Hệ thống chuyển tải gen và ứng dụng trong liệu pháp điều trị gen TS. Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa-Hóa sinh, Trờng Đại học Y Hà Nội I. Giới thiệu chung Việc áp dụng liệu pháp điều trị gen trong y học là hớng điều trị đang đợc nghiên cứu rộng rãi hiện nay. Liệu pháp này đợc thực hiện bằng việc chuyển giao gen lành sang các dòng tế bào bị đột biến gen của bệnh nhân mắc bệnh di truyền. Các bệnh lý di truyền của cơ quan tạo máu và của hệ miễn dịch là lĩnh vực đầu tiên đợc nghiên cứu theo hớng áp dụng liệu pháp điều trị gen. Ngày nay hớng nghiên cứu điều trị này đợc triển khai trong nhiều trờng hợp bệnh lý mà nguyên nhân là do rối loạn hoặc tổn thơng hệ thống di truyền nh: các loại hình ung th, các bệnh thơng tổn hệ thống thần kinh bẩm sinh, hay do tuổi già, đái tháo đờng, bệnh lý bẩm sinh của cơ (dystrophy), bệnh của cơ quan tạo máu (1-3). Nguyên tắc cơ bản để đạt đợc sự thành công trong liệu pháp đIều trị gen là: 1, Đạt đợc hiệu suất cao trong việc cấy gen lành vào tế bào đích. 2, Gen cấy phải hoà nhập vào hệ thống di truyền của tế bào nhận, hoạt động hiệu quả và lâu dài để có thể làm thay đổi kiểu hình của bệnh. Điều khác cũng không kém phần quan trọng là phải hạn chế tai biến cho bệnh nhân và chi phí thấp. Trong bài viết này, tác giả đề cập đến các phơng tiện chuyển tải gen, khâu then chốt nhất trong liệu pháp điều trị gen. Hệ thống chuyển tải gen tới tế bào đích. Mục tiêu quan trọng nhất đối với việc phát triển phơng pháp điều trị gen là tạo ra các vector có khả năng chuyển tải và thể hiện gen tại các tổ chức cần điều trị. Thế hệ đầu tiên của các vector là việc sử dụng hệ thống virus để chuyển tải các thông tin di truyền đến các tế bào của ngời. Tiếp sau đó, các nhà khoa học đã cố gắng phát triển các thế hệ vector không thuộc hệ virus hoặc hệ lai giữa hai hệ thống đó để tăng tính an toàn. Gần đây phơng pháp dùng các tế bào gốc của ngời làm phơng tiện chuyển tải gen điều trị tới quần thể tế bào bệnh đặc hiệu đang đợc nghiên cứu áp dụng (hình 1). Mau To chuc Nhan Te bao dich Tac dung sinh hoc Hình 1: Các quá trình sinh học của việc chuyển gen in vivo (1) Các phơng tiện chuyển tải gen (virus, không phải virus, tế bào) tới tế bào đích qua hệ thống tuần hoàn hoặc trực tiếp tại chỗ. (2) Vector xâm nhập vào tế bào đích thông qua receptor đặc hiệu trên bề mặt tế bào (Rv). (3) Tế bào tiếp nhận vector và vận chuyển vào nhân. (4) Quá trình sao chép gen ghép trong nhân. (5) Quá trình giải mã để tổng hợp protein điều trị ở bào tơng. (6) Quá trình tơng tác của protein mới tổng hợp với receptor đặc hiệu tại chính tế bào sản xuất ra nó hoặc các tế bào bên cạnh hoặc lu thông trong hệ thống tuần hoàn để tới các tế bào đích ở tổ chức khác. (7) Sau khi tơng tác với receptor protein điều trị phát huy tác dụng sinh học. 1. Vector có nguồn gốc từ virus Vector có nguồn gốc từ virus (virus-vector) là phơng tiện vận chuyển gen thuộc thế hệ đầu 107 Bài viết đợc thực hiện tại bộ môn Sinh học phân tử, khoa Y, Trờng Đại học Kyoto, Nhật Bản. tiên đợc ứng dụng cho tế bào ngời. Đa số các virus-vector sử dụng trên lâm sàng có nguồn gốc từ retrovirus hoặc adenovirus. Một số virus-vector có nguồn gốc từ các loại virus khác nh lentivirus, herpes virus, pox virus cũng đang đợc nghiên cứu áp dụng (4). Các phần tử retrovirus mang gen ghép có khả năng xâm nhập vào hệ thống gen của tế bào chủ để tạo ra dòng tế bào mang gen ghép ổn định. Các retrovirus trớc hết đợc tổng hợp thông qua sự sao chép trong tế bào đóng gói (packaging cell) đặc hiệu sau khi tế bào này đợc chuyển gen từ retrovirus -vector. Các hạn chế chính trong việc áp dụng retrovirus -vector là hiệu lực virus