TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Sinh viên thực : Đinh Hoàng Yến Lớp : K55 - CNSHB Mã sinh viên : 550513 Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thành Trung Hà Nội, 2012 Bài g r o i ion I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên giải thích nguyên lý phương pháp sắc ký lọc gel sắc ký trao đổi ion - Biết cách chuẩn bị gel, làm sắc ký - Biết cách xây dựng đồ thị nồng độ thành phần protein mẫu – h ng h r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): chung: - Sắc ký họ kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách chất hỗn hợp tiến hành lần đầu nhà thực vật học người Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) vào năm 1903 ông nghiên cứu chlorophyll - Sắc ký trao đổi ion phương pháp sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh hợp chất có khả trao đổi ion (gọi ionit) - Sắc ký trao đổi ion phân loại dựa chế trình tách: lực khác ion dung dịch (pha động) với trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) chất rắn (pha tĩnh) - Đây phương pháp sử dụng nhiều phịng thí nghiệm Hóa sinh.Theo thống kê nhất, IEC kỹ thuật tách protein sử dụng nhiều quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%; sắc ký lực (AC): 60%; sắc ký lọc gel (GF): 50% trường hợp - Trước tiên, chất cần phân tích gắn thuận nghịch với chất trao đổi tương tác ion nhóm mang điện tích trái dấu - Sau đó, ion trao đổi chiết rút riêng biệt phương pháp rửa giải rửa đẩy Có thể tách chiết cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến nhóm tương tác chất phân tích bị điện tích b) : - Cơ sở IEC cạnh tranh nhóm tích điện trái dấu chất trao đổi ion chất cần tách với ion khác - Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, ion cần tách liên kết với chất trao đổi Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, ion cần tách rời - Nguyên tắc tách trực tiếp (căn khác biệt điện tích) - Tại điểm pH trừ điểm đẳng điện, protein có mang điện tích tương ứng với điểm pH Dựa vào điện tích thực chúng điểm pH định, ta phân tách hỗn hợp protein Trong phương pháp này, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethylcellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích ngồi cột theo độ lớn điện tích c) - Có độ phân giải cao - Đa dạng - Dễ dàng tiến hành g (Gel-Filtration Chromatography): Phương pháp tốt phương pháp dựa vào kích thước phân tử Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer khơng tan có tính hydrate hóa cao dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide Sephadex, Sepharose, Biogel loại gel phổ biến thị trường có sẵn hạt có lỗ với đường kính chuẩn 100µm (0,1mm) Những phân tử nhỏ bên lẫn hạt, phân tử lớn bên ngồi hạt Vì vậy, phân tử có kích thước lớn cột chảy nhanh trước Phân tử có kích thước trung bình, vào bên hạt rời khỏi cột vị trí giữa; cịn phân tử nhỏ phải qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sau i Đây phương pháp hiệu ứng dụng rộng rãi việc tinh protein Kỹ thuật dựa lực cao nhiều protein với nhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, loại protein thực vật, tinh cho qua cột mang phân tử glucose liên kết cộng hóa trị Concanavalin A gắn vào cột có lực cao với glucose, protein khác khơng Concanavalin A tách giải khỏi cột ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đường dung dịch gắn với Concanavalin A thay phân tử glucose nối với cột Sắc ký lực công cụ hữu hiệu việc tách yếu tố phiên mã, protein điều hòa biểu gen thơng qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa trình tự DNA đặc hiệu gắn vào thể mang; protein có lực cao với trình tự DNA bắt vào trình tự giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã phóng thích rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, người ta dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể để tinh kháng nguyên hay kháng thể Nhìn chung, sắc ký lực dùng để tách protein vốn có khả nhận biết nhóm X nối cộng hóa với nhóm hay chất dẫn xuất gắn cột, sau nạp hỗn hợp protein vào cột, cột rửa lại để loại bỏ protein không tạo nối, cuối tách giải protein mục tiêu dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết Sắc ký lực phương pháp tinh hiệu tương tác protein phân tử dùng mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao ỏng o : Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp dạng mở rộng kỹ thuật sắc ký cột có khả phân tách protein cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn có phân chia rõ ràng có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả phân tách tăng lên đáng kể Bởi cột làm từ vật liệu mịn nên phải có áp lực tác động lên cột để có tốc độ chảy thích hợp Kết thực có phân giải cao phân tách nhanh C h ng h h Sắc ký k nước, sắc ký đảo pha, sắc ký đẳng điện, sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký màng, sắc ký mở rộng III – h ng h g r o i ion: Sự tinh protein quan trọng thực nhiều phương pháp khác Trong đó, sắc kí phương pháp phân tách quan trọng sinh học phân tử thích hợp với nhiều loại hợp chất sản phẩm tinh sử dụng cho việc định lượng định danh Có nhiều phương pháp sắc kí sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lực… g (Gel-Filtration Chromatography): Là kỹ thuật sắc ký cột dùng phổ biến tách chiết tinh protein Sắc kí lọc gel gọi phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel Cơ sở phương pháp lọc gel dựa khác kích thước, hình dạng phân tử lượng protein enzyme có hỗn hợp để tách chúng Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme, khơng hịa tan tương đối bền với yếu tố học sinh học Ngồi chất sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải chất khơng có tính đàn hồi (không co) phải chất ưa nước Gel sephadex chất thỏa mãn yếu tố Phương pháp lọc phân tử sephadex tiến hành sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài cân dung dịch đệm có pH định Sau cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc chiết dung mơi thích hợp, phân tử nhỏ (ở muối) khuếch tán chậm chạp qua lỗ nhỏ hạt sephadex bị trương phồng, cịn chất có khối lượng phân tử lớn (ở trường hợp protein enzyme) khơng có khả vào mà lách nhanh qua hạt shephadex chiết nhanh khỏi cột Vì vậy, ta tách chất có khối lượng phân tử cao thoát khỏi cột gel trước so với chất có khối lượng phân tử nhỏ h ng h í r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): Dựa vào khác điện tích tổng số protein enzyme, hay phương pháp dựa sở phản ứng trao đổi ion protein tan nước dung dịch đệm loãng tác nhân trao đổi ion Tác nhân trao đổi ion chất nhựa có tích nhóm sinh anion chất cation Đây chất giá trơ, khơng tan trịn nước, có chất cellulose chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) chất nhựa polistirol Chất giá thể thường kết hợp với nhóm ion hóa Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, chất ionit nói trở nên tích điện Vì bề mặt lớp chất giá hình thành lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học Nếu thêm protein enzyme vào dung dịch đệm phân tử protein enzyme mang điện tích bị nhóm tích điện trái dấu chất trao đổi ion kéo lại Khi dùng dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác thêm loại ion khác có lực ion lớn phân tử protein enzyme bị đẩy khỏi chất trao đổi ion Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào ion Na+ Cl- NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient Các phân tử protein enzyme có điện tích tổng số nhỏ bị đẩy trước lực liên kết với chất trao đổi ion yếu Còn protein enzyme có liên kết với ionit lớn bị đẩy lực ion muối lớn Như vậy, cách này, tách phần loại protein enzyme Việc tách