TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. NGUYỄN THỊ THU HẰNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt một Luận văn tốt nghiệp thì mỗi một sinh viên đều phải trãi qua những khó khăn và vất vả. Tuy nhiên, những khó khăn đó không gây trở ngại cho quá trình làm luận văn của tôi. Vì đã được sự giúp đỡ cũng như động viên của gia đình, thầy cô và bạn bè trong suốt thời gian thực hiện đề tài của mình. Nhân đây tôi xin được gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: Gia đình và người thân của tôi đã ủng hộ rất nhiều về mặt tinh thần cũng như vật chất cho quá trình thực tập. Cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô và các anh chị trong bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên cũng như giúp đỡ tôi khi thực hiện đề tài và trong suốt quá trình học tập tại trường. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện trên 8 chủng A. hydrophila phân lập trên cá tra bệnh xuất huyết và tất cả vi khuẩn đã được định danh đến loài. Đề tài được thự hiện thông qua 3 nội dung: (i) kiểm tra kháng sinh đồ với các kháng sinh Amoxycillin (AMX, 25µg), Ciprofloxacin (CIP, 5µg), Colistin (CS, 50µg), Doxycycline (DO, 30µg), Florfenicol (FFC, 30µg), Oxolinic acid (OA, 2µg), Streptomycin (S, 10µg), Norfloxacin (NOR, 10µg), (ii) xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh streptomycin và (iii) ly trích plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy có 7/8 chủng kháng với amoxicillin, 7/8 mẫn cảm với ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin. Với kháng sinh colistin có 2/8 chủng nhạy trung bình và 6/8 mẫn cảm với kháng sinh này. Kháng sinh oxolinic acid có 3/8 kháng, 5/8 mẫn cảm. Kháng sinh norfloxacin có 1/8 kháng, 1/8 trung bình nhạy, 6/8 mẫn cảm. Từ kết quả kiểm tra kháng sinh đồ chọn ra 1 loại kháng sinh (streptomycin) mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh trên vi khuẩn A. hydrophila. Qua đó cho thấy, đa phần các chủng cho kết quả mẫm cảm với streptomycin với giá trị MIC dao động từ 4-16ppm. Chỉ duy nhất 1 chủng kháng với streptomycin ở nồng độ 256ppm. Bên cạnh đó, để tìm hiểu với những kết quả kháng thuốc trên của A. hydrophila thì chúng có kiểu plasmid như thế nào. Đề tài đã tiến hành ly trích và diện di plasmid của 8 chủng A. hydrophila. Kết quả chỉ phát hiện được plasmid của 2 chủng: CA1.2T và CA1.3TT. Chúng có kiểu plasmid khác nhau, biểu hiện hai vạch không tương đồng nhau. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH V CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1 Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu đề tài 2 1.3 Nội dung đề tài 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 3 2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) 5 2.3 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL . 6 2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc 8 2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9 2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9 2.5.2 Khái niệm kháng sinh 9 2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản 9 2.6 Sơ lược về plasmid ở vi khuẩn. 12 2.6.1 Các loại plasmid 13 2.6.2 Plasmid tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào 13 2.6.3 Plasmid có khả năng vận chuyển gen 14 2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid. 14 2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 16 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 3.2.2 Dụng cụ 16 3.2.3 Thiết bị 16 3.2.4 Hóa chất và môi trường 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn 17 3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ 17 3.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 19 3.3.4 Phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn (Bartie, 2004) 20 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 21 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22 4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 26 4.3 Kết quả ly trích plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 28 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ 18 Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng) 20 Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 23 Hình 4.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên môi trường NA 22 Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22 Hình 4.3: Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 23 Hình 4.4: Kết quả MIC của streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila 27 Hình 4.5: Kết quả MIC ở nồng độ 256ppm (mũi tên) 28 Hình 4.6: Kết quả điện di trên 8 chủng Aeromonas hydrophila 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong các loài cá da trơn có kích thước lớn nhất trong họ Pangasiidae phân bố ở hạ lưu sông Mê Kông. Vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống nuôi cá tra ở quy mô nông hộ từ lâu đời. Những thành công trong sản xuất giống nhân tạo vào những năm 1990 đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi cá tra, trở thành nghề công nghiệp ở nhiều nơi như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long v.v… (Dương Nhựt Long, 2003). Sản phẩm cá tra nuôi được chế biến đa dạng và xuất khẩu nhiều nước trên thế giới. Thị trường tiêu thụ được mở rộng góp phần rất lớn trong việc phát triển công nghiệp nuôi cá tra hiện nay. Diện tích nuôi càng mở rộng, năng xuất nuôi và sản lượng cá tra hàng năm tăng lên rất đáng kể. Cụ thể năm 2006 sản lượng cá tra là 825.