NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG TRÊN CHUỘT (SPRAGUE DAWLEY) ppt

8 614 6
  • Loading ...
1/8 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 20/03/2014, 09:21

49 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, tập 73, số 4, năm 2012 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG TRÊN CHUỘT (SPRAGUE DAWLEY) Chế Thị Cẩm Hà 1,2, Sabine François2, Marie-Elisabeth Forgue-Lafitte2, Alain Chapel2 1Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 2Viện Nghiên cứu Y học quốc gia Pháp, Đại học Paris VI Tóm tắt. Bài báo này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu về tính năng của tế bào gốc trong liệu pháp miễn dịch ung thư nhờ những tế bào tạo ra từ tế bào gốc trên quá trình ung thư hóa đại trực - tràng ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Việc tiêm tế bào gốc trung ở liều 107 tế bào/ml có khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư. Nhóm chuột được tiêm tế bào gốc trung với liều 107 tế bào/ml có số lượng các khối u ít hơn, với ý nghĩa thống kê (p <0,013). Nhóm chuột tế bào gốc được tiêm có ít khối u ác tính hơn những người không sử dụng tế bào gốc. 1. Đặt vấn đề Ở các nước phát triển tỷ lệ bệnh ung thư đại trực - tràng đứng thứ ba trong số các bệnh ung thư. Ở Việt Nam, gần đây bệnh này được nhắc đến nhiều hơn bởi sự thay đổi trong thói quen sinh hoạt hàng ngày là một trong những yếu tố khiến ung thư đại trực tràng ngày càng gia tăng một cách rõ rệt. Điều trị bệnh ung thư đang được tích cực nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp tối ưu để nâng cao chất lượng và tăng cường hiệu quả điều trị. Đến nay, việc sử dụng tế bào gốc trung đã được nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực của y học tái tạo, tiểu đường, điều trị ung thư, điều trị các bệnh bẩm sinh, chấn thương cột sống, rối loạn thần kinh cơ và đặc biệt là tim mạch. Bài báo này giới thiệu một số kết quả nghiên cứu tìm hiểu về tính năng của tế bào gốc trong liệu pháp miễn dịch ung thư nhờ những tế bào tạo ra từ tế bào gốc trên mô hình ung thư hóa đại trực - tràng ở chuột. 2. Đối tượng và phương pháp 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Là loài chuột cống trắng (Sprague Dawley) có khả năng miễn dịch. - Các chuột thí nghiệm có trọng lượng ban đầu từ 200±20 gram, đều là con đực 50 được 1 tháng tuổi, khỏe mạnh và được kiểm dịch trong 5 ngày trước khi thí nghiệm. - Lô chuột chuyển gen GFP được tiêm các tế bào gốc trung (MSC-GFP). Toàn bộ chuột được nuôi ở các lồng riêng biệt trong phòng ở nhiệt độ 25°C, có chế độ chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày, được cho ăn trong cùng một chế độ dinh dưỡng, cùng điều kiện chăm sóc suốt quá trình nghiên cứu. - Các chuột thí nghiệm được phân thành 4 lô như sau:  Lô đối chứng sinh học: được đặt trực tiếp 200µl dung dịch sinh lý ở đại trực tràng qua đường hậu môn, 4 lần trong 2 tuần liên tiếp (n= 9).  Lô đối chứng tiêm tế bào gốc, không có MNNG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine): được đặt trực tiếp 200µl dung dịch sinh lý ở đại trực tràng qua đường hậu môn, 4 lần trong 2 tuần liên tiếp, tiêm tế bào gốc bằng đường tĩnh mạch (n= 10)  Lô thí nghiệm ung thư hóa: truyền hóa chất MNNG, không tiêm tế bào gốc (n=10).  