TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Định lợng mô, tế bào bằng phân tích hình ảnh (Quantifying tissues, cells by image analysis) Trịnh Bình* Trờng Đại học Y Hà Nội Phân tích hình ảnh bằng máy tính điện tử thờng đợc dùng trong các lĩnh vực: chế tạo và kiểm tra các sản phẩm, khoa học ngời máyVới những u điểm của nó, phơng pháp này cũng đã đợc áp dụng trong lĩnh vực y sinh học để phân tích tế bào và mô qua kính hiển vi (sinh học, ung th học, huyết học, phụ khoa, di truyền tế bào, mô bệnh học). Trớc đây, các phơng pháp định lợng mô tế bào tốn rất nhiều thời gian vì cần phân tích trực giác thông qua các phơng pháp đo đếm thủ công ở một lợng không nhỏ các tiêu bản hiển vi và trên các tấm ảnh siêu hiển vi, một việc làm rất mệt mỏi và nhàm chán. Ngày nay, với sự trợ giúp của máy tính điện tử, việc xử lý phân tích các hình ảnh và định lợng các cấu trúc tế bào và mô đã đợc thực hiện một cách nhanh chóng. Trong công việc hàng ngày của các nhà sinh học, tế bào học và di truyền, mô bệnh học thờng có một số yêu cầu về định lợng nh sau: Định lợng tế bào, mô để bổ sung cho những đánh giá về mặt định tính. Nhận dạng những đối tợng trong các mẫu mô bổ sung cho những quan sát chủ quan của con ngời (tế bào ác tính, tế bào gián phân, các nguyên bào, phì đại cấu trúc) Hiểu đợc cách sắp xếp phân bố của các đối tợng thông qua những hình ảnh của chúng (động học tế bào, mức bội thể, loạn sản, mức biệt hoá) nhằm kiểm định những nhận xét trực giác theo thói quen của ngời quan sát. Để đạt đợc những yêu cầu này, cần có một tổ hợp kính hiển vi định lợng, bao gồm một kính hiển vi có chất lợng cao nối với một máy dò quang và máy vi tính kèm theo phần mềm định lợng chuyên dụng có đủ khả năng thu nhận, xử lý, phân tích các hình ảnh của các tế bào và mô. A. Những nguyên lý của phơng pháp định lợng hiển vi Phơng pháp định lợng hiển vi là sự phối hợp của hai kỹ thuật quen thuộc, đó là kỹ thuật hiển vi và kỹ thuật đo ánh sáng, cho phép định lợng đợc những hình ảnh hiển vi; trong những trờng hợp nhất định, định lợng đợc hàm lợng của một số chất ở mức tế bào và dới tế bào. Lĩnh vực áp dụng của phơng pháp đo quang hiển vi này đợc chia thành 2 loại, trên cơ sở cách quan sát hiển vi, đó là: - Quan sát bằng ánh sáng truyền qua một lát cắt mô hoặc phiến đồ, lát cắt mô này có khả năng hấp thụ ánh sáng. Sự hấp thụ ánh sáng có thể do chính chất liệu của mẫu mô (phơng pháp hiển vi tơng phản), hoặc do sự hấp thụ mầu sắc khác nhau của chất liệu mẫu mô (phơng pháp tiêu bản nhuộm mầu). - Quan sát bằng ánh sáng phát ra từ lát cắt mô sau khi đợc một nguồn sáng kích thích phù hợp (phơng pháp huỳnh quang nhân tạo gắn chất huỳnh quang với các thành phần tế bào) Phân tích hình ảnh bằng phơng pháp hiển vi dựa trên cơ sở đo đếm những điểm của một cấu trúc qua kính hiển vi mà lợng ánh sáng đi qua đã bị hấp thụ hoặc đợc phát ra. Lặp lại việc đo đếm này bằng cách quét tất cả các điểm thuộc cấu trúc và nền bao quanh cấu trúc. Hình ảnh của cấu trúc đó sẽ đợc tái hiện dới dạng một ma trận số và sau đó đợc máy tính điện tử xử lý. Thứ tự các bớc sơ đồ hoá nh sau: Thu nhận hình ảnh với sự trợ giúp của thiết bị có năng lực thu nhận ánh sáng và có độ phân giải cao. Cải thiện hình ảnh: Làm cho hình ảnh có độ 9 * GS. TS. Chủ nhiệm Bộ môn Mô - Phôi, Trờng Đại học Y Hà Nội. TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 tơng phản cao hơn và tính toán các tham số trác quang. Phân đoạn và xếp loại đối tợng: Nhận diện, đánh dấu, giới hạn của cấu trúc cần đo đếm có trong hình ảnh. Tham số hoá: Mô tả các đối tợng cần đo đếm bằng một danh mục các số đo về hình dáng, mật độ, sự phát quang, mầu sắc và cách sắp xếp. Phân tích các dữ liệu: Từ các dãy số của từng đối tợng nghiên cứu so sánh giữa các số liệu, lập biểu đồ, tìm ý nghĩa. Thu nhận hình ảnh: Hình ảnh trên kính hiển vi đợc một camera kỹ thuật số (đen trắng hoặc mầu) chuyển thành dạng một bảng trị số (đợc số hoá) và truyền sang máy vi tính. Gồm các bớc: Thu nhận hình ảnh quang học chuyển thành tín hiệu điện, do thiết bị trác quang thực hiện. Các tín hiệu đợc truyền qua một card thu nhận gắn tại máy vi tính. Chuyển những tín hiệu điện tơng đồng thành những số tơng đồng; hình thành một ma trận số. Thiết bị thu nhận và chuyển thành hình ảnh số gồm: một máy dò quang kết hợp với hệ thống tìm quét và thiết bị đổi tín hiệu điện tơng đồng thành tín hiệu số. Thiết bị số hoá này đợc chế tạo tuỳ theo chức năng và có năng lực làm việc riêng tuỳ loại. Với những ảnh siêu cấu trúc (hình ảnh đen trắng), việc thu nhận hình ảnh đợc thực hiện bởi một máy quét ảnh kỹ thuật số. Sau thao tác quét ảnh, hình ảnh siêu cấu trúc cũng đợc chuyển tới máy tính dới dạng một ma trận số và đợc tái hiện lên màn hình của máy vi tính. Cải thiện hình ảnh Thao tác trên máy vi tính theo chơng trình phần mềm xử lý hình ảnh để tăng cờng chất lợng ảnh (tăng độ tơng phản, xác định ranh giới, tăng giảm mầu sắc); các tín hiệu số trong máy tính cũng đợc tự động điều chỉnh theo. Có 4 cách cải thiện hình ảnh: * Thay đổi về biên độ (sửa đổi dãy số của giá trị xám). * Chuyển đổi hình ảnh trong không gian. * Chuyển đổi hình ảnh mầu theo nguyên lý phân tích của Fourier. * Chuyển đổi hình ảnh bằng phơng pháp mầu giả. Lu ý là không có một cách tổng quát để cải thiện hình ảnh. Vì vậy, cần lựa chọn cách thích hợp cho mỗi loại đối tợng cần phân tích đo đếm. Phân đoạn và xếp loại các đối tợng. Việc phân đoạn các đối tợng cần định lợng trong hình ảnh, do máy tính tự hoạt động, theo lệnh của ngời điều khiển. Các thông tin thừa của ảnh sẽ đợc loại bỏ. Có 2 phơng pháp phân đoạn đối tợng: Phơng pháp dò tìm vùng - Nguyên lý của phơng pháp này là xem xét một đối tợng trong ảnh nh là một tập hợp các điểm giống và khác nhau trong không gian, mà biểu hiện của chúng là cờng độ sáng hoặc mầu sắc đối với cùng một nguồn sáng chuẩn. Phơng pháp này đáp ứng yêu cầu tìm hiểu sự phân bố của những mức độ xám hoặc mức độ mầu có trong ảnh. Phơng pháp phát hiện giới hạn - Ngời điểu khiển chỉ cần làm thao tác viền quanh các đối tợng cần đo đếm. Mỗi đờng viền quanh cấu trúc là tập hợp các điểm giới hạn của cấu trúc đó. Máy chỉ dò tìm và ghi nhận những cấu trúc có đờng viền đợc giới hạn. Những điều cần lu ý: Phân đoạn hình ảnh là bớc khó khăn và đặc hiệu khi áp dụng cho từng loại đối tợng. Cần có những chỉnh lý cần thiết của ngời đo đếm bằng cách nhắp chuột máy vi tính. Việc phân đoạn đối tợng do máy đảm nhiệm, cho nên về kết quả không thể so sánh đợc với hình ảnh chính do mắt - não nhận biết. Phân đoạn đối tợng là hình ảnh sinh học do máy thực hiện tự động, khi tái lập hình ảnh không thể hoàn hảo. Nếu phối hợp các phơng pháp phân đoạn khác nhau, có thể giảm bớt các nhợc điểm này. 10 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Sau phân đoạn là bớc xếp loại đối tợng theo các tín hiệu số. Những điểm tơng đồng của cấu trúc sẽ đợc sắp xếp lại dới cùng một nhóm. Tham số hoá. Đây là bớc tự động của máy, cho phép xác định các số đo đối với đối tợng mà ngời quan sát quan tâm. Có 4 loại tham số lớn: Tham số hình thái Tham số trác quang Tham số đo màu Tham số kết cấu Tham số hình thái Tham số hình thái đợc xác định trên hình ảnh không gian hai chiều (hình ảnh nhị nguyên). Cứ mỗi điểm là một thông tin về vùng (diện tích của đối tợng hoặc chất nền) hoặc là một thông tin về đờng viền quanh đối tợng (chu vi). Hai loại tham số hình thái đợc dùng nhiều là: diện tích và chu vi của đối tợng cần nghiên cứu. Trên nguyên tắc, tham số diện tích của một đối tợng là tổng số các điểm rơi vào bề mặt của đối tợng; tham số chu vi là tổng số điểm rơi vào đờng xác định ranh giới của đối tợng. Tham số trác quang Sự phát triển của phơng pháp đo quang đợc đánh dấu bởi công trình của Casperson vào năm 1936 (phát triển lý thuyết cơ bản về việc lợi dụng đặc tính phát quang của các thành phần cấu tạo tế bào (nh ARN và ADN) để đo số lợng của chúng trong các tế bào nguyên vẹn) Phơng pháp đo quang phụ thuộc vào những đặc tính của từng máy dò quang đợc chế tạo sẵn. Máy dò quang sẽ tập hợp lại các tia sáng khi qua cấu trúc bị mầu hấp thu, các chất phát huỳnh quang, những chất đồng vị phóng xạ, những kháng thể (gắn trực tiếp hoặc gián tiếp với enzyme hoặc một chất phát huỳnh quang), những cơ chất sinh mầu hoặc cơ chất sinh huỳnh quang, những acid nucleic có khả năng lai cặp in situ với một enzyme hoặc một chất phát huỳnh quang. Thí dụ: trên tiêu bản hiển vi huỳnh quang, cờng độ phát huỳnh quang đợc tính bằng tổng cờng độ phát huỳnh quang ở mỗi điểm của đối tợng. Có 2 tham số huỳnh quang hay đợc khai thác, đó là: Tham số phát huỳnh quang toàn phần (tổng cờng độ phát quang trên toàn bộ bề mặt đối tợng) Tham số phát huỳnh quang trung bình (cờng độ phát quang bình quân trên một đơn vị diện tích bề mặt mẫu quan sát). Tham số đo mầu Trên cơ sở mô hình của Hering, Garbay (1979) đã phát triển khái niệm đo mầu phù hợp với nguyên lý tiếp nhận mầu sắc của mắt ngời. Ngời ta nhận thấy: việc khôi phục lại một hình ảnh mầu có thể đợc thực hiện khi làm chồng lên nhau của 3 hình ảnh đơn sắc đỏ, xanh lá cây và xanh da trời. Khi ánh sáng đi qua một cấu trúc nhuộm mầu, chúng sẽ bị hấp thụ khác nhau. Các tham số đo mầu còn liên quan đến 3 khái niệm bổ trợ đó là: độ chói, sắc thái và sự bão hoà của màu. Trong đó, độ chói biểu hiện cờng độ của tia phát ra từ đối tợng quan sát; sắc thái màu của đối tợng đợc quyết định bởi bớc sóng phù hợp khi tia sáng đơn sắc đi qua chúng; sự bão hoà biểu thị yếu tố phù hợp với yếu tố loãng mầu kết hợp với bớc sóng trội thu đợc sắc thái và ánh sáng trắng. Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực camera màu cho phép cùng một lúc xác định đồng thời 3 mà phát huỳnh quang. Tham số kết cấu Đây là những tham số giúp nhận biết đợc sự sắp xếp, tổ chức của cấu trúc cần nghiên cứu. Thí dụ: nhận biết đợc mật độ phát huỳnh quang các vùng khác nhau của đối tợng; tần số xuất hiện và sự phân bố trong không gian của các vùng phát quang này. Trong thực tế, các nhà tế bào học và mô bệnh học thờng quan tâm đến cách sắp xếp của chất nhiễm sắc trong nhân tế bào, từ đó tìm hiểu mối liên quan giữa kết cấu và trạng thái chức năng của tế bào đợc quan sát. Từ thí dụ này, có thể ghi nhận 3 loại thông tin có thể rút ra đợc (1) về độ tập trung của chất nhiễm sắc, (2) sự phân bố của chất nhiễm sắc và (3) cách sắp xếp của chất nhiễm sắc. Tất nhiên cả 3 thông tin này phụ thuộc rất nhiều vào tính phức tạp của các hiện tợng sinh học. 11 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 1. Phải chuẩn hoá các phơng pháp chuẩn bị các mẫu nghiên cứu (lát cắt mỏng, phiến đồ, tiêu bản áp) ở tất cả các bớc nh cố định, cắt lát, nhuộm mầu, làm phản ứng Khi phân tích xác định tham số kết cấu một cấu trúc, có thể dùng 3 cách tính gần đúng: Tính số liệu gần đúng của toàn bộ hình ảnh quan sát (không khai thác những kết cấu cơ bản) 2. Phơng pháp định lợng hiển vi dựa trên cơ sở nguyên lý hoá sinh và vật lý, do đó các lĩnh vực áp dụng phải hợp thức, đúng giới hạn và đợc kiểm soát kỹ càng (lợng mầu và các thuốc thử phản ứng, chiều dầy và khoảng cách giữa các lát cắt mang phân tích) Tính số liệu gần đúng ngẫu nhiên tuỳ theo cách sắp xếp trong không gian của những kết cấu cơ bản, sự phụ thuộc của các kết cấu cơ bản này với kết cấu cơ bản khác. Nh vậy, kết cấu đầy đủ của một đối tợng sẽ đợc xác định nh một thực thể trọn vẹn. 3. Để có tính chính xác khi tái hiện và so sánh kết quả trong cùng một labo. và giữa các labo. khác nhau, phải: Tính số liệu gần đúng của kết cấu đối tợng trên cơ sở xác định rõ từng kết cấu cơ bản của đối tợng. Mỗi kết cấu cơ bản đợc coi là một vùng trọn vẹn. Qui định kiểm tra định kỳ chất lợng các phơng tiện, kỹ thuật Phân tích các dữ liệu Các phơng pháp tập hợp các số liệu và thống kê phân loại nhằm cung cấp các thông tin phục vụ cho việc mô tả và tái hiện một cách khái quát các tham số đã xác định trên một lợng lớn hình ảnh đã phân tích. Thống kê phân loại là phơng pháp đặt các trị số đã đo đếm trên các quần thể tế bào giống nhau và khác nhau trên cơ sở một số ít đặc điểm theo một hớng khảo sát nh: phân tích các hàm số phân bố, các số đo phối hợp (trung tuyến, trung bình, phơng thức (mode), kiểu lệch, lệch đối xứng, tham số độ thoải); các test so sánh các giá trị trung bình, các tỉ lệ, các phơng sai và mối quan hệ Mỗi phơng pháp phân tích là một công cụ đặc biệt để cho phép giải một loạt những vấn đề đặt ra, nh: (1) phán đoán những quần thể không đồng nhất trên cơ sở phân tích so sánh, (2) so sánh các quần thể bằng phân biệt các thừa số; (3) Xếp loại các cấu thành của một quần thể bằng phân tích biệt số; (4) Phân tích các quần thể bằng phơng pháp tạo cụm và phân tích đa thừa số. B. Vấn đề tiêu chuẩn hoá mẫu và chuẩn hoá phơng tiện định lợng phân tích hình ảnh Những phơng pháp định lợng hiển vi đòi hỏi tính chính xác và tính đặc hiệu của các tham số thu đợc, đối với từng lĩnh vực áp dụng. Vì vâỵ, dù áp dụng phơng pháp nào, cũng phải lu ý những yêu cầu sau: Đa vào phần mềm định lợng những qui trình thao tác của các test, sự định cỡ của dụng cụ phơng tiện, Thiết lập phơng pháp định lợng thích hợp nhất chính xác nhất và có độ nhậy nhất Thiết lập những mối liên hệ giữa các tham số có ý nghĩa, xây dựng các chuẩn để chẩn đoán phân biệt và so sánh với kết quả của các tác giả khác. TàI liệu tham khảo 1. Weibel, E. R. And H. Elias (1967). Quantitative methode in morphology. Springer, Berlin, Heidelberg New York. 2. Weibel, E. R (1969). Stereological principles for morphometry in Electronmicroscopy cytology. Int. Rev. Cytol. 26, 235 - 302. 3. John J. Bozzola and Lonnie D. Russell (1990). Quantitative Electron Microscopy. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. Jones and Bartlett Publishers. Boston - London. Metezeau, P and M. H. Ratinaud (1994). Cytometrie par fluorescence. Apports comperatifs des techniques: flux, image et confocale. Paris. Inserm. 12 . Định lợng mô, tế bào bằng phân tích hình ảnh (Quantifying tissues, cells by image analysis) Trịnh Bình* Trờng Đại học Y Hà Nội Phân tích hình ảnh. ngời (tế bào ác tính, tế bào gián phân, các nguyên bào, phì đại cấu trúc) Hiểu đợc cách sắp xếp phân bố của các đối tợng thông qua những hình ảnh của