phần có lựa chọn tốt tăng dần nồng độ ion thay Nhờ nồng độ ion muối tăng dần (gradient) người ta rút từ cột loại protein enzyme khác Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau qua cột máy thu phân đoạn tự động Theo thứ tự phần dịch thu được, người ta tiến hành định lượng protein theo phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ xác định đoạt hoạt độ enzyme IV – Tiến hành hí nghiệm C dung dị h ệm: - Đệm phosphate 0.1M, pH 7.5 - Dung dịch NaCl 2M (dung dịch gốc) dùng để pha nồng độ muối 0.1M, 0.25M, 0.5M, 1M (pha loãng đệm phosphate) Chuẩn bị gel: - Cân 6g sephadex G75 ngâm 60 ml đệm phosphate (dùng cho sắc kí lọc gel) - Cân 8g DEAE sephadex A 25 ngâm 500ml đệm phosphate ( lượng đệm sử dụng để ngâm gấp 10 lần thể tích nở được) (dùng cho sắc kí trao đổi ion) - Làm nở gel nhiệt độ thường ủ 1- ngày 2h 100ºC hấp 121ºC 30 phút Bảo quản nhiệt độ từ 4- 25ºC Nhồi ộ g Rửa tráng cột dựng cột thẳng đứng giá Tráng qua cột đệm đóng khóa phía cột Khuấy nhẹ hòa gel đổ từ từ vào cột (cần ý tránh tạo bọt gel gel phân lớp không đồng nhất), để gel lắng lúc Mở khóa để đệm chảy để gel lắng tác dụng áp suất cột Tiếp tục đổ gel vào cột thể tích mong muốn C n ng g (equilibration): Sau nhồi xong cột gel phải cân lại, với gel sắc kí lọc gel cân bằng đệm phosphate, với sắc kí trao đổi ion cân bằng đệm phosphate có bổ sung NaCl Cho đệm chảy từ từ vào cột, tháo van để dung dịch đệm cân G n m u ên ộ (Binding): Sử dụng mẫu protein nấm mốc tủa ethanol Cho lớp dịch đệm chảy đến sát mặt gel Dùng pipet hút mẫu cần tách cho từ từ vào cột T h rử ộ ( u ion) Với sắc kí lọc gel: Cho đệm phosphate chảy qua từ từ thu phân đoạn protein (từ 1- ml) đến OD280 dịch rửa khoảng thấp khơng thay đổi nhiều khơng phải tách rửa Với sắc kí trao đổi ion: Cho đệm phosphate có bổ sung muối NaCl với gradient nồng độ 0,1M, 0,25M, 0,5M, 1M 2M nồng độ NaCl cho chạy ½ thể tích cột (khoảng 20ml) chảy qua từ từ tốc độ khoảng 25ml/h đến OD280 dịch rửa khoảng thấp không thay đổi nhiều khơng phải tách rửa Thu liên tục dịch chảy phân đoạn vào ống nghiệm nhỏ ống thu  ml Tiến hành đo OD280 từ ống thu Từ kết thu (OD280) phân đoạn, tiến hành vẽ đồ thị, xác định phân đoạn có nồng độ protein cao đem xác định số hoạt tính sơ hoạt độ T i inh g (r g n r ion) Với sắc kí lọc gel cho rửa đệm phosphate Với sắc kí trao đổi ion: Phụ thuộc vào chất mẫu, tái sinh thường rửa đệm ion mạnh (ví dụ: NaCl 1M 2M) hoặc/ giảm tăng pH, theo đệm sử dụng cân gắn mẫu Trong số trường hợp cần phải rửa cột ethylene glycol ethanol Bảo quản Khi không sử dụng thêm 0,05% NaN3 vào cột gel bảo quản 4- 8ºC C yếu ảnh h ng ến ế - Độ dài cột sắc ký - Tổng thể tích cột gel - Tốc độ dịng chảy - Bản chất hạt gel - Nồng độ cột gel phân bố hạt gel cột - Độ dài cột sắc ký - Môi trường pH cột - Sự phân bố điện tích bề mặt protein - Bản chất ion dung dịch - Các chất thêm vào như: dung môi hữu cơ… - Đặc tính chất trao đổi IV – Kế hí nghiệm g Ống nhỏ OD280 (A) 0,066 0,076 0,108 0,048 0,026 0,026 0,020 0,024 0,018 10 0,020 11 0,194 Ống nhỏ 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 OD280 (A) 0,038 0,034 0,062 0,056 0,076 0,122 0,134 0,190 0,220 0,256 0,278 Ống nhỏ 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 OD280 (A) 0,334 0,322 0,294 0,286 0,252 0,238 0,218 0,238 0,244 0,264 0,158 12 13 14 15 0,040 0,046 0,028 0,076 27 28 29 30 0,308 0,326 0,338 0,326 42 43 0,162 0,166 Đồ thị nồng độ protein sắc ký lọc gel 0.400 0.350 OD 280 (A) 0.300 0.250 0.200 OD280 (A) 0.150 0.100 0.050 0.000 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ống nghiệm r o i ion Ống nhỏ OD280 (A) 0,272 0,110 0,112 0,106 0,126 0,482 0,067 0,241 0,123 10 0,066 11 0,002 12 0,005 13 0,046 14 0,041 15 0,021 Ống nhỏ 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 OD280 (A) 0,028 0,020 0,041 0,116 0,106 0,120 0,128 0,158 0,106 0,101 0,096 0,088 0,290 0,109 0,155 Ống nhỏ 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 OD280 (A) 0,212 0,210 0,195 0,192 0,294 0,070 0,223 0,191 0,163 0,208 0,099 0,133 Đồ thị nồng độ protein sắc ký trao đổi ion 0.600 OD 280 (A) 0.500 0.400 0.300 OD280 (A) 0.200 0.100 0.000 10 15 20 25 30 35 40 45 Ống nghiệm V – Nhận xé , Trong g - Ta thấy có đỉnh nhọn protein, có đỉnh đầu khả phân tách tốt - Phần đáy không trùng với điểm không, chứng tỏ có mẫu khơng đồng loại protein - Ở ống 29, 30, 31, giá trị đo ống 30 nhỏ với ống 29 31, lỗi máy đo Trong r o i ion - Ta thấy có đỉnh protein, đỉnh đầu độ phân tách tốt - Chỉ có ống nghiệm 11 12 giá trị OD280 gần với giá trị nhất, nồng độ protein gần - Từ ống nghiệm thứ 13 trở giá trị đo OD lên xuống khơng cịn theo quy luật Ngun nh n - Trong q trình thí nghiệm, cột sắc ký chuẩn bị không tốt - Protein cịn lẫn tạp - Dịng chảy protein ngồi khơng - Khi để protein chảy nhanh ngồi dễ lẫn protein với - Máy đo OD có khả sai sót thơng số - Nồng độ protein ống nghiệm phân bố không nên đo OD giá trị nhiều lúc thay đổi 10 Bài X ịnh nồng ộ ro in ng h ng h h nh u (Biur , Lowry, Br dford) I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên biết giải thích nguyên lý phương pháp xác định nồng độ protein khác - Xây dựng đồ thị đường chuẩn phương pháp khác - Biết cách xác định hàm lượng protein dựa vào đồ thị đường chuẩn II – Định ợng nồng ộ ro in ng h ng h Biur : Phương pháp Biuret phương pháp đơn giản để định lượng protein Phương pháp nhạy cảm với thành phần amino acid protein Độ nhạy số tương đối cố định từ protein đến protein khác Do tiến hành đơn giản cho kết nhanh chóng, sử dụng để định lượng protein chiết xuất thơ với khoảng nồng độ lớn Ngồi ra, phương pháp cịn sử dụng để xác định nồng độ protein trình tinh Nguyên lý dựa liên kết ion đồng (Cu2+) với peptide protein môi trường kiềm để tạo thành màu tím hay xanh tím có độ hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm Cường độ màu phản ứng tỷ lệ thuận với số lượng liên kết peptide (- CO – NH -) chuỗi polypeptide Hó hấ : - Thuốc thử Biuret: 1.5 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 H2O) 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6 H2O) Hòa tan 500 ml nước cất Thêm 300 ml NaOH 10% Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất đến thể tích lít Bảo quản lọ tối - Cân 100 mg BSA (albumin huyết bị) hồ tan 10ml nước, ta dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml Bảo quản 4ºC Chỉ dùng tuần Lậ thị ờng chuẩn: Lấy ống nghiệm, đánh số từ – 6, cho chất tham gia phản ứng vào ống nghiệm bảng sau: Bảng : Lập đồ thị đường chuẩn BSA BSA 10 H2O Thuốc thử Nồng độ protein STT mg/ml (ml) Biuret (ml) (mg/ml) ml 0.0 1.0 0.2 0.4 4 0.6 0.4 0.8 0.2 11 1.0 0.0 10 Lắc đều, để yên ống nghiệm 20 phút nhiệt độ phịng Sau đo mật độ quang bước sóng 540 nm Giá trị OD540 ống nghiệm từ – sau trừ giá trị OD540 ống xây dựng đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (BSA) (Đồ thị đường chuẩn) X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Biur : Enzyme ngoại bào tách chiết từ nấm mốc nuôi môi trường xốp 10g mẫu (cả môi trường nấm mốc) cho vào ống falcon 45ml 30ml nước cất vô trùng, vortex, ly tâm 4000 vòng/phút 30 phút lấy dịch Tiếp tục lọc dịch giấy thấm Thu 26 ml dịch chiết enzyme ngoại bào Bảo quản - 20°C Cho vào ống nghiệm ml dung dịch mẫu ml thuốc thử Biuret, lắc đề, để yên 20 phút nhiệt độ phịng, dung dịch có màu xanh Do OD bước sóng 540 nm Lấy giá trị OD540 mẫu trừ OD540 ống nghiệm thay mẫu nước cất chiếu vào đồ thị chuẩn để suy lượng protein có dung dịch mẫu D ng hị ờng huẩn Nồng độ protein (mg/ml) OD540 0.003 0.012 0.024 0.034 10 0.039 Đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret) y = 0.0047x - 0.0058 R2 = 0.9848 0.05 OD540 0.04 0.03 0.02 OD540 0.01 Linear (OD540) 10 Nờng đợ protein (mg/ml) 12 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret): y = 0,0047x - 0,0058 Trong đó: x: nồng độ protein (mg/ml) y: giá trị OD540 (A) Kế hí nghiệm - Các mẫu pha loãng lần trước đo OD Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD540 (A) 0,310 0,311 0,322 Nồng độ protein (mg/ml) 134,383 134,809 139,489 Nồng độ protein (µg/ml) 134383 134809 139489 Nhận xét: - Giá trị OD540 mẫu vượt xa giá trị OD540 đường chuẩn nồng độ protein có nhờ tính tốn khả xác khơng cao III – Định ợng nồng ộ protein b ng h ng h Lowry: Phương pháp định lượng protein Lowry phương pháp sử dụng rộng rãi để xác định xác nồng độ protein Phương pháp kết hợp phản ứng Biuret phản ứng Folin-Ciocalteau Bước đầu phản ứng, protein liên kết với ion đồng môi trường kiềm Bước tiếp theo, phức chất đồng-protein (chủ yếu protein chứa amino acid nhóm tryptophan tyrosine) khử hỗn hợp phosphomolipden – phosphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 660nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu Hó hấ : - Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) 20g Na2CO3 (2%) pha 1000 ml nước cất - Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha dung dịch Natri Citrate (1%) dung dịch Natri Kali Tartrate 1% - Dung dịch C: Hỗn hợp hai dung dịch A B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước dùng) - Thuốc thử Folin – Ciocalteu Merck, trước dùng pha lỗng để có nồng độ N - Albumin huyết bò (BSA) 1mg/ml X y d ng ờng huẩn B A Hàm lượng protein tan dung dịch xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết bò (BSA) làm chất chuẩn 13 Cân 0,01g (10mg – albumin huyết bị) hồ tan 10ml nước, ta dung dịch gốc có nồng độ 1mg/ml Sau pha lỗng dung dịch gốc nước cất với nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn BSA (1 mg/ml) H2O Nồng độ protein STT (µl) (ml) (µg/ml) 20 0.98 20 40 0.96 40 60 0.94 60 80 0.92 80 100 0.90 100 120 0.88 120 - Mẫu thí nghiệm: lấy xác 0,5ml dung dịch BSA nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 2ml dung dịch C để nhiệt độ phòng 10 phút, sau cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm - Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C bước tiến hành mẫu thí nghiệm Qua lần lặp lại thí nghiệm xây dựng đường hồi quy Kết xử lý theo phương pháp thống kê thông thường X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Lowry: Sử dụng enzyme ngoại bào nấm mốc phương pháp Biuret Thay lấy 0.5 ml dung dịch BSA chuẩn, lấy 0.5 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm Các bước làm tương tự cách xây dựng đồ thị chuẩn trình bày Ghi lại giá trị OD660 L u Để đảm bảo độ xác, hàm lượng protein mẫu lớn cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp nước cất trước định lượng Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu D ng hị ờng huẩn Nồng độ protein (µg/ml) OD660 20 0.060 40 0.105 60 0.153 80 0.173 100 0.206 120 0.271 14 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Lowry): y = 0,002x + 0,023 Trong đó: x: nồng độ protein (μg/ml) y: giá trị OD660 (A) Kế hí nghiệm - Các mẫu MT1X MT2Đ pha lỗng lần, cịn mẫu MC7 pha loãng 10 lần trước đo OD Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD660 (A) 0,304 0,325 0,196 Nồng độ protein (µg/ml) 281 1510 173 Nhận xét: - Giá trị đo OD660 mẫu vượt giá trị OD660 đường chuẩn khơng nhiều nên nồng độ protein tính chấp nhận IV – Định ợng nồng ộ ro in ng h ng h Br dford: Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu dựa vào máy đo quang phổ Phổ biến số phương pháp đo độ hấp thụ trực tiếp vùng ánh sáng tử ngoại (UV), Lowry, Smith copper Bradford Ở trình bày phương pháp Bradford có nhiều ưu điểm: nhanh, nhạy, xác ổn định Tuy nhiên giống với phương pháp khác, Bradford phụ thuộc vào thành phần axit amin phân tử protein ngưỡng nồng độ protein có mẫu Nguyên lý phương pháp Bradford dựa vào thay đổi trạng thái tồn Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh cây) anion (màu xanh da trời) Dưới điều kiện axit mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn trạng thái bị proton hóa bị gắn H+ cịn gọi cation 15 có màu đỏ Ở trạng thái Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại bước sóng 470 nm Tuy nhiên, gắn với protein, chuyển sang dạng ổn định trạng thái khơng bị proton hóa (unprotonated) hay cịn gọi anion có màu xanh da trời Trong q trình phản ứng tạo phức với protein có dạng tương tác hóa học xảy Dạng cation (màu đỏ) chuyển điện tử tự vào nhóm ion hóa có phân tử protein dẫn đến việc bộc lộ số vùng kị nước phân tử protein Những vùng phản ứng với vùng không phân cực Coomassie G thông qua lực van der Waals (giữa nhóm amin mang điện tích dương nhóm mang điện tích âm chất màu khoảng cách gần nhau) Liên kết đồng thời giữ ổn định thêm tương tác ion nhóm Độ hấp thụ ánh sáng dung dịch chứa hỗn hợp protein thuốc thử đo bước song 595 nm Độ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ thuận với hàm lượng protein có mẫu Hàm lượng protein có mẫu xác định dựa vào đường chuẩn albumin Chú Về chất phương pháp Bradford không xác định số lượng liên kết peptide mà đo có mặt số amino acid định, chẳng hạn arginine Người ta cho arginine chịu trách nhiệm việc gắn thuốc thử Bradford với protein Ngoài amino acid mang gốc kị nước (hydrophobic amino acid) phản ứng với thuốc thử Dung dịch thu c thử Bradford 5X: Hòa tan 100 mg (0,1 g) Coomasie Blue 50 ml Ethanol tuyệt đối (99,99%) Bổ sung 100 ml axit phosphoric (H3PO4 85%) Hỗn hợp khuấy 10 phút tủ hút sau bổ sung nước cất thể tích 200 ml (nếu cần lọc) Chia nhỏ thành lọ nhỏ bảo quản tối Trước sử dụng pha loãng dung dịch thuốc thử Bradford thành 1X (pha loãng lần từ dung dịch gốc) Chẳng hạn lấy 10 ml Bradford 5X, bổ sung 40 ml nước cất có 50 ml dung dich thuốc thử 1X Thuốc thử 1X sử dụng ngày Vậ iệu: - Dung dịch protein - Albumin - Các dung dịch đệm Chuẩn ị: - Mẫu protein cần xác định hàm lượng - Dung dịch thuốc thử Bradford - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm hóa chất cần thiết Tiến hành hí nghiêm: a) Xây dựng đồ thị chuẩn: 16 Pha dung dịch gốc BSA 10 mg/ml (cân 10 mg BSA hịa tan hồn tồn ml nước cất) Từ dung dịch gốc pha loãng thành dung dịch chuẩn có nồng độ giảm dần (xem bảng) Các hóa chất Ống eppendorf H2O (µl) 420 450 460 Nồng độ BSA gốc 10mg/ml (µl) 60 50 40 Tổng thể tích (µl) 480 500 500 Nồng độ cuối (mg/ml) 1,25 1,0 0,8 950 50 1000 0,5 * * * 0,25 ** ** ** 0,125 (*) Ống s 5: lấy 00 µ dung dịch từ ng s 4, b ung hêm 00 µ H2O (**) Ống s 6: lấy 00 µ dung dịch từ ng s 5, b ung hêm 00 µ H2O X y d ng ờng chuẩn: Chuẩn bị dãy ống nghiệm sạch, đánh số thành ống Lần lượt cho vào ống nghiệm hóa chất theo bảng sau: Ống nghiệm BSA từ dung dịch chuẩn (μl) 100 100 Bradford 1X (ml) 5 H2O (μl) 0 Hàm lượng protein có 1,25 1,0 ống nghiệm (mg) (Đối chứng) 100 100 100 100 100 ml H2O 5 5 0 0 100 0,8 0,5 0,25 0,125 Để tăng độ xác đường chuẩn, tương ứng với nồng độ chuẩn BSA nên lặp lại lần (sử dụng lần nhắc lại ống nghiệm cho lần) Sau trộn đều, ống nghiệm để tối nhiệt độ phòng khoảng 20 phút Đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 595 nm Vẽ đường chuẩn Excel sử dụng kết đo Trong trục tung giá trị OD, trục hồnh hàm lượng protein Tuyến tính hóa thành phương trình tương quan hàm lượng protein OD 17 b) Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford: Giả sử có mẫu protein chứa biết hàm lượng Thay lấy 100 µl dung dịch BSA chuẩn, lấy 100 (µl) dung dịch protein cho vào ống nghiệm Bổ sung ml thuốc thử Bradford (1X) Các bước làm tương tự cách xây dựng đồ thị chuẩn trình bày Ghi lại giá trị OD L u Để đảm bảo độ xác, hàm lượng protein mẫu lớn cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp nước cất trước định lượng c) Cách tính hàm lượng: Cách tính: Sau đối chiếu giá trị OD thu với đường chuẩn tính nồng độ protein tương ứng mẫu cần phân tích Hàm lượng protein tính số mg protein có X µl mẫu phân tích D ng thị ờng chuẩn: Nồng độ protein (µg/ml) OD595 0.125 0.006 0.25 0.017 0.5 0.081 0.8 0.129 0.188 1.25 0.256 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Bradford): y = 0,222x – 0,032 Trong đó: x: nồng độ protein (μg/ml) y: giá trị OD595 (A) 18 Kết hí nghiệm: - Các mẫu pha loãng lần trước đo OD Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD595 (A) 0,156 0,136 0,154 Nồng độ protein (µg/ml) 1,694 1,514 1,676 Nhận xét: - Giá trị OD595 mẫu nằm giá trị OD595 đường chuẩn nên chấp nhận kết tính tốn nồng độ protein mẫu IV – Nhận xé Mẫu Nồng độ protein (µg/ml) (phương pháp Biuret) Nồng độ protein (µg/ml) (phương pháp Lowry) Nồng độ protein (µg/ml) (phương pháp Bradford) MT1X MC7 MT2Đ 134383 134809 139489 281 1510 173 1,694 1,514 1,676 Từ bảng tổng kết ta thấy: - Nồng độ protein tính tốn mẫu sai khác lớn - Nồng độ protein tính phương pháp Biuret Bradford ngang nhau, phương pháp Lowry lại chênh lệch lớn N yê â - Do sai thao tác tiến hành thí nghiệm - Phản ứng loại protein phương pháp lại khác - Mẫu protein chuẩn bị khơng chuẩn - Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm khơng chuẩn - Máy đo OD không chuẩn 19 Bài Điện di ro in rên g o y ry mid I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên giải thích vai trị hóa chất chất q trình điên di protein - Có thể thao tác điện di protein II – Nguyên iện di - Dựa chuyển động phân tử tích điện dung dịch đưa vào điện trường - Các phân tử điện trường chuyển động với vận tốc khác phụ thuộc vào: Điện tích Hình dạng Kích thước - Phương pháp phát triển mạnh để tách chúng - Phương pháp khác đơn giản nhanh, sử dụng để phân tích tách: Các phân tử lớn như: protein acid nucleic Các phân tử tích điện khác nhỏ đường, acid amin, peptide, nucleotide, ion đơn giản - Các phương pháp phát có độ nhạy cao phát triển để ghi phân tích kết tách – Điện di ro in rên g o y ry mid - SDS-PAGE (sodium dodeafl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresic): điện di biến tính phá cấu trúc - Tách protein dựa KLPT (MW) - Khi tách SDS-PAGE, di động xác định khơng phải điện tích chuỗi polypeptide, mà khối lượng phân tử (MW) - SDS chất tẩy anion gây biến tính protein cách bao quanh khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng - Mỗi phân tử SDS cung cấp hai điện tích âm, phân tử protein tích điện tỉ lệ với khối lượng phân tử chúng (hay chiều dài mạch) - Khi xử lý SDS chất khử, protein có dạng hình cầu tích điện âm với số điện tích đơn vị chiều dài - Độ phân giải SDS-PAGE lớn: phức hợp tách thành hàng trăm vệt băng gel 20 - Vị trí băng dọc theo giếng cho biết giá trị gần kích thước lượng protein mẫu (căn vào độ bắt màu sau nhuộm), dựa vào đánh giá về: Độ Mức độ biểu Điện chuyển miễn dịch Chuẩn bị phân tích trình tự Tạo kháng thể nhờ SDS-PAGE III – Chuẩn ị hó hấ : A Mẫu protein: Các mẫu protein đậu tương, amylase nước bọt, amylase khoai lang B Chuẩn bị dung dịch Đ ( ff 4X 500 , H 8,8 - 1,5 M Tris HCl pH 8,8 - 0,4% SDS Cách pha: - Tris base (KLPT 121,14) 90,83 g - H2O 400 ml - Chỉnh pH 8,8 sau bổ sung SDS - 10 % SDS 20 ml - Dẫn nước đến 500 ml Đ ô( ff 250 , H 6,8 - 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 - 0,4% SDS Cách pha: - Tris base - H2O - Chỉnh pH 6,8 sau bổ sung SDS - 10 % SDS - Dẫn nước đến Đ ẫ 4X ( 0,5 M Tris pH 6,8 SDS Glycerol Bromopjenol Blue 1% H2O ff 10 ml ml 0,6 g ml 0,4 ml ml 15,14 g 200 ml 10 ml 