Lô thí nghiệm tế bào gốc: truyền hóa chất MNNG và tiêm tế bào gốc 107/ml (n=9). 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Hóa chất gây ung thư hóa tế bào là: N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) Cách dùng: hòa tan MNNG trong nước với liều lượng 5mg/ml, sau đó đun nóng đến 50°C cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Dung dịch được giữ trong bóng tối ở 4°C. Các chuột được gây mê bằng khí Isoflurane. Dung dịch MNNG được đặt ở đại tràng bằng cách sử dụng một ống thông trực tràng dài 7cm từ bờ hậu môn với tần suất 4 lần đặt trong hai tuần liên tiếp theo liều lượng là 0,5 ml cho mỗi lần đặt. Hình 1. Tiến trình thí nghiệm 51 Thu nhận máu: Tế bào gốc được lấy từ tủy xương (với chất chống đông heparin). Nuôi cấy sơ cấp: Thu nhận tế bào gốc bằng phương pháp ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (sigma) ở tốc độ 2500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau khi ly tâm, thu nhận và nuôi cấy tế bào với mật độ 50.000 tế bào/cm2 (3,7x106/hộp cấy tế bào diện tích 75 cm2) trong 10ml môi trường nuôi cấy MEM (Invitrogen, Pontoise, Pháp) có chứa huyết thanh thai bò 10% (fetal bovine serum – FBS), ở điều kiện nhiệt độ 37°C, 5%CO2. Trong thời gian từ 1-2 giờ, các tế bào gốc có khả năng phát triển trong hộp nuôi cấy, sau 48 giờ chúng sẽ phát triển nhanh, nhiều tạo thành một lớp hỗn hợp tế bào bám dính vào bề mặt giá thể. Sau đó, thay môi trường để loại bỏ các tế bào không bám bao gồm các tế bào chết và tiếp tục nuôi cho đến khi tế bào mọc đạt tỷ lệ 70-80% bề mặt đáy bình nuôi. Thường xuyên theo dõi và thay môi trường với chế độ 3 ngày/lần. Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh tế bào Khi mật độ tế bào trong bình đạt tỉ lệ 70% diện tích đáy bình nuôi, ta tiến hành cấy chuyền để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian sống cho tế bào. Quy trình cấy chuyền thứ cấp: loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế bào với 15 ml PBSA hai lần. Tiếp tục loại bỏ dịch rửa và bổ sung 5 ml trypsin/EDTA 0,05%. Sau 15- 30 giây, tiến hành bỏ dung dịch cũ nhưng vẫn giữ lại khoảng 1 ml và tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, từ 2 - 4 phút. Sau đó, lắc nhẹ hộp nuôi cấy để tế bào tách ra khỏi bề mặt đáy hộp. Khi tế bào co tròn và tách hoàn toàn ra khỏi bề mặt hộp cấy, phải trung hòa trypsin thừa bằng 20 ml môi trường IMDM 10% FBS. Các tế bào được đếm lại để nuôi cấy trong hộp mới với mật độ 1000 tế bào/cm2, tiếp tục thay môi trường và nuôi tế bào. Sau khi cấy chuyền từ 5-7 lần, tiến hành tinh sạch tế bào trước khi ghép. Xác định đặc tính và kiểu hình của tế bào trước khi ứng dụng cấy ghép: Sử dụng máy FACS Calibur Becton-Dickinson ® (Fluorescence Activated Cell Sorter), với kỹ thuật Flow cytometry cho phép thu thập các thông tin về tế bào thông qua dạng tế bào, sự phát xạ huỳnh quang, sàng lọc phát hiện bất cứ kháng thể nào đã bám trên bề mặt tiểu cầu dựa trên đặc tính của kháng nguyên. Việc xác định dựa trên cơ sở cách chúng di chuyển trong 1 dòng dung dịch bằng cách ghi lại ít nhất là 10.000 điểm cho mỗi thực nghiệm. Thống kê và xử lý số liệu: các kết quả phân tích được thực hiện trên phần mềm 'Statview' và SPSS, với mức ý nghĩa p<0,05. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kiểu hình của MSC- GFP được nuôi cấy từ tủy xương của chuột Sau 2 lần rửa với PBS chứa 0,5% huyết thanh bò (BSA, Sigma Chemical Co), 52 các tế bào được ngâm trong 200μl PBS-BSA có chứa 1μg/ml của 7-amino-actinomycin D (Sigma Chemical Co) để loại trừ phân tích các tế bào chết. Xét nghiệm flow cytometry dương tính chứng tỏ có kháng thể bám lên bề mặt tiểu cầu. Các tế bào MSC-GFP trong giai đoạn này được ủ với kháng thể đơn dòng CD106 (SH2), anti-CD 90(Thy61), CD73 (SH3) và CD45 cùng với một fluorochrome (phycoerythrin, PE) trong 30 phút ở 4°C. Các thông số thống kê ở những mẫu tủy xương và được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Tỷ lệ phần trăm của các kháng thể đơn dòng CD90 +, CD73, CD45 và CD106 bám lên bề mặt tế bào (n=8). Số tủy xương thí nghiệm % tế bào CD45 % tế bào CD73+ % tế bào CD90+ % tế bào CD106+ 1 0,0 7,7 99,8 3,8 2 0,4 13,8 97,4 2,8 3 0,3 19,6 95,5 8,4 4 0,7 20,0 75,5 4,7 5 0,5 0,6 98,3 7,1 6 4,8 5,6 94,4 18,0 7 2,0 1,1 87,9 7,4 8 0,2 23,6 95,5 1,1 Trung bình 1,1 ± 0,6 11,5% ± 2,2 93,0% ± 2,1 6,7% ± 2,6 Tỷ lệ phần trăm của các tế bào dương tính với kháng nguyên CD45: 1,1± 0,6 là điểm đánh dấu của các tế bào gốc tạo máu. Kháng nguyên CD73: 11,5% ± 2,2 và CD106: 6,7% ± 2,6. Đặc biệt kháng nguyên CD90 có tỷ lệ dương tính khá cao: 93,0% ± 2,1. Điều quan trọng cần lưu ý là tế bào dương tính của kháng nguyên CD45 là không đáng kể trong tổng số tế bào phân lập. Các tế bào gốc trung (MSC) tiêm trong thí nghiệm này là hầu như không bị nhiễm các tế bào gốc tạo máu. 3.2. Nghiên cứu hiệu ứng tác động của MCP-1 trên chuột sau khi tiêm tế bào gốc. MPC-1 (Macrophages and monocyte chemoattratant protein 1): protein này tiết ra một chemokine lôi kéo tế bào đơn nhân gây phản ứng viêm. Chúng tôi tập trung nghiên cứu định lượng mức độ MCP-1 trên các đại - trực tràng của chuột khỏe mạnh sau khi tiêm tĩnh mạch trong 24 giờ và một tuần (Hình 2). 53 Điều này thật sự cần thiết vì có một số tế bào gốc trung sau khi tiêm đã tiết ra một số lượng nhất định các yếu tố có liên quan đến protein này. Tỷ lệ MCP-1 được đo theo phương pháp ELISA trên protein của các mẫu đại tràng chuột không gây ung thư hóa với MNNG, mỗi nhóm 10 con được phân tích (n=10) Kết quả cho thấy protein MCP-1 trong thí nghiệm này không có hiệu ứng gây ra phản ứng miễn dịch để tuyển dụng các tế bào đơn nhân gây phản ứng viêm nhiễm trên chuột cấy ghép. Hình 2. Định lượng protein MCP-1 trên đại - trực tràng chuột khỏe mạnh ở thời điểm 24 giờ và một tuần (p <0,001) sau khi tiêm tế bào gốc bằng đường tĩnh mạch Trong đó: - Đối chứng: không tiêm tế bào gốc, tiêm FBS 10%. - TN1: Lô thí nghiệm sau 24h tiêm tế bào gốc (2 lần tiêm ) - TN2: Lô thí nghiệm sau 1 tuần tiêm tế bào gốc (2 lần tiêm) - TN3: Lô thí nghiệm sau 1 tuần tiêm tế bào gốc (4 lần tiêm ) 2.3. Số lượng khối u sau 32 tuần thí nghiệm Ở lô chuột được tiêm tế bào gốc trung sau khi đã gây ung thư, chuột được tiêm 2 lần trong vòng 2 tuần với liều 107 tế bào /ml. Lô chuột thí nghiệm gây ung thư hóa: chỉ đặt hóa chất MNNG, không tiêm tế bào gốc. Đánh giá tình trạng khối u bằng phương pháp nội soi và chụp cắt lớp PET-SCAN ở đại trực tràng trên chuột thí nghiệm đang cần theo dõi. Số lượng khối u được thống kê trực tiếp trên niêm mạc đại trực tràng sau khi bộc lộ. 54 Bảng 2. Số lượng các khối u