BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000 *** NGUYỄN MINH NAM NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN MINH NAM Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student A.Professor. Dr. BUI CACH TUYEN NGUYEN MINH NAM Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 LễỉI CAM TAẽ Con xin thnh kớnh khc ghi cự lao ca cha m, Ngi ó sinh thnh, dng dc v hy sinh tt c cho anh em con c n hc nờn ngi. Con xin cm n gia ỡnh ó l ch da vng chc cho con vng bc vt qua mi khú khn. Em xin chõn thnh cm n: Ban Giỏm Hiu Trng i Hc Nụng Lõm Tp. HCM, ban Ch Nhim b mụn Cụng Ngh Sinh Hc ó to iu kin cho em thc hin thnh cụng khúa lun. PGS. TS. Bựi Cỏch Tuyn ó tn tỡnh hng dn v to mi iu kin thun li em hon tt khúa lun ny. TS. Bựi Minh Trớ ó tn tỡnh dy bo v giỳp em trong sut thi gian qua. PGS. TS. Trn Th Dõn, TS. Nguyn Ngc Hi, ThS. Trn Nht Phng ó giỳp em gii quyt nhng vng mc trong quỏ trỡnh thc hin khúa lun. Ton th Thy, Cụ ó trang b cho em nhng kin thc quớ bỏu. TS. M. Irey (USDA) ó tn tỡnh cung cp trỡnh t primers v protocol RT- PCR cho em. TS. Tania (South African Sugarcane Research Institute) v TS. S. Schenck (HARC) ó tn tỡnh cung cp antiserum ca ScYLV cho em. TS. Becky (itdna company) ó cung cp cho em nhng ti liu quớ giỏ. Anh H ỡnh Tun v anh Thng Trung tõm Nghiờn cu Mớa ng An Phỳ, cỏc anh tri ging c Hu, Long An v cỏc h dõn xó Phỳ Lý, Vnh Cu, ng Nai ó to mi iu kin thun li v giỳp em trong quỏ trỡnh thu thp mu. Cỏc Thy, Cụ v anh ch ti Trung tõm Phõn tớch Húa Sinh ó ht lũng giỳp v cho em nhng kinh nghim quớ bỏu em thc hin thnh cụng khúa lun ny. Cỏc bn lp cụng ngh sinh hc 28 ó luụn bờn mỡnh, ng viờn v nhit tỡnh giỳp mỡnh trong sut thi gian mỡnh hc tp cng nh trong lỳc mỡnh thc hin khúa lun ny. Tp H Chớ Minh, ngy 30 thỏng 08 nm 2006 Nguyn Minh Nam TÓM TẮT Nguyễn Minh Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM. Tháng 9 năm 2006. “NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Quản lý Môi trƣờng và Tài nguyên Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh; Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một từ tháng 3/2006 đến tháng 8/2006. Triệu chứng vàng gân lá trên mía do sugarcane yellow leaf virus gây ra, đây là một tác nhân gây bệnh quan trọng. Bệnh này đã xảy ra ở nhiều vùng trồng mía trên thế giới. ScYLV tập trung trong bó mạch libe của cây. Triệu chứng của bệnh thƣờng xuất hiện ở cây trƣởng thành với biểu hiện vàng ở gân lá. Bệnh này có thể đƣợc chẩn đoán dựa vào biểu hiện triệu chứng, kỹ thuật RT-PCR, ELISA, TBIA, ISEM, kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi huỳnh quang. Nội dung của đề tài bao gồm: - Phát hiện sự nhiễm ScYLV dựa vào triệu chứng. - Kiểm tra các bó mạch libe của cây có và không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang. - Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi YLS111 và YLS462. Kết quả của đề tài: - Triệu chứng vàng gân lá trên mía đã xuất hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bình Dƣơng; xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai; xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An, xã Tân An, Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. - Đối với cây có biểu hiện triệu chứng thì bó mạch libe có sự phát huỳnh quang trong khi bó mạch của cây bình thƣờng thì không. - Xây dựng đƣợc qui trình RT-PCR có thể chẩn đoán ScYLV. SUMMARY The thesis entitled “RESEARCH ON SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS, THE CAUSAL AGENT OF YELLOW LEAF SYNDROME IN SACCHARUM BY FLUORESCENCE MICROCOPY AND RT-PCR METHOD”. This research was conducted from 3th, 2006 to 8th, 2006 in the laboratory of Biological and Chemical Analysis Center of Nong Lam University; Research Center for Environmental Technology and Nature Resource Management of Nong Lam University; and at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. Sugarcane yellow leaf syndrome is caused by sugarcane yellow leaf virus, being a pathogen of economic importance. The disease has been reported to occur in many sugarcane growing area worldwide. Sugarcane yellow leaf virus resides in the phloem of diseased canes. Symptoms of the disease generally appear in maturing plant as a yellowing of the leaf midrib. The disease can be diagnosed by symptoms, RT- PCR, ELISA, TBIA, ISEM, EM or fluorescence microcopy. The objectives of this research are as follows: - To identify ScYLV infecting plants by symptoms. - To examine the phloem of plant with symptom and symptom less plant by light microcopy and fluorescence microcopy. - To diagnose the ScYLV by RT-PCR with YLS111 and YLS462 primers. The results of this research are as follows: - Sugarcane yellow leaf syndrome has been present in sugarcane grown at Institute of Sugarcane Research of An Phu; Phu Ly village, Vinh Cuu district, Dong Nai province; My Thanh Tay village, Duc Hue district, Long An province, Tan An village, Thu Dau Mot town, Binh Duong province. - In plants expressing disease symptom, the vascular bundles presented fluorescence in the phloem while symtomless plants do not have fluorescence. - Finding out the RT-PCR process that can be used for ScYLV diagnosis. iv MC LC CHNG TRANG Trang ta LễỉI CAM TAẽ i TểM TT ii MC LC iv DANH SCH CC T VIT TT vi DANH SCH CC BNG V BIU vii DANH SCH CC HèNH vii PHN 1. M U 1 1.1 t vn 1 1.2 Mc ớch 2 1.3 Yờu Cu 2 PHN 2. TNG QUAN TI LIU 3 2.1 Tng quan v cõy mớa 3 2.1.1 V cõy mớa 3 2.1.2 Mt s bnh do virus trờn cõy mớa 5 2.2 Bnh vng gõn lỏ trờn mớa v sugarcane yellow leaf virus 7 2.2.1 Bnh vng gõn lỏ trờn mớa 7 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 9 2.2.3 nh hng v kinh t ca bnh vng gõn lỏ 15 2.2.4 Nhng nghiờn cu v tớnh khỏng ScYLV trờn mớa 16 2.2.5 To cõy mớa chuyn gene khỏng ScYLV 16 2.2.6 To cõy mớa sch bnh bng k thut nuụi cy mụ 17 2.2.7 Mt s k thut trong chn oỏn ScYLV 17 2.3 Nhng nghiờn cu v ScYLV trờn th gii v vit nam 25 2.3.1 Nhng nghiờn cu v ScYLV trờn th gii 25 2.3.2 Nhng nghiờn cu v ScYLV Vit Nam 26 2.4 K thut PCR v RT-PCR 27 2.4.1 PCR 27 2.4.2 RT-PCR 28 PHN 3. VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 30 3.1 Thi gian v a im nghiờn cu 30 v 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu 30 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 31 3.3.1 Máy móc, thiết bị 31 3.3.2 Dụng cụ 31 3.4 Hóa chất 32 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR 32 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di 32 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang 33 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR 33 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA 33 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR 35 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa 35 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV 37 4.2 Kết quả chuẩn đoán dựa vào triệu chứng 39 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng 39 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng 40 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 42 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang 43 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey 46 4.5 Kết Quả RT-PCR 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp: Base pair BYDV: Barley Yellow Dwarf Luteovirus cDNA: complementary DNA CP: Coat Protein DAS-ELISA: Double Antibody Sandswich - ELISA DBIA: Dot-Blot Immunoassay DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxyribonucleic Acid dNTP: Deoxyribonucleoside Triphosphate dsRNA: double stranded RNA ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay EM: Electron Microscopy g: Gram ha: Hecta ISEM: Immunosorbent Electron Microscopy k Da: Kilo Dalton kg: Kilogram ml: Mililitre µl: Microlitre µm: Micrometre mm: Milimetre MP: Movement Protein mRNA: Messenger RNA NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification nm: Nanometre ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction PEMV: Pea enation mosaic virus PLRV: Potato leaf roll virus PTGS: Posttranscriptional Gene Silencing PVP: Polyvinylpyrrolidone RdRp: RNA dependent RNA polymerase RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCBV: Sugarcane bacilliform virus ScYLV: Sugarcane Yellow Leaf Virus SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SSR: Single Sequence Repeat ssRNA: Single stranded Ribonucleic Acid TIBA: Tissue Blot Immunoassay UTR: Untranslated Region YLS: Yellow Leaf Syndrome vii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng 39 Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng 40 Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống 42 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng 39 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng 41 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 43 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Sự phân bố của ScYLV trên thế giới 8 Hình 2.2. Sugarcane yellow leaf virus dƣới kính 9 Hình 2.3. Rệp lá bắp. Rệp có cánh (A,B), rệp không cánh (C) trƣởng thành. 11 Hình 2.4. Biểu đồ mô tả bộ gene của Luteovirus thuộc nhóm phụ I và II 12 Hình 2.5. Cấu trúc kẹp tóc giả định trong bộ gene của ScYLV 14 Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang 19 Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía 20 Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới) 21 Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh 22 Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV 22 Hình 2.11. Phân tử Beacon 23 Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR 27 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR 29 Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá 37 Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 37 Hình 4.3. Cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. 38 Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) 38 Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. 44 Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) 45 Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) 45 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR. 46 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR 47 [...]... cng nh ngun gc ca virus ny nc ta Vic chn oỏn v ỏnh giỏ tỡnh hỡnh, s hin din ngun gc v phõn b ca Sugarcane yellow leaf virus l rt cn thit trong vic hn ch v phũng nga thit hi do virus ny gõy ra ti Vit Nam Vi thc t trờn chỳng tụi thc hin ti: Nghiờn cu sugarcane yellow leaf virus gõy bnh vng lỏ trờn mớa (YLS) bng kớnh hin vi hunh quang v k thut RT-PCR 2 Mc ớch ư ỏnh giỏ tỡnh trng nhim virus ScYLV trờn... CP44-101 t Morocco ó cha virus hỡnh que tng t banana streak virus (BSV) c tỡm ra gn ú (Lockhart, 1986) Virus cú tờn l sugarcane bacilliform virus (SCBV) cú quan h gn vi BSV v chỳng c chng minh l cựng thuc mt loi virus (Lockhart v Olszewski, 1993) Triu chng ca SCBV