250 ml (10 20 ml 10 ml 1,2 g ml 0,8 ml 16 ml Nồng ộ X 0,25 M, pH 6,8 6% 40 % 0,04 % 21 Sau hòa tan chất, chia nhỏ ống eppendorf, bảo quản – 200C Đ ạy d 10X ( ff í H 8,3 - 10X SDS Laemmli Running Buffer (0,25 M Tris, 1.92 M Glycine, % SDS, pH 8,3) Cách pha: - Tris base 30,2 g - Glycine 144 g - SDS 10 g - Hòa tan H2O, chỉnh pH 8,3 dẫn nước đến lit D dị y d (30% T, 0,8% 200 - Acrylamide 58, 42 g - Bis-acrylamide 1,6 g - H2O dẫn từ từ đến 200 ml D dị ộ - Coomassie R250 - Glacial acetic acid - Methanol - H2O Tổng số Dung dịch tẩy (Destaining solution) - Methanol - Acetic acid - H2O Tổng số: 1g 100 ml (10%) 400 ml (40%) 500 ml 1000 ml 150 ml (15%) 100 ml (10%) 750 ml 1000 ml ẩ ị d dị - 10% SDS 10 g SDS/ 100 ml H2O (Bảo quản nhiệt độ thường) - 10% APS 10 g APS / 100 ml H2O (Bảo quản 40C vài tuần) IV – Đ g iện di: - Lắp ráp hệ thống điện di theo dẫn giáo viên hướng dẫn - Trộn thành phần theo bảng sau: - Thực bước theo dẫn giáo viên hướng dẫn 22 ( , Thành hần H2O 1,5 M Tris HCl pH 8,8 29:1 Acrylamide:Bis 10 % APS TEMED T ng hể í h Gel ô ( ả V (ml) (ml) (ml) (l) (l) ml , Thành hần H2O 0,5 M Tris HCl pH 6,8 29:1 Acrylamide:Bis 10 % APS TEMED T ng hể í h Acrylamide (12 %) 2,19 1,5 2,5 3,25 6,19825 ml ả V (ml) (ml) (ml) (l) (l) ml Acrylamide (5 %) 2,32 0,68 16 4,024 ml V – Điện di protein: - Sau gel chuẩn bị xong, lắp vào máy, đổ đệm điện di ngập gel - Hút lượng thể tích mẫu protein (1V), cho vào ống eppendorf sau bổ sung 4V đệm mẫu (sample buffer), trộn Đun nước sơi phút, sau để nguội đến nhiệt độ phịng Lưu ý: lượng protein (µg) cho vào giếng điện di từ 5- 10 µg (tùy thuộc vào nguồn protein) Có thể ly tâm sau đun sôi mẫu để loại bỏ cặn - Cho mẫu vào giếng điện di - Lắp nguồn, chạy điện di theo dẫn giáo viên hướng dẫn VI – Nhuộm ẩy ản g iện di: - Sau chạy điện di hoàn tất, lấy gel khỏi kính - Cho vào dung dịch nhuộm - Lắc vịng sau lấy gel tẩy theo dẫn - Quan sát kết quả, chụp ảnh VII – Kế nhận xé ả Có tất 12 giếng mẫu đổ vào giếng thứ tự là: 23 Giếng Mẫu GFP BSA Giếng Mẫu Tag VK (xử lý 95o) VK (ecoli) VK (chưa biết) Giếng 10 11 12 Mẫu GFP VK (xử lý 95o) BSA VK (chưa biết) Trong đó, giếng 3, đổ μl, giếng lại đổ μl 10 11 12 N - Băng điện di bị lệch 24 - Các vệt băng bị mờ, thấy rõ vệt băng BSA - Cuối vệt băng rơi loe hai bên - Trên vệt băng có khoảng trắng, gel khơng - Chỉ nhìn rõ vệt băng BSA thể tích μl N yê â - Bộ đổ gel ốc trượt nên vặn không chắc, đệm chắn đáy dãn nên khơng cịn khít chặt nên gel lệch - Thao tác lúc đổ gel không chuẩn, chậm dẫn đến gel đơng khơng nên có số đường trắng điện di - Tiến hành pha hóa chất chậm nên thời gian hóa chất ngồi khơng khí lâu - Xử lý mẫu điện di chưa tinh sạch, lẫn tạp chất, mẫu VK (chưa biết) nhỏ vào giếng nhớt - Khi lấy mẫu chất nhỏ vào giếng sơ sót nên cịn lấy mẫu đáy ống nghiệm ộ ô d a) BSA: - Gồm 607 acid amin - Số dư lượng acid amin: 585 - Trọng lượng phân tử: 66463Da (= 66,5 kDa) - Điểm đẳng điện nước 25oC: 4,7 - Hệ số tuyệt chủng: 43824 M -1 cm -1 279 nm - Kích thước: 140 x 40 x 40 (dài ellipsoid a b c) b) GFP (green fluorescent protein) (protein huỳnh quang màu xanh cây): - Gồm 238 acid amin - Trọng lượng phân tử: 26,9 kDa 25 ... ký chuẩn bị khơng tốt - Protein cịn lẫn tạp - Dịng chảy protein ngồi khơng - Khi để protein chảy nhanh ngồi dễ lẫn protein với - Máy đo OD có khả sai sót thơng số - Nồng độ protein ống nghiệm phân... iệu: - Dung dịch protein - Albumin - Các dung dịch đệm Chuẩn ị: - Mẫu protein cần xác định hàm lượng - Dung dịch thuốc thử Bradford - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm hóa chất cần thiết Tiến hành. .. - Acrylamide 58, 42 g - Bis-acrylamide 1,6 g - H2O dẫn từ từ đến 200 ml D dị ộ - Coomassie R250 - Glacial acetic acid - Methanol - H2O Tổng số Dung dịch tẩy (Destaining solution) - Methanol -