thu được trên chuột sau 32 tuần thí nghiệm Thí nghiệm Số chuột thí nghiệm Số chuột có khối u % chuột có khối u Số lượng khối u Trung bình khối u/con Lô ung thư hóa 10 8 80 19 2,37 ± 0,32 Lô ung thư hóa & Tế bào gốc 9 3 33,3 6 2,00 ± 0,58 Kết quả phân tích thống kê cho thấy, nhóm chuộtsử dụng tế bào gốc trung mô ở liều 107 tế bào/ml có số lượng khối u ít hơn. Các thử nghiệm độ chính xác Fisher cho thấy sự khác biệt đáng kể, với p = 0,013. Ở lô chuột được tiêm tế bào gốc có tổng cộng 6 khối u trên 9 chuột thí nghiệm. Trong khi lô chuột chỉ gây ung thư hóa, không tiêm tế bào gốc có 19 khối u trên 10 chuột thí nghiệm. Theo nhận định của chúng tôi, có thể sự có mặt của tế bào gốc ngay từ ban đầu (sau khi đặt hóa chất gây ung thư bằng MNNG) đã có tác dụng ức chế chống lại sự hình thành khối u và hiệu quả vẫn còn được kéo dài đến tuần thứ 32. Hình 4. Hình ảnh theo dõi xác định giai đoạn khối u trong đại tràng chuột qua chụp cắt lớp tán xạ positron (PET-SCAN) 55 2.4. So sánh mức độ tiến triển khối u bằng bệnh học và tế bào học. Ngoài việc thống kê số lượng khối u, chúng tôi tiếp tục đánh giá mức độ tiến triển khối u về mặt hình thái học của tế bào u, đánh giá cấu trúc của tổ chức đệm của khối u. Sau khi giải phẫu chuột, lấy mẫu khối u trực tiếp trong đại trực tràng, cố định khối u trong formol 10% chuyển vùi nến, cắt mảnh dày 5µm, tiêu bản được nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) hoặc Papanicolaou (PAP). Tiến hành phân loại týp bệnh học theo hệ thống tiêu chuẩn phân chia giai đoạn của khối u ác tính TNM (Classification of Malignant Tumours) của Hiệp hội chống ung thư quốc tế (UICC) . U lành tính là u có sự tăng sinh của tế bào và tổ chức đệm xung quanh, nhưng không có sự đảo lộn cấu trúc của tế bàosự thay đổi hình thái giữa các tế bào với nhau. U ác tính là u có sự thay đổi rõ rệt của nhân, u có những sự biến đổi đặc trưng: quá sản, loạn sản, dị sản. Ngoài ra u thường có sự đảo lộn cấu trúc của tổ chức u (tức là có sự xâm lấn của tổ chức ác tính và cấu trúc đệm xung quanh). Qua nghiên cứu về giải phẫu bệnh của các khối u ở hai lô chuột thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy nhóm chuột được cấy ghép tế bào gốc có số lượng khối u ác tính ít hơn so với nhóm không sử dụng tế bào gốc. Có 3 chuột có u ác tính trên tổng số 10 chuột thí nghiệm ở lô chuột chỉ gây ung thư hóa. Lô đối chứng được tiêm tế bào gốc trung sau khi đã gây ung thư, chỉ có 1 chuột có u ác tính trong tổng số 9 chuột thí nghiệm. Ở mức độ cấu trúc hiển vi, lô chuột nhận tế bào gốc trung không thấy sự hình thành mạch máu trong các khối u cũng như khả năng di căn cao hơn so với lô chuột thí nghiệm khi gây ung thư hóa bằng MNNG, không tiêm tế bào gốc. 3. Kết luận Xét nghiệm flow cytometry dương tính của kháng nguyên CD73: 11,5% ± 2,2, CD106: 6,7% ± 2,6, CD90: 93,0% ± 2,1. Riêng kháng nguyên CD45: 1,1 ± 0,6 dương tính là điểm đánh dấu của các tế bào gốc tạo máu. Tuy nhiên, chỉ số này không đáng kể trong tổng số tế bào phân lập. Các kháng nguyên có thành phần quá ít thì không đủ để kích thích cơ thể tổng hợp kháng thể. Các tế bào gốc trung (CSM) tiêm trong thí nghiệm này là hầu như không bị nhiễm các tế bào gốc tạo máu. Protein MCP-1 không có hiệu ứng của phản ứng miễn dịch để thu nhận các tế bào đơn nhân gây phản ứng viêm nhiễm trên chuột khi được cấy ghép. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tiêm tế bào gốc trung ở liều 107 tế bào/ml có số lượng khối u ít hơn so với đối chứng, với mức ý nghĩa thống kê (p<0,013). Lô chuột thí nghiệm ghép tế bào gốc có số lượng khối u ác tính ít hơn so với nhóm không sử dụng tế bào gốc. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Denoix PF., Enquete permanent dans les centres anticancereaux, Bull Inst Nat Hyg, 1946. 2. Jemal A, Murray T, Ward E, Samuels A, Tiwari RC, Ghafoor A, Feuer EJ, Thun MJ., Cancer statistics, CA Cancer J Clin, 2005. 3. Imasawa, T., Y. Utsunomiya, et al., The potential of bone marrow-derived cells to differentiate to glomerular mesangial cells, J Am Soc Nephrol , 2001. 4. Khakoo, A. Y. et al., Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma, J Exp Med 203, (2006), 1235-47. 5. Maurin, N., Forgue-Lafitte, M. E., Levy, P., Zimber, A. & Bara, J., Progression of tumors arising from large ACF is associated with the MUC5AC expression during rat colon MNNG carcinogenis, Int J Cancer 120, 2007. 6. Narisawa, T., Magadia, N. E., Weisburger, J. H. & Wynder, E. L., Promoting effect of bile acids on colon carcinogenesis after intrarectal instillation of N-methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine in rats, J Natl Cancer Inst 53, 1974. 7. Ren, C. et al., Therapeutic potential of mesenchymal stem cells producing interferonalpha in a mouse melanoma lung metastasis model, Stem Cells 26, (2008), 2332-8. 8. Satija, N. K. et al., Mesenchymal stem cell-based therapy: a new paradigm in regenerative medicine, J Cell Mol Med 13, 2009. STEM CELL RESEARCH USING MESENCHYMAL (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) IN THE TREATMENT OF CANCER AGENCY - RECTUM RATS (SPRAGUE DAWLEY) Che Thi Cam Ha1,2, Sabine François2, Marie-Elisabeth Forgue-Lafitte2, Alain Chapel2 1College of Sciences, Hue University 2Ministry of Health and the Ministry of Higher Education and Research, The Paris VI University Abstract. This paper presents some characteristics of mesenchymal stem cells in cancer immunotherapy in mice. Research results show that the mesenchymal stem cells injected into mice at the dose of 107 cells/ml can inhibit the proliferation of cancer cells. The number at tumors in mice injected with mysenchymal stem cells at the doses of 107cells/ml is statistically less than that of the control group (p<0,013). The No of maligant tumors in the stem cell of the mouse group injected is about less than that in the control group. . HỌC, Đại học Huế, tập 73, số 4, năm 2012 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG. bào gốc trong liệu pháp miễn dịch ung thư nhờ những tế bào tạo ra từ tế bào gốc trên quá trình ung thư hóa đại trực - tràng ở chuột. Kết quả nghiên cứu
- Xem thêm -

Xem thêm: NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG TRÊN CHUỘT (SPRAGUE DAWLEY) ppt, NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG TRÊN CHUỘT (SPRAGUE DAWLEY) ppt, NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MESENCHYMAL STEM CELL - MSC) TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI - TRỰC TRÀNG TRÊN CHUỘT (SPRAGUE DAWLEY) ppt

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn