103 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 48, 2008 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU CHO SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC HÒA TAN PHOSPHATE VÔ CƠ Phạm Thị Ngọc Lan Trần Thị Thanh Nhàn Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế TÓM TẮT Phân lân là một trong ba dưỡng chất cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Bón phân lân nhất là phân lân, hoá học vào những vùng đất có pH thấp hoặc cao hầu hết chúng đều chuyển sang thể cố định khó hoà tan nên cây trồng không thể hấp thụ được. Việc sử dụng kếp hợp phân lân sinh học và hoá học sẽ nâng cao hiệu quả sử dụng lân hoá học cho cây nhờ sự hoà tan các dạng phosphate khó tan thành dễ tan của các vi sinh vật sống trong đất [2, 4]. Nấm mốc hòa tan phosphate khó tan là đối tượng đang được chú ý để sản xuất phân bón sinh học. Vì vậy, thăm dò điều kiện nuôi cấy tối ưu của các chủng nấm mốc có hoạt lực hòa tan phosphate mạnh là thực sự cần thiết để thu nhận sinh khối phục vụ cho sản xuất phân sinh học. 1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 1.1. Đối tượng nghiên cứu Hai chủng nấm mốc M 8 và M 24 có khả năng hòa tan phosphate vô cơ được phân lập từ đất trồng hoa màu ở tỉnh Thừa Thiên Huế. Chủng giống được lưu giữ tại bộ môn Sinh lí – Sinh hóa – Vi sinh, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế. 1.2. Phương pháp nghiên cứu - Thu nhận sinh khối nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy lắc trong môi trường Czapeck dịch thể có bổ sung Ca 3 (PO 4 ) 2 thay thế nguồn K 2 HPO 4 [1]. Thành phần môi trường (g/l): Saccharose 30 NaNO 3 3,5 MgSO 4 0,5 KCl 0,5 FeSO 4 0,01 Ca 3 (PO 4 ) 2 10 Agar - agar 30 H 2 O 1000 ml - Xác định sinh khối nấm mốc bằng phương pháp cân trọng lượng khô (độ chính xác 0,001g). 1.3. X ử lý số liệu S ố liệu được xử lý bằng thống kê sinh học theo chương trình vi tính MS Excel và phần mềm Origin 6.0. 104 2. Kết quả nghiên cứu 2.1. Thăm dò thời gian thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm mốc M 8 và M 24 , tiến hành nuôi cấy lắc trong môi trường Czapeck dịch thể. Sau từng khoảng thời gian 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h và 144 h, thu sinh khối, sấy khô đến trọng lượng không đổi. Kết quả được trình bày ở bảng 1. Qua bảng 1 cho thấy, trong quá trình nuôi cấy lắc các chủng nấm mốc có khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối mạnh trong khoảng thời gian từ 48 h đến 120 h. Chủng M 8 tích lũy sinh khối mạnh sau 96 h nuôi cấy (sinh khối khô đạt 6,586 mg/ml), chủng M 24 là 120 h (sinh khối khô đạt 7,210 mg/ml). Bảng 1. Thăm dò thời gian thích hợp cho sinh trưởng phát triển của chủng nấm mốc M 8 và M 24 Chủng nấm mốc Thời gian (h) Sinh khối (mg/ml) M 8 0 1,980 ± 0,020 24 2,549 ± 0,056 48 2,913 ± 0,017 72 3,400 ± 0,131 96 6,586 ± 0,026 120 5,620 ± 0,021 144 2,765 ± 0,055 M 24 0 2,000 ± 0,001 24 3,203 ± 0,008 48 3,601 ± 0,011 72 4,601 ± 0,004 96 5,195 ± 0,005 120 7,210 ± 0,001 144 4,839 ± 0,044 2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Các chủng nấm mốc được nuôi cấy tĩnh trong môi trường dịch thể ở các mức nhiệt độ: 20 0 C, 25 0 C, 30 0 C, 35 0 C và 40 0 C. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 96 h nuôi cấy đối với chủng M 8 và 120 h đối với chủng M 24 . Kết quả được thể hiện ở hình 1. 105 Hình 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển của chủng M 8 và M 24 Qua hình 1 cho thấy, các chủng nấm mốc nghiên cứu đều có khả năng tích lũy sinh khối trong khoảng nhiệt độ 25 0 C – 35 0 C, sau đó giảm mạnh ở mức nhiệt độ 40 0 C (sinh khối chỉ đạt 1,404 mg/ml đối với chủng M 8 và chỉ 1,619 mg/ml đối với chủng M 24 ). Khoảng nhiệt độ tối thích cho hai chủng nấm mốc là 30 0 C. Ở nhiệt độ nuôi cấy này sinh khối chủng M 8 đạt 2,618 mg/ml và chủng M 24 là 3,899 mg/ml. Điều này cho thấy các chủng nấm mốc này thuộc nhóm ưa ấm. Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan (2003), chủng vi khuNn hòa tan phosphate P 4 và P 54 (phân lập từ đất trồng lúa) cũng sinh trưởng tốt ở khoảng nhiệt độ 32 0 – 34 0 C [3]. 2.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm mốc trong môi trường đệm Britton và Robinson (pH 3 – 9). Kết quả được trình bày ở hình 2. Hình 2. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng, phát triển của chủng M 8 và M 24 106 Từ kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, các chủng nấm mốc M 8 và M 24 có biên độ thích ứng với độ pH tương đối hẹp, pH môi trường thích hợp là khoảng 5 – 7 và cả hai chủng nấm mốc đều sinh trưởng cực đại ở pH = 6. Sinh khối của chủng M 8 đạt 5,000 mg/ml và chủng M 24 đạt 6,863 mg/ml. 2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 3. Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng, phát triển của chủng M 8 và M 24 Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, trong môi trường nuôi cấy với các nguồn carbon khác nhau thì khả năng tích lũy sinh khối của các chủng nấm mốc là không giống nhau. Nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển của cả hai chủng nấm mốc M 8 và M 24 là saccharose (chủng M 8 đạt 4,509mg/ml và chủng M 24 đạt 6,204mg/ml) sau đó giảm dần từ glucose, rỉ đường đến lactose, còn nguồn tinh bột cho sinh khối thấp nhất. Với môi trường có bổ sung saccharose các chủng nấm mốc có khả năng tích lũy sinh khối mạnh nhất nhưng xét về mặt kinh tế, để thu nhận lượng lớn sinh khối nấm mốc cho sản xuất phân sinh học thì việc sử dụng rỉ đường (chủng M 8 đạt sinh khối 3,651mg/ml và chủng M 24 đạt 4,150mg/ml) vẫn hiệu quả. Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan (2003), ở chủng vi khuNn hòa tan phosphate P 4 và P 54 thì nguồn glucose là thích hợp nhất để thu sinh khối, tiếp đến là nguồn rỉ đường [3]. 2.5. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Nuôi cấy 2 chủng nấm mốc trong môi trường dịch thể với các nguồn nitrogen khác nhau: KNO 3 , NaNO 3 , (NH 4 ) 2 SO 4 , peptone. Kết quả được biểu diễn ở hình 4. 0 1 2 3 4 5 6 7 M 8 M 24 Nguồn carbon Sinh khối (mg/ml) Glucose Rỉ ñường Lactose Tinh bột Saccharose 107 Hình 4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sinh trưởng, phát triển của chủng M 8 và M 24 Như vậy, cả hai chủng nấm mốc đều sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong môi trường nuôi cấy có bổ sung nguồn peptone (chủng M 8 đạt 5,715 mg/ml và chủng M 24 đạt 6,922 mg/ml), tiếp đó là (NH 4 ) 2 SO 4 , NaNO 3 và cho sinh khối thấp nhất là môi trường có bổ sung KNO 3 . Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thanh Hà và Nguyễn Thị Phương Chi (1999), chủng nấm mốc phân giải phosphorus MN1 cho sinh khối cực đại với nguồn nitrogen bổ sung là (NH 4 ) 2 SO 4 nhưng chủng ĐT1 lại thích hợp với nguồn NaNO 3 [2]. Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan [3] ở chủng vi khuNn phân giải phosphorus P 4 và P 54 cũng tích lũy sinh khối mạnh khi nuôi cấy với nguồn nitrogen là (NH 4 ) 2 SO 4 . 3. Kết luận Trong môi trường có bổ sung nguồn carbon là saccharose, nguồn nitrogen là peptone, pH môi trường = 6, nhiệt độ nuôi cấy là 30 0 C, nấm mốc có khả năng tích lũy sinh khối mạnh nhất sau 96h đối với chủng M 8 và 120 h đối với chủng M 24 . TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, Tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1977. 2. Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi, Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên khả năng phân giải phôtpho khó tan của các chủng nấm sợi MN1 và ĐT1, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà N ội, (1999), 434 – 439. 3. Phạm Thị Ngọc Lan, Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự sinh tr ưởng và phát triển của vi khun phân giải photpho khó tan, Tạp chí Sinh h ọc, Tập 25, số 1A, (2003), 164 –168. 4. Kapoor K. K., Phosphate mobilization through soil microorganisms, Plant Microbe Interaction in Sustainable Agriculture, CCSHAU, Hisar and MMB, New Delhi, (1996), 46 – 61. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 M 8 M 24 Sinh khối (mg/ml) Peptone (NH 4 ) 2 SO 4 NaNO 3 KNO 3 Nguồn nitrogen 108 OPTIMAL CONDITIONS FOR THE GROWTH AND THE DEVELOPMENT OF PHOSPHATE DISSOLVING FUNGI Pham Thi Ngoc Lan Tran Thi Thanh nhan College of Sciences, Hue University SUMMARY The studies on cultural conditions have indicated that two phosphate dissolving fungi strains M 8 and M 24 have the best increase of biomass in the Czapeck medium added saccharose and peptone at pH = 6, cultural temperature 30 0 C after 96 - 120 hours. . HỌC, Đại học Huế, Số 48, 2008 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU CHO SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC HÒA TAN PHOSPHATE VÔ CƠ Phạm Thị Ngọc. 2.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm mốc trong môi