Đánh giá hiệu quả của các tác nhân sử dụng trong kỹ thuật duy trì sinh trởng chậm cây khoai tây in vitro TS. Nguyễn Thị Kim Thanh Summary To estimate effects of factors for slow grown of in vitro potato platlets + The low temperature 6 o C , saccaroza 5%, glucoza 5% and manitol 3% are slowed to grow of potato plantlets. Affter 4 weeks , potato plantlets of control experiment need to transfer to new medium (subculture) + To slow to grow of potato plantlets of factors : saccaroza 5% or glucoza 5% are not so much. Affter 8 weeks , potato plantlets of control experiment need to transfer to new medium (subculture) + The low temperature 6 o C and manitol 3% are slowed to grow of potato plantlets so much. Affter 12 weeks , potato plantlets need't to transfer to new medium (subculture) Keywords: in vitro, insitu, exsitu, subculture 1. Đặt vấn đề Việc chủ động lu giữ nguồn vật liệu sạch virus là một trong số những giải pháp chiến lợc quan trọng nhằm khắc phục hiện tợng thoái hoá khoai tây ở tất cả các nớc trồng khoai tây trên thế giới. Từ đó, ta có thể rút ngắn và tăng hiệu quả của hệ thống sản xuất giống khoai tây nhằm cung cấp nhanh nhất nguồn giống sạch bệnh để thay thế lợng giống đã bị thoái hoá trong sản xuất (G.Mix-Wager,1996)[2]. Vì vậy, trên thế giới đã có nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu kỹ thuật bảo quản, duy trì nguồn vật liệu khoai tây sạch bệnh bằng hai phơng thức in situ và exsitu. Trong đó, phơng pháp bảo quản in vitro dựa trên nguyên lý duy trì sinh trởng tối thiểu và ngừng sinh trởng tạm thời rất có hiệu quả đối với cây khoai tây nhằm kéo dài nhất thời gian giữa các lần cấy chuyển cây khoai tây in vitro (Lê Trần Bình và cs, 1997)[1]. ở nớc ta, các nhà khoa học cũng quan tâm nghiên cứu và đã bớc đầu xác định đợc các tác nhân sử dụng trong kỹ thuật duy trì sinh trởng chậm cây khoai tây in vitro. Tuy nhiên, việc "Đánh giá hiệu quả của các tác nhân sử dụng trong kỹ thuật duy trì sinh trởng chậm cây khoai tây in vitro" là cần thiết, trên cơ sở đó áp dụng vào thực tiễn sản xuất. 2. Vật liệu, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu. Thí nghiệm đợc tiến hành trên một số dòng, giống khoai tây sạch bệnh do Dự án khoai tây Việt - Đức cung cấp hiện đang đợc nuôi dỡng tại phòng nuôi cấy mô Bộ môn Sinh lý thực vật - Khoa Nông Học. . Các dòng, giống sau: Mariella (Ma), Diamant (Di), 3810 (số 3), Solara (Sl), Sonate (Sn), Sponta (Po ) 2.2. Nội dung nghiên cứu Chúng tôi sử dụng các tác nhân duy trì sinh trởng chậm cây khoai tây in vitro theo hai nhóm : nhóm làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trờng nuôi cấy (saccaroza 5%, glucoza 5%, manitol 3%) và nhóm sử dụng nhiệt độ thấp làm giảm khả năng sinh trởng cây khoai tây in vitro. Hiệu quả của các tác nhân làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro sẽ có tác dụng làm kéo dài thời gian cấy chuyển môi trờng của cây khoai tây in vitro thông qua chỉ tiêu về sinh trởng phát triển cây khoai tây trong thời gian bảo quản tại các thời điểm : sau 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần bảo quản 2.3. Phơng pháp nghiên cứu. Thí nghiệm đợc bố trí ngẫu nhiên với 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc 10 bình , mỗi bình 10 cây. Điều kiện duy trì cây in vitro : - Thí nghiệm sử dụng tác nhân làm tăng áp suất thẩm thấu : saccaroza và glucoza với nồng độ 5% và manitol 3% trong môi trờng nuôi cấy. Cây khoai tây đặt dới dàn đèn khoảng 2000 lux, thời gian chiếu sáng16/8h. Nhiệt độ 25 2 0 C. -Thí nghiệm sử dụng nhiệt độ thấp (6 o C) đợc tiến hành trong tủ định ôn có dàn đèn nuôi cây và điều chỉnh mức nhiệt độ thấp theo thí nghiệm. 3. Kết quả nghiên cứu Khả năng làm chậm sinh trởng của các tác nhân sử dụng đợc đánh giá thông qua chỉ tiêu làm chậm sự sinh trởng về chiều cao, số lá nhng vẫn đảm bảo cây có trạng thái sinh trởng tốt và so sánh với công thức đối chứng (nuôi cấy trong điều kiện bình thờng không qua bảo quản) ở các thời gian bảo quản khác nhau. 3.1. Đánh giá hiệu quả của các tác nhân làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro ở giai đoạn sau 4 tuần bảo quản Số liệu theo dõi đợc trình bày trên bảng số liệu 1 và 2 Bảng 1 : ảnh hởng của các tác nhân làm chậm sinh trởng đến chiều cao cây khoai tây in vitro sau 4 tuần bảo quản Tên Đối Các tác nhân làm chậm sinh trởng Giống chứng Nhiệt độ thấp 6 6 C Saccaroza 5% Glucoza 5% Manitol 3% (cm) Chiều cao(cm) Tỷ lệ % so đ/c Chiều cao(cm) Tỷ lệ% so đ/c Chiều cao(cm) Tỷ lệ% so đ/c Chiều cao(cm) Tỷ lệ% so đ/c Ma 8,14 2,98 36,61 6,18 75,92 5,98 73,46 1,00 12,28 Di 8,16 1,52 18,62 7,15 87,62 6,95 85,17 1,12 13,72 Số 3 8,70 2,92 33,56 6,16 70,80 5,78 66,43 1,25 14,36 Sl 8,14 2,10 25,80 7,40 90,90 7,20 88,45 1,12 13,75 Sn 8,62 2,04 23,61 6,12 70,99 6,58 76,33 1,18 13,68 Po 8,00 3,10 38,75 6,20 77,50 6,62 82,75 0,95 11,80 Bảng 2 : ảnh hởng của các tác nhân làm chậm sinh trởng đến số lá/ cây và trạng thái cây khoai tây in vitro sau 4 tuần bảo quản Tên Đối Cac tác nhân làm chậm sinh trởng giống chứng Nhiệt độ thấp 6 o C Saccaroza 5% Glucoza 5% Manitol 3% Số lá/ cây % so đ/c T.T. chồi Số lá/ cây % so đ/c T.T. chồi Số lá/ cây % so đ/c T.T. chồi Số lá/ cây % so đ/c T.T. chồi Ma 6,0 2,9 48,3 Tốt 6,0 100 Xấu 5,6 93,3 Tb 5,8 96,7 Tốt Di 6,2 2,3 37,0 Tốt 6,1 98,4 Tb 5,8 93,5 Tb 6,0 96,8 Tốt Số 3 6,0 3,2 53,3 Tốt 5,8 96,6 Xấu 5,7 95,0 Tb 6,0 100 Tốt Sl 6,3 3,7 58,7 Tốt 6,0 95,2 Tb 6,0 95,2 Tb 6,1 96,8 Tốt Sn 6,1 2,0 32,8 Tốt 6,1 100 Xấu 5,7 93,4 Tb 6,0 98,3 Tốt Po 5,2 2,1 40,4 Tốt 5,1 98,1 Xấu 5,0 96,1 Tb 5,2 100 Tốt Qua số liệu bảng 1 và 2 chúng ta nhận thấy : Cây khoai tây sau bảo quản 4 tuần trong các tác nhân khác nhau thì khả năng làm chậm sinh trởng cũng khác nhau : - Trong điều kiện nhiệt độ thấp 6 o C cây khoai tây có sự sinh trởng phát triển giảm hơn đáng kể so với đ/c. Chiều cao so với đ/c đạt 18,62% - 38,75% và số lá so với đ/c đạt 32,8% - 58,7% tuỳ theo từng giống nghiên cứu. Trạng thái cây tốt : cây xanh, mập. lá to - Trong môi trờng saccaroza 5% cây khoai tây có sự sinh trởng phát triển giảm không nhiều so với đ/c. Chiều cao so với đ/c đạt 70,9% - 90,9% và số lá so với đ/c hầu nh không sai khác đạt 95,2% - 100% . Trạng thái cây từ trung bình đến xấu và cây có hiện tợng già hoá. -Trong môi trờng glucoza 5%, cây khoai tây có sự sinh trởng phát triển giảm không nhiều so với đ/c. Chiều cao 66,43%- 88,45% và số lá 93,3% - 96,1% so với đ/c. Trạng thái cây khoai tây không bị hiện tợng già hoá, đạt mức trung bình : cây mập, lá nhỏ và kém xanh - Trong môi trờng có manitol, đã giảm mạnh sự sinh trởng về chiều cao (đạt 11,40% -14,36% so với đ/c), nhng số lá hầu nh không thay đổi so với đối chứng (96,7%-100%) nh vậy trong môi trờng manitol chỉ làm ngắn đáng kể các đốt cây. Trạng thái cây tốt, thân mập, lá xanh. - Công thức đối chứng, cây khoai tây sinh trởng phát triển mạnh hơn nhiều so với các công thức khác (chiều cao >7 cm) đủ tiêu chuẩn cấy chuyển môi trờng. Vì vậy các giai đoạn bảo quản tiếp theo chỉ theo dõi các công thức có tác nhân làm chậm sinh trởng. 