thỡ thng bin i v khụng chc chn S ng nhim ca SCBV v cỏc virus khỏc ó c nhn thy Tt c cỏc dũng nhim vi sugarcane mild mosaic virus u nhim SCBV (Lockhart... PCR Triu chng, kớch thc, hỡnh dng virus v b gene RNA si ụi (dsRNA) chng t rng virus mi ny tng t vi FDV v thuc nhúm Reovirus 2.1.2.6 Fijivirus Nguyờn nhõn ca bnh Fiji trờn mớa l do h Reoviridae Bnh ny thng xy ra Australia Nú c truyn bi vector l Perkisiella sp planthoppers Bnh ny c phỏt hin da vo triu chng, RT-PCR hoc ELISA 2.1.2.7 Sugarcane mosaic virus (SCMV) õy l virus c phõn b rng rói, nhng s t phỏt... 1999) (trớch bi Schenck, 2001), Ecuador (Freddy, 2006), Sugarcane yellow leaf virus gõy thit hi kinh t ln trờn cỏc vựng trng mớa, thit hi c tớnh khong 40-60% Brazil v hn 20% cỏc vựng khỏc Vic chn oỏn s nhim virus v a ra cỏc bin phỏp phũng tr cú ý ngha kinh t rt ln Din tớch trng mớa nc ta ln, triu chng vng lỏ do virus Sugarcane yellow leaf virus cng ó xut hin nhiu ni Tuy vy, hin nay vn cha cú mt... Sugarcane yellow leaf virus l mt virus mi c mụ t gn õy, nú nhim vo mớa v gõy ra triu chng vng gõn lỏ (YLS) (Vega v cng s, 1997; Scagliusi v Lockhart, 2000) Ht virus ScYLV cú ng kớnh t 24-29 nm trong sodium phosphatungstate pH5 (hỡnh 2.2) Nú cú t trng l 1,30g/cm3 trong Cs2SO4 v cha 5,8 kb ssRNA Protein v cú trng lng 27 kDa v khụng cha glycosylate (Scagliusi v Lockhart, 2000) Hỡnh 2.2 Sugarcane yellow leaf virus. .. bt u vi trỡnh t ACAAAA thỡ phự hp vi motif u 5 ca polerovirus B gene ca ScYLV-F c sp xp ging nh poleovirus ORF0 ca ScYLV-F bt u codon AUG th nht trong trỡnh t v nú mó húa cho mt protein 30,2 kDa ORF1 ca ScYLV-F mó húa cho mt protein 72,5 kDa tng t vi gene tng ng trờn b gene ca polerovirus v Pea enation mosaic virus- 1 (PEMV-1; enamovirus) cng mó húa cho mt protease ORF2 ca SCYLV-F hu nh tng ng vi. .. trỡnh t 17kDa cho thy ScYLV cú quan h gn vi virus trong ging luteovirus Da trờn trỡnh t u 5 ca ScYLV thỡ thy nú tng t vi ging polerovirus, trong khi trỡnh t u 3 thỡ gn vi ging luteovirus õy l nhng mụ t u tiờn v c im phõn t ca ScYLV n (Gaur v cng s, 2003) Moonan v cng s (2000) ó gii trỡnh t b gene ScYLV Da trờn trỡnh t nucleotide mi ca ScYLV v trỡnh t ca luteovirus hin ti, ng thi s dng phng phỏp lun... tỡm vựng tng ng ca b gene luteovirus Kt qu cho thy t l thay th cỏc nucleotide v to ra loi mi ca luteovirus l cú ý ngha v phng din thng kờ Kt qu cng ch ra rng Pea enation mosaic virus- 1 (PEMV-1), Soybean dwarf virus (SbDV), v ScYLV biu hin bin d phỏt sinh chng loi a lý (spatial phylogenetic variation (SPV)) phự hp vi s tỏi t hp xy ra gia hai t tiờn l luteovirus v polerovirus sau khi cú s phõn li di truyn... i vi nhng cõy cú triu chng YLS thỡ brix cao hn t 2 n 3 ln so vi nhng cõy khe mnh Vega v cng s (1997) ó nhn thy s tớch ly fenola trong mch libe, iu ú chng t cú s ri lon chc nng ca mch dn nhng vựng lỏ khỏc nhau thỡ s gim tng lng ng, hm lng chlorophyl v s vn chuyn ng ó c nhn thy gia cõy cú triu chng v cõy khụng cú triu chng nhim vi virus ScYLV 2.2.2 Sugarcane yellow leaf virus 2.2.2.1 Virus ScYLV Sugarcane. .. ging mi trong h luteoviridae Virus ny cng cú nhng c tớnh ca ging polerovirus, luteovirus v enamovirus (Moonan v cng s, 2000; Smith v cng s, 2000) Tuy nhiờn, nú c mụ t rừ rng l mt loi khỏc vỡ nhng c tớnh sinh hc c nht v s khỏc bit mc phõn t m nú c xem l s tỏi t hp gia cỏc loi khỏc nhau (Moonan v cng s, 2000; Smith v cng s, 2000) Da vo trỡnh t v s sp xp ca cỏc khung c m (ORF), luteovirus c chia thnh hai . Tháng 9 năm 2006. “NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR đƣợc tiến. NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR