Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP TẠO KHÁNG THÊ IgG THỎ CỘNG HỢP SULFO - NHS - BIOTIN Sinh viên thực : Bùi Trung Luyn Na Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 : Công nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP TẠO KHÁNG THỂ IgG THỎ CỘNG HỢP SULFO - NHS - BIOTIN Sinh viên thực : Bùi Trung Luyn Na MSSV :1411533537 Lớp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Phương Thảo TP.HCM, tháng 08 năm 2018 LỜI CẢM ƠN Đe đề tài khóa luận tốt nghiệp thực thành cơng, tơi có trợ giúp nhiều người.Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đen thầy cô, anh chị bạn người yêu thương, quan tâm giúp đờ tơi suốt q trình tơi thực đe tài Cảm ơn nhà trường với thầy cô cùa khoa Công Nghệ Sinh Học Môi Trường tạo điều kiện cho em thực khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hữu Hùng, ThS Lê Thị Phương Thảo với anh chị phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng phịng Ưng thư - Te bào gốc, mơn Công Nghệ Sinh Học Y Dược, khoa Công Nghệ Sinh Học Mơi Trường tận tình hướng dần, dạy hồ trợ em suốt trinh thực đề tài Cảm ơn bạn Tiên, Thư, Tú tập thể lớp 14DSH02 giúp đờ suốt thời gian qua Cuối cùng, lời cảm ơn xin gửi đến gia đình người quan tâm bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện để tơi thực khóa luận cách suôn sẻ thành công Bùi Trung Luyn Na Khoa Công Nghệ Sinh Học Môi Trường Trường Đại học Nguyền Tất Thành ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ii Tóm tắt V Danh mục chừ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Đặt vấn đề CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Khái quát kháng thề IgG 1.2 ứng dụng IgG 1.3 Sắc ký lực qua cột protein G 1.3.1 Sắc ký lực 1.3.2 Protein G 1.4 Sulfo - NHS - Biotin 1.5 Các nghiên cứu nước nước 10 1.5.1 Các nghiên cứu nước 10 1.5.2 Các nghiên cứu nước 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 12 2.1 Vật liệu 12 2.1.1 Vật liệu đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Hóa chất 12 2.1.3 Trang thiết bị 15 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tủa huyết muối Ammonium Sulfate 16 2.2.2 Phương pháp thẩm tích 18 2.2.3 Định lượng phương pháp quang phổ 18 2.2.4 Phương pháp điện di biến tính (SDS-PAGE) 19 2.2.5 Phương pháp sắc ký lực 21 2.2.6 Phương pháp cộng hợp Sulfo - NHS - Biotin 21 2.2.7 Phương pháp Western Blot 22 iii 2.2.8 Phương pháp đánh giá protein sau tinh chế 23 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Ket khảo sát nồng độ Ammonium Sulfate tủa huyết thỏ 25 3.2 Ket sắc ký lực qua cột protein G 27 3.3 Kết cộng hợp Sulfo - NHS - Biotin 29 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 34 iv TÓM TẮT Đe tài: “Tạo kháng thể IgG thỏ cộng họp Sulfo - NHS - Biotin” thực từ tháng 02 năm 2018 đến tháng 08 năm 2018 phịng Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng phòng Ung thư - Te bào gốc, môn Công Nghệ Sinh Học Y Dược, khoa Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, với mục tiêu tạo tinh chế IgG từ huyết thỏ với độ tinh cao tạo IgG thỏ cộng hợp Sulfo - NHS - Biotin Đe tài có hai nội dung: (1) Thiết lập quy trình tinh chế IgG từ huyết thỏ gồm hai bước: Tủa miễn dịch sắc ký lực; (2) Cộng hợp Sulfo - NHS - Biotin lên IgG thỏ vừa tinh chế Đe tài thu số kết quả: Thiết lập quy trình tinh chế IgG thở phương pháp tủa miền dịch với muối Ammonium sulfate sắc ký lực qua cột protein G Thu IgG thỏ có độ tinh cao, khoảng 99,0% với hiệu tinh chế khoảng 9,6 mg/ml huyết ban đầu Cộng họp thành công kháng