3.2. Đánh giá hiệu quả của các tác nhân làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro ở giai đoạn sau 8 tuần bảo quản Số liệu theo dõi sự sinh trởng phát triển cây khoai tây in vitro sau 8 tuần bảo quản ở các công thức có tác nhân làm chậm sinh trởng đợc trình bày trên bảng 3 Bảng 3 : ảnh hởng của các tác nhân sử dụng đến khả năng làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro sau 8 tuần bảo quản Tên Các tác nhân làm chậm sinh trởng Giống Nhiệt độ thấp 6 6 C Saccaroza 5% Glucoza 5% Manitol 3% Chiều cao(cm) Số lá/cây -TTchồi Chiều cao(cm) Số lá/cây -TTchồi Chiều cao(cm) Số lá/cây - TTchồi Chiều cao(cm) Số lá/cây -TTchồi Ma 3,25 3,2 - Tốt 8,27 7,0 -Xấu 7,82 6,6 - Xấu 2,05 6,0 - Tốt Di 2,05 2,8 - Tốt 10,03 8,5 -Xấu 9,75 7,1 -Tb 1,78 6,3 - Tốt Số 3 3,08 3,9 - Tốt 7,87 7,6 -Xấu 7,10 6,8 -Xấu 1,83 6,8 - Tốt Sl 2,56 4,2 - Tốt 10,54 9,2 -Xấu 8,70 8,7 -Tb 1,79 6,7 - Tốt Sn 2,84 2,7 - Tốt 9,68 7,8 -Xấu 8,82 7,0 -Tb 1,92 6,6 - Tốt Po 3,61 2,8 - Tốt 8,57 7,1 -Xấu 7,75 6,8 -Tb 1,35 5,8 - Tốt Qua số liệu bảng 3 chúng tối nhân thấy, sau 8 tuần bảo quản, sử dụng các tác nhân khác nhau cho khả năng làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro cũng khác nhau : - Trong điều kiện nhiệt độ thấp 6 o C, sau 8 tuần bảo quản thì sự sinh trởng phát triển của cây khoai tây in vitro của tất cả các giống nghiên cứu đều rất thấp cả về chỉ tiêu về chiều cao và số lá. Tuỳ theo từng giống nghiên cứu, chiều cao dao động từ 2,05 cm - 3,61 cm với 2,7 - 4,2 lá. Đồng thời, cây khoai tây in vitro vẫn đảm bảo trạng thái chồi tốt (chồi mập, lá to và xanh) - Trong môi trờng có nồng độ saccaroza 5% hoặc glucoza 5%, sau 8 tuần bảo quản có làm chậm sinh trởng nhng hiệu quả không cao. Chiều cao cây khoảng từ 7 cm - 10cm với từ 6 - 9 lá tuỳ theo từng giống và từng loại đờng sử dụng. Môi trờng glucoza 5% cây khoai tây có biểu hiện chậm sinh trởng hơn môi trờng saccaroza 5% và đa số chồi có trạng thái trung bình.Trong khi môi trờng saccaroza trạng thái chồi của các giống đều xấu và bị già hoá. - Trong môi trờng có manitol 3%, sau 8 tuần bảo quản sự tăng trởng chiều cao cây khoai tây in vitro rất thấp, chỉ đạt từ 1,35cm - 2,05cm tuỳ theo từng giống, nhng số lá thì vẫn đạt cao, dao động từ 5,8 lá - 6,8 lá, trạng thái chồi vẫn đảm bảo tốt, không có biểu hiện già hoá. * Nh vậy chúng tôi nhận thấy, tác nhân là nhiệt độ thấp (6 o C) hoặc manitol 3% đều có khả năng làm chậm sinh trởng đáng kể của cây khoai tây in vitro sau 8 tuần bảo quản, đồng thời đảm bảo trạng thái tốt. Tác nhân là saccaroza 5% hoặc glucoza5% cũng có hiệu quả làm chậm sinh trởng nhng không cao và trạng thái chồi kém, cây bị già hoá. Sau 8 tuần bảo quản cây khoai tây ở môi trờng có saccaroza 5% hoặc glucoza5% đều đủ tiêu chuẩn cấy chuyển. Vì vậy, thời gian tiếp theo chỉ tiến hành theo dõi với hai tác nhân là nhiệt độ thấp và môi trờng có manitol. 