thấp, không có khả năng nhiễm vào tế bào không phân chia, và tiềm ẩn khả năng gây đột biến cho tế bào chủ. Khác với retrovirus, adenovirus có hiệu lực cao song lại không có khả năng xâm nhập vào hệ thống gen của tế bào chủ để tạo ra dòng tế bào ổn định mang gen ghép. Tuy vậy adenovirus có thể xâm nhập vào cả tế bào đang trong giai đoạn phân chia lẫn ở trạng thái nghỉ. Adenovirus là yếu tố gây bệnh của ngời và do vậy đa số ngời bệnh trong tiền sử đều đã từng bị nhiễm. Do vậy trong máu bệnh nhân thờng tồn tại một lợng nhất định kháng thể kháng virus. Chính điều này làm ảnh hởng đến việc áp dụng adenovirus trong điều trị. Việc sử dụng adenovirus không phải nguồn gốc ngời có thể tránh đợc hạn chế này trong điều trị. Tuy vậy hiệu quả của việc áp dụng adenovirus lần 2 thờng hạn chế hơn lần đầu. Nói tóm lại việc áp dụng virus-vector trong điều trị ghép gen trong tơng lai sẽ phụ thuộc vào các hệ thống điều hòa gen bao gồm gen công tắc (hoạt động theo cơ chế đóng mở), promoter đặc hiệu tổ chức để cho phép sự thể hiện gen đợc thực hiện một cách chuẩn xác về thời điểm, vị trí trong một khoảng thời gian mong muốn. Các phơng tiện chuyển gen nguồn gốc không phải virus. Cho đến thời điểm này việc tạo ra các phơng tiện vận chuyển gen nguồn gốc không phải từ virus còn nhiều hạn chế. Việc áp dụng các chất mang gen này mang lại độ an toàn cao, độc tính thấp song lại bị hạn chế do hiệu quả chuyển gen thấp. Tuy nhiên trong thời gian gần đây, việc tổng hợp ra các chất mang gen mới có bản chất là lipid và các chất mang cationic polymer đã làm tăng đáng kể hiệu quả của việc chuyển gen (5). Để tạo ra phơng tiện vận chuyển gen có hiệu quả cao, độc tính thấp, các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra phơng tiện chuyển gen có nguồn gốc trung gian giữa virus và tổng hợp (6). Phơng tiện này sẽ kết hợp đợc u điểm của cả hai phơng pháp, hiệu quả chuyển gen cao (nguồn gốc virus), độc tính thấp (nguồn gốc tổng hợp), (hình 2). Te bao dich Nhan Hình 2: Cơ chế hoạt động của phơng tiện vận chuyển gen tổng hợp (1) Gen cô đặc (bởi protamine sulfate) cùng với yếu tố đặc hiệu màng đợc bao phủ (bởi polyethylene-glycol) lu thông trong máu đến tế bào đích. (2) Phức hợp gen-yếu tố đặc hiệu màng gắn vào màng tế bào đặc hiệu. (3, 4) Phức hợp đợc vận chuyển vào trong tế bào và tiến đến nhân. (5, 6) Phức hợp xâm nhập vào nhân, hoà vào bộ gen của tế bào đích và quá trình sao chép, tổng hợp protein đợc khởi động. 2. Vận chuyển gen bằng tế bào gốc. Trong y học, mặc dù việc dùng tế bào để điều trị (chẳng hạn nh truyền máu) đã đợc áp dụng cách đây hàng thập kỷ song việc lấy tế bào bệnh của bệnh nhân, đa gen lành vào rồi đa lại vào cơ thể ngời bệnh là hớng nghiên cứu mới mẻ (4, 7). Việc sử dụng tế bào gốc của ngời bệnh để đa gen lành vào sau đó cấy trở lại cơ thể bệnh nhân nhằm tái tạo ra nhiều dòng tế bào mang gen lành trong một cơ 108 quan nhất định nào đó là hớng nghiên cứu đợc nhiều ngời quan tâm nhất hiện nay. Các nghiên cứu gần đây tập chung vào việc sử dụng các tế bào tạo máu, tế bào gốc thần kinh và các tế bào gốc của bào thai cho mục đích này. Tuy nhiên có nhiều vấn đề cần phải đợc giải quyết đó là: 1) Tìm ra môi trờng phân lập và nuôi cấy thích hợp đối với từng loại tế bào gốc. 2) Tìm ra điều kiện thích hợp để tế bào gốc mang gen ghép có thể biệt hóa thành tế bào mong muốn cần điều tri. 3) Tạo ra các vector thích hợp để đa gen cần điều trị vào tế bào gốc và thúc đẩy gen này hòa vào bộ gen của tế bào chủ một cách ổn định. II. Kết luận Các nhà khoa học đang cố nghiên cứu nhằm tìm ra một vector hoàn hảo thỏa mãn tất cả các yêu cầu của liệu pháp điều trị gen. Tuy vậy cũng cần phải nhấn mạnh rằng vector hoàn hảo đó sẽ không phải là công cụ đa năng bởi lẽ mỗi loại bệnh tật sẽ đòi hỏi một kỹ thuật chuyên biệt với một vector đặc hiệu. Ví dụ: một số bệnh chỉ đòi hỏi sự chuyển gen cục bộ nh các bệnh Parkinson, viêm võng mạc, thiếu máu cục bộ trong khi một số bệnh khác lại đòi hỏi sự chuyển gen cho cả một hệ thống trong cả một thời gian dài nh bệnh xơ vữa động mạch, ung th. Đối với một số bệnh sản phẩm của các gen ghép là protein có thể đợc tổng hợp từ tế bào của nhiều tổ chức khác nhau trong cơ thể nh yếu tố VIII, IX trong hemophilia A và B, các hormone Song trong một số bệnh khác, sản phẩm gen ghép chỉ cần đợc tổng hợp trong một giai đoạn nhất thời nh giai đoạn tiền ung th. Thêm vào đó trong một số trờng hợp sản phẩm của gen ghép không cần phải kiểm soát chặt chẽ nh yếu tố VIII, IX trong hemophilia A và B thì ở bệnh tiểu đờng, lợng insulin tổng hợp cần phải đợc điều hòa hết sức nghiêm ngặt. Cho đến nay một số vector đặc hiệu cho một số bệnh đã đợc áp dụng trên lâm sàng (bảng 1) và đã đợc cấp bản quyền song việc tạo ra một vector hoàn hảo vẫn luôn là một trở ngại nhất trong liệu pháp điều trị gen. Bảng 1: Các hệ thống chuyển tải gen (vector) và số lần thử nghiệm trên lâm sàng (1992-2001) Hệ thống chuyển tải nghiệm Số lần thử Retrovirus 67 Liposome 59 Adenovirus 54 Tế bào gốc 20 Pox virus 26 Phơng pháp khác* 16 AND tự do 8 *, Electroporation, súng bắn gen Tài liệu tham khảo 1. Anderson, W. F. Human gene therapy. Nature 392, 25-30 (1998). 2. Sneyers, M., Dumon, J-C., Vanerenbergh, B et al. Gene therapy clinical trial in Belgium. Human gene therapy 12, 1361-1365 (2001). 3. Rubanyi G.M. The future of human gene therapy. Mol. aspects med. 22, 113-142 (2001). 4. Halene, S., Kohn, D. B. Gene therapy using hematopoetic stem cells: Sisyphus approaches the Crest. Human gene therapy 11, 1259-1267 (2000). 5. Li, S., Huang, L. Nonviral gene therapy: Promises and challenges. Gene therapy 7, 31- 34 (2000). 6. Kaneda, Y. Development of a novel fusogenic viral liposome system (HVJ- liposomes) and its applications to the treatment of acquired diseases. Mol. Membr. Biol. 16, 119-122 (1999). 7. Kohn, D. B. Gene therapy for genetic haematological disorders and immunodeficiencies. J. Inter. Med. 249, 379- 390 (2001). 109 Summary Gene delivery system and its application in gene therapy Human gene therapy (HGT) is one of the new therapeutic approaches emerging from this molecular biology and biotechnology revolution. HGT is defined as the transfer of nucleic acides (DNA) to somatic cells of a patient, which results in a therapeutic effect, by either correcting genetic defects or by overexpressing proteins that are therapeutically useful. HGT is a complex process, involving multiple steps in the human body including delivery to organs, tissue targeting, cellular trafficking, regulation of gene expression level and duration, biological activity of therapeutic protein, safety of the vector and gene product ect, most of which are not completely understood. However, over the recent years, significant progress has been made in various enabling technologies, in the molecular understanding of diseases and the manufacturing of vectors. The technical advances together with the ever increasing knowledge and experience in the field will undoubtedly lead to the realization of the potential of HGT in medicine. 110 . thấp. Trong bài viết này, tác giả đề cập đến các phơng tiện chuyển tải gen, khâu then chốt nhất trong liệu pháp điều trị gen. Hệ thống chuyển tải gen. Hệ thống chuyển tải gen và ứng dụng trong liệu pháp điều trị gen TS. Tạ Thành Văn Bộ môn Hóa-Hóa sinh, Trờng