tuberculosis To find out specific antigens to M. tuberculosis, we searched for sensitivity, specificity and cross reactions of 6 glycolipid antigens which were extracted and purified from M. tuberculosis with 168 sera by ELISA. The 168 samples were divided into 3 groups: Group I: 62 lung tuberculosis patients with AFB- smear positive; group II: 53 healthy persons and group III: 53 infectious other than tuberculosis patients. There were 6 glycolipid antigens were used in this study, they were Phosphoinositomannoside (P2), 6, 6-dimycolyltrehalose (cord factor) (DT), Trehalose monomycolate (MT), Phenol glycolipid (PA), Glycolipid (MI) and Glycopeptide (Co). The sensitivity and specificity of DT, MT and PA antigens were 74.2; 66.1; 69, 4% and 83,0; 69,8%; 73.6%, respectively; cross reaction ranging from 22,6% to 39,6%. The sensitivity and specificity of other antigens were lower and its cross reactions were higher than DT, MT and PA antigens. ELISA with specific glycolipid antigens can be used to diagnose extra-lung tuberculosis and lung tuberculosis with AFB (-). 16 . sánh giá trị chẩn đoán của 6 loại kháng nguyên, tìm ra những kháng nguyên đặc hiệu, có giá trị nhất trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh lao. Đánh giá độ nhậy, độ đặc hiệu, phản ứng chéo của. 22 (2) - 2003 Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên glycolipid trong chẩn đoán huyết thanh học bệnh lao Trần Hồng Vân 1 , Văn Đức Hạnh 2 , Vũ Nguyệt Minh 3 và Lê Văn Phủng 1 . hiện kháng thể kháng lao trong huyết thanh bệnh nhân lao phổi kết hợp lao ngoài phổi bằng kháng nguyên siêu nghiền và kháng nguyên tiết thô, tác giả cho thấy, độ nhậy của các loại kháng nguyên