thể IgG thỏ sau tinh chế với Sulfo - NHS - Biotin V SUMARY Topic: “IgG rabbit antibody conjugate with Sulfo - NHS - Biotin” was conducted from February 2018 to August 2018 in Biochemistry - Biomedical Sciences - Parasitology and Cancer Deparment - Stem Cells, Deparment of Medicine Biotechnology, Biotechnology and Environment, Nguyen Tat Thanh University, aiming to create and purify IgG from rabbit serum with high purity The subject has two components: (1) Establishment of the purification process of rabbit serum IgG from two steps: Immunoassay and chromatography; (2) Producing refined rabbit IgG conjugated Sulfo - NHS - Biotin The subject has obtained some results: Establishment rabbit IgG purification process by two steps: precipitation immunity with Ammonium sulfate salt and protein affitify chromatography through protein G column Obtained IgG rabbit high purify about 99,0% with high recovery efficiency Successful in conjugating IgG rabbit antibodies after refining with Sulfo - NHS Biotin vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate AS Ammonium sulfate ATG Globulin chống ung thu đa bào - Antithymocyte Globulin BSA Albumin huyết bò - Bovine serum albumin Ch Domain co định chuồi nặng - Constant domain of heavy chain Cl Domain co định chuồi nhẹ - Constant domain of light chain dH2O Nước cat DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide ELISA Kỳ thuật chat hap thụ miền dịch gan enzyme - Enzyme-Link Immunosorber Assay Fab Phân mảnh gắn kháng nguyên - Fragment antigen binding Fc Phân mảnh kết tinh - Fragment crystallisable F1TC Fluorescein Isothiocyante HLA Kháng nguyên bạch cầu người - Human Leukocyte Antigen HRP Horseradish Peroxidase ICC/IF Hóa tế bào miền dịch/Miễn dịch huỳnh quang Immunocytochemistry/Immunofluoranscene 1HC Hóa mô miễn dịch - Immunohistochemistry Mer p - Mercaptoethanol PBS Phosphate - buffered saline SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBST Tris - buffered saline (TBS) + Tween 20 TEMED N,N,N ’ ,N ’-tetramethy lendiamine Vh Domain biến thiên chuồi nặng - Variable domain of heavy chain Vl Domain biến thiên chuồi nhẹ - Variable domain of light chain vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cơ chất phối tử tương ứng sắc ký lực Bảng 1.2 Ái lực protein A/G với kháng thể IgG thỏ số loài khác Bảng 1.3 Thành phần so protein chủ yếu huyết Bảng 2.1 Thành phần gel điện di Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài Bảng 3.1 Ket định lượng protein huyết thở sau tủa với AS nồng độ Bảng 3.2 Ket định lượng protein sau sắc ký viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc kháng IgG Hình 1.2 Liên kết giũa Sulfo - NHS - Biotin phân tử protein Hình 3.1 Ket tủa huyết thỏ với nong độ AS Hình 3.2 Ket sắc ký lực cột protein G Hình 3.3 Ket cộng hợp Sulfo - NHS - Biotin Hình S3.1 Ket đánh giá độ tinh IgG thỏ sau tinh chế phần mềm Quantity - One ix ... trình tạo kháng thể IgG thỏ phương pháp tủa phân đoạn với Ammonium sulfate sắc ký lực qua cột protein G - Thu kháng thể IgG thỏ có độ tinh cao - Cộng hợp thành công Sulfo - NHS - Biotin lên IgG thỏ. .. Thành, với mục tiêu tạo tinh chế IgG từ huyết thỏ với độ tinh cao tạo IgG thỏ cộng hợp Sulfo - NHS - Biotin Đe tài có hai nội dung: (1) Thiết lập quy trình tinh chế IgG từ huyết thỏ gồm hai bước:... đoán IgG cộng hợp HRP, IgG cộng hợp Biotin, IgG dê kháng IgG thó, dùng Western Blot, ELISA, Flow Cytometry, Kháng thể IgG thỏ đơn dịng đa dịng, dạng tồn phần tự nhiên hay qua chế biến loại kháng