3.3. Đánh giá hiệu quả của các tác nhân làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro ở giai đoạn sau 12 tuần bảo quản Số liệu theo dõi sự sinh trởng phát triển cây khoai tây in vitro sau 12 tuần bảo quản ở công thức sử dụng tác nhân nhiệt độ thấp 6 o C và manitol 3% làm chậm sinh trởng của cây khoai tây in vitro đợc trình bày trên bảng 4. Bảng 4 : ảnh hởng của tác nhân nhiệt độ thấp 6 o C và manitol 3% đến khả năng làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro sau 12 tuần bảo quản Tác nhân làm chậm sinh trởng Tên giống Nhiệt độ thấp 6 o C Manitol 3% Chiều cao (cm) Số lá/cây - TTchi Chiều cao (cm) Số lá/cây - TTchi Ma 4,87 3,8 - Tốt 2,52 6,5 - Tốt Di 4,75 3,2 - Tốt 3,00 6,8 - Tốt Số 3 5,76 4,1 - Tốt 2,10 7,1 - Tốt Sl 5,12 5,2 - Tốt 3,12 7,0 - Tốt Sn 6,43 3,5 - Tốt 2,45 6,9 - Tốt Po 5,92 3,7 - Tốt 2,30 6,3 - Tốt Qua bảng 4 chúng tôi nhận thấy khả năng làm chậm sinh trởng của tác nhân nhiệt độ thấp 6 o C và manitol 3% là rất cao. Cây khoai tây của các giống nghiên cứu sau 12 tuần bảo quản có sự sinh trởng thấp nhng vẫn đảm bảo trạng thái sinh trởng tốt. - Trong điều kiện nhiệt độ thấp, sau 12 tuần bảo quản, cây khoai tây có chiều cao dao động từ 4,75 cm - 6,43cm với số lá từ 3,2 lá - 5,2 lá tuỳ theo từng giống nghiên cứu. Trạng thái cây tốt. - Trong môi trờng có manitol 3%, sau 12 tuần bảo quản, cây khoai tây có chiều cao từ 2,1 cm - 3,12 cm với số lá từ 6,3lá - 7,1 lá tuỳ theo từng giống nghiên cứu. Trạng thái cây tốt. * Nh vậy, chúng tôi nhận thấy, sau 12 tuần bảo quản tác nhân nhiệt độ thấp 6 o C và tác nhân manitol 3% đều có hiệu quả làm chậm sinh trởng rất cao. Đặc biệt, trong điều kiện nhiệt độ thấp 6 o C và manitol 3%, đã làm chậm đáng kể về chiều cao cây nhng số lá lại giảm không nhiều. Điều này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho cây khi phục hồi sinh trởng. 4. Kết luận + Sử dụng tác nhân : nhiệt độ thấp 6 o C , saccaroza 5% , glucoza 5% hoặc manitol 3% đều làm chậm khả năng sinh trởng của cây khoai tây in vitro của tất cả các giống nghiên cứu so với đối chứng. Cây khoai tây ở công thức đối chứng sau 4 tuần đã ở mức sinh trởng phải cấy chuyển. + Tác nhân saccaroza 5% và glucoza 5% có khả năng làm chậm sinh trởng kém hơn so với tác nhân nhiệt độ thấp 6 o C và manitol 3%, sau 8 tuần bảo quản cây khoai tây của các giống nghiên cứu đều sinh trởng ở mức cần cấy chuyển môi trờng. Đồng thời trạng thái chồi cũng kém, đạt mức từ trung bình đến xấu, có biểu hiện già hoá. + Tác nhân nhiệt độ thấp 6 o C và manitol 3% có khả năng làm chậm đáng kể sự sinh trởng của cây khoai tây in vitro. Sau 12 tuần bảo quản cây vẫn duy trì mức sinh trởng thấp và trạng thái cây vẫn tốt. Trong đó, tác nhân manitol có hiệu quả làm chậm sinh trởng tốt hơn. Tài liệu tham khảo 1.PGS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Hồ Hữu Nhị, PGS.TS. Lê Thị Muội, 1997. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 154- 163 2. . G.Mix-Wager,1996 Cryopreservation an alternative for the long term storage of old potato varienties. pp 507-513 . cây khoai tây in vitro. Tuy nhiên, việc " ;Đánh giá hiệu quả của các tác nhân sử dụng trong kỹ thuật duy trì sinh trởng chậm cây khoai tây in vitro& quot; là cần thiết, trên cơ sở đó áp dụng. manitol 3%) và nhóm sử dụng nhiệt độ thấp làm giảm khả năng sinh trởng cây khoai tây in vitro. Hiệu quả của các tác nhân làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro sẽ có tác dụng làm kéo dài thời. trờng. Vì vậy các giai đoạn bảo quản tiếp theo chỉ theo dõi các công thức có tác nhân làm chậm sinh trởng. 3.2. Đánh giá hiệu quả của các tác nhân làm chậm sinh trởng cây khoai tây in vitro ở giai