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu là 736.872.115 USD (Vũ Văn Dũng, 2007). Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển đó thì người nuôi cá tra ở ĐBSCL cũng gặp không ít những khó khăn trở ngại. Trở ngại đầu tiên là việc phát triển diện tích nuôi thủy sản với tốc độ nhanh đang phá vỡ quy hoạch vùng nuôi thuỷ sản an toàn, gây ô nhiễm môi trường làm phát sinh dịch bệnh. Khó khăn lớn nhất mà người nuôi gặp phải là tình hình dịch bệnh, làm giảm năng xuất và sản lượng nuôi. Thêm vào đó việc nuôi cá tự phát, không kiểm soát trong những năm gần đây, người nuôi luôn gia tăng mật độ trong khi trình độ kỹ thuật còn hạn chế. Chất thải ao nuôi thải trực tiếp ra môi trường đã tạo điều kiện cho mầm bệnh phát triển, nhất là bệnh vi khuẩn chiến đa số và xuất hiện với tần xuất cao. Trong đó, bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila gây ra chiếm tỉ lệ khá cao. Mặc khác, do bệnh trên cá nuôi xuất hiện ngày càng nhiều: Xuất huyết, phù đầu, gan thận mủ,…và việc diễn biến phức tạp của bệnh đã khiến người nuôi sử dụng rất nhiều loại kháng sinh, hóa chất với nồng độ không ngừng gia tăng (Nguyễn Quốc Thịnh, 2004−2006). Từ những nguyên nhân đó đã làm cho tình hình dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp. Tạo nên dòng vi khuẩn kháng thuốc làm cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn và trở ngại. Theo kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2005), trong 196 dòng vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở ĐBSCL (có cả Aeromonas) hầu hết cho kết quả kháng thuốc và có 34% kháng nhiều loại kháng sinh. Với giá trị MIC có 91 % các dòng vi khuẩn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 thử nghiệm có giá trị rất cao (dao động 512 đến ≥1.024ppm). Bên cạnh đó, thì việc kháng thuốc ở vi khuẩn một số còn có liên quan đến việc hình thành plasmid kháng thuốc (R-plasmid) của chúng (Trần Thị Thanh, 2000; Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007 và Saitanu et al., 1994). Tuy nhiên, những thông tin về việc hình thành plasmid kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản ở ĐBSCL còn cần nhiều nghiên cứu để góp phần tìm hiểu rõ hơn những plasmid kháng thuốc ở vi khuẩn. Từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Nhằm tìm hiểu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 1.3 Nội dung đề tài − Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn Aeromonas hydrophila. − Xác định kiểu plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng sông Cửu Long Cá tra là loài có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, mật độ nuôi cao và oxy hòa tan thấp (Dương Nhựt Long, 2003). Tuy nhiên, chúng vẫn bị một số bệnh do vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Sự hiện diện của những bệnh này đã làm giảm năng xuất và sản lượng cá nuôi rất lớn, gây nhiều thiệt hại cho người nuôi cá tra thâm canh ở ĐBSCL. Những năm 1999-2000, 2002-2003 cá tra bị bệnh, chết nhiều với các biểu hiện: xuất huyết ở miệng và hầu, nổ mắt, thận sưng và có những đốm trắng (Nguyễn Chung, 2008). Đặc biệt vào đầu năm 2006 trên sông Tiền và sông Hậu xảy ra hiện tượng cá tra chết hàng loạt, với đa số có biểu hiện xuất huyết và gan thận có nhiều đốn trắng (Hà Văn và Bình Nguyên, 2006). Trước đây, bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (gan thận mủ) gây ra trên cá tra nuôi ở ĐBSCL đã được Ferguson et al., (2001) phát hiện là xuất hiện đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1998 đã gây nhiều thiệt hại cho nghề nuôi cá nơi đây. Hiện nay những bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra gồm ký sinh trùng như: Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus, nấm thủy mi, trùng quả dưa (Ichthyophthyrius), trùng mỏ neo (Lerneae), rận cá (Argulus), trong đó hai loài gây thiệt hại nhiều nhất là Trichodina và Dactylogyrus. Bệnh vi khuẩn như: Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, A. sobria, Edwardsiella ictaluri, E. tarda, Pseudomonas sp,…Trong đó hai loài gây thiệt hại nhiều nhất là Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết và Edwardsiella ictaluri tác nhân gây bệnh mủ gan (Trần Anh Dũng, 2005). Bên cạnh những bệnh ký sinh trùng trên thì trong một số nghiên cứu của Nguyễn Quang Hưng (2001), Cao Tuấn Anh (2005) về bệnh ký sinh trùng trên cá tra giống cũng có các bệnh tương tự là Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus, Ichthyophthyrius… Ngoài ra, theo kết quả khảo sát của Huỳnh Cẩm Tú (2006), thì có thêm một số giống loài ký sinh trùng như: Epistylis sp, Protoopalina sp, trong đó Trichodina và Dactylogyrus xuất hiện thường xuyên và chiếm tỉ lệ cao. Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2004), vào năm 2004 bệnh phù đầu có tần suất xuất hiện nhiều nhất, chiếm (60%). Đây là loại bệnh nguy hiểm, tốn nhiều chi phí cho PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn) , của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các siêu vi (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên, 2007) 2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản Nhóm ß-lactamin Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn Gram dương và một số ít vi khuẩn Gram âm, là kháng sinh... 1993) Nhóm gây bệnh thường gặp là A hydrophila, A sobria và A caviae, được phát hiện đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) Kế đến trong các nghiên cứu sau này trên cá chép của Schaperclaus (1930), phân lập được vi khuẩn A hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh cho cá (Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993) Ngoài ra, A hydrophila còn là tác nhân thứ cấp gây bệnh tuột... bào vi khuẩn khác nhờ vào các sợi nhung mao hình ống trên bề mặt của vỏ tế bào vi khuẩn, do plasmid F hình thành (Trần Thị Thanh, 2000) v Plasmid mang tính kháng (Resistance-(R) plasmid) , mang các gen có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hay chất độc v Col -plasmid, chứa các gen mã hóa cho sự tổng hợp colchicine, một protein có thể giết chết các vi khuẩn khác v Plasmid phân hủy, giúp phân hủy các... 2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid Các tính trạng đọc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào chủ ưu thế sinh trưởng và nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc Plasmid kháng: Đáng chú ý là các vi khuẩn thể hiện tính đa kháng thuốc được truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua tiếp xúc tế bào đơn giản Ngày nay ta đã biết các gen của plasmid- R giúp cho vi khuẩn chủ kháng với sunphonamit,... bởi bệnh ký sinh trùng chiếm 11,3% và bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ và bệnh phù đầu chiếm không quá 7% Hầu như các tỉnh nuôi cá tra ở ĐBSCL đều phải đương đầu với bệnh xuất huyết, gan thận mủ, vàng da, ký sinh trùng… Nhưng bệnh trên cá tra thường xuất hiện nhiều ở những vùng có diện tích nuôi cá tra lớn như An Giang, huyện Thốt Nốt, Phụng Hiệp của tỉnh Cần Thơ… (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Tổng diện tích nuôi cá tra. .. tụ dịch loãng, gây thiếu máu và tổn thương các cơ quan như gan, thận Đặc điểm bệnh do Aeromonas gây ra là làm cho động vật mắc bệnh xuất huyết, hình thành các vết đỏ trên cơ thể, lở loét ở da và các vết loét này ngày càng lan rộng ra trên bề mặt da, các cơ quan hoặc ăn sâu vào bên trong cấu trúc mô Tùy vào đối tượng nuôi, nhóm vi khuẩn gây bệnh và giai đoạn bệnh mà có những biểu hiện bệnh lý khác nhau... điều tra của Huỳnh Văn Quang (2008), cũng cho thấy có hai loại bệnh thường xuyên xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng trong quá trình nuôi của các hộ nuôi cá tra là bệnh gan thận mủ và xuất huyết Theo thống kê cho thấy, hai loại bệnh này xuất hiện hầu như quanh năm Mức độ thiệt hại của bệnh gan thận mủ thường cao hơn bệnh xuất huyết, bình quân mức thiệt hại của gan thận mủ là 33,4% tuyến sông Tiền và. .. kanamixin và tetraxiclin Một số plasmid- R cho tính kháng với 8 kháng sinh, số khác kháng với kim loại nặng, độc Các plasmid- R thường là tiếp hợp hoặc có thể huy động Có 2 cơ chế kháng kháng sinh: kháng do plasmid đọc mã và kháng do nhiễm sắc thể đọc mã Chẳng hạn, tính kháng streptomycin do nhiễm sắc thể dựa vào sự thay đổi của hạt riboxom 30S Trái lại, tính kháng streptomycin do plasmid lại dựa vào sự... hiện nay thì vi c lập kháng sinh đồ khi sử dụng thuốc kháng sinh trị bệnh cá, tôm là rất cần thiết 4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Qua kết quả kháng sinh đồ chọn ra các loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh với vi khuẩn A hydrophila Do giới hạn của đề tài nên chỉ xác định giá trị MIC của streptomycin với vi khuẩn A hydrophila. .. xuyên trong quá trình nuôi trị bệnh do vi khuẩn gây ra Từ đó, cho thấy kháng sinh streptomycin vẫn còn khả năng khống chế vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá Mặc khác, chúng ta có thể nhận định rằng vi c kháng một loại kháng sinh, hay giá trị MIC xác định của một loại kháng sinh nào đó có liên quan đến mức độ và vi c thường xuyên sử dụng kháng sinh đó để trị bệnh cho đối tượng nuôi 1 2 3 . vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề. TẮT Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện trên 8 chủng A. hydrophila. NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH