Đang tải... (xem toàn văn)
báo cáo môn phân tích " các phương pháp định lượng protein
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 1 Mục lục LỜI NÓI ĐẦU 3 I. TỔNG QUAN: 4 1. CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN: 4 1.1. Cấu trúc bậc 1: 4 1.2. Cấu trúc bậc 2: 5 1.3. Cấu trúc bậc 3: 6 1.4. Cấu trúc bậc 4: 6 II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 7 1. ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 7 1.1. Đònh lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 7 1.2. Đònh lượng nitơ phi Protein: 12 1.3. Đònh lượng Protein trong nguyên liệu: 13 2. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 13 2.1. Đònh lượng Protein theo phương pháp Biure. 13 2.2. Đònh lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): 16 2.3. Đònh lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): 19 3. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID (BCA): 22 3.1. Nguyên tắc: 22 3.2. Cách tiến hành: 22 3.3. Tính kết quả: 22 3.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 22 4. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 23 4.1. Nguyên tắc: 23 Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 2 4.2. Cách tiến hành: 23 4.3. Tính kết quả: 24 4.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 24 5. PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): 25 5.1. Nguyên tắc: 25 5.2. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 25 6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG AMONIAC 25 6.1. Nguyên tắc: 25 6.2. Cách tiến hành: 26 6.3. Tính kết quả: 27 6.4. Khả năng ứng dụng: 27 7. PHƯƠNG PHÁP DUMAS: 27 7.1. Nguyên tắc: 28 7.2. Thiết bò: 28 7.3. Cách tiến hành: 29 8. PHƯƠNG PHÁP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): 31 8.1. Nguyên tắc: 31 8.2. Dụng cụ: 32 8.3. Tiến hành: 32 III. SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 33 1. SO SÁNH MẪU BIA CÓ VÀ KHÔNG QUA THẨM TÍCH 33 1. KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 3 L L Ơ Ơ Ø Ø I I N N O O Ù Ù I I Đ Đ A A À À U U Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó được cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hợp với nhau bằng các liên kết peptid. Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này trong phân tử Protein như sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc Tú- NXB khoa học và kó thuật HN, trang 94) Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống. Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất đạm) tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac hoặc muối amonium). Để xác đònh được chúng hiện nay có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp. Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để đònh lượng Protein, cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể. Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 4 I I . . T T o o å å n n g g q q u u a a n n : : 1 1 . . C C a a á á u u t t a a ï ï o o p p h h a a â â n n t t ư ư û û P P r r o o t t e e i i n n : : Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa một lượng nhỏ S. Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein như sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, nổi bật cấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giữ vai trò rất quan trọng đối với tất cả các cơ thể sinh vật. Cấu trúc protein được chia thành 4 bậc: 1, 2, 3, 4 1 1 . . 1 1 . . C C a a á á u u t t r r u u ù ù c c b b a a ä ä c c 1 1 : : Là trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong mạch polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trò) O O + H 3 N – CH – C + + H 3 N – CH – C R 1 O - R 2 O O O + H 3 N – CH – C – NH – CH – C + H 2 O R 1 R 2 O – Liên kết peptide H H H O H H H O H – HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – R 1 O R 2 H R 3 O R 4 H R 5 Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 5 1 1 . . 2 2 . . C C a a á á u u t t r r u u ù ù c c b b a a ä ä c c 2 2 : : Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác đònh. Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 6 1 1 . . 3 3 . . C C a a á á u u t t r r u u ù ù c c b b a a ä ä c c 3 3 : : Tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạch polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của mạch polypeptide (hình dạng chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự tạo thành các liên kết disunfua giữa các gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide, làm cho mạch bò cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên kết tónh điện, liên kết hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin … đều tham gia làm bền cấu trúc bậc 3. Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 3. 1 1 . . 4 4 . . C C a a á á u u t t r r u u ù ù c c b b a a ä ä c c 4 4 : : Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 7 polypeptide gọi là”phần dưới đơn vò ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vò”. I I I I . . C C a a ù ù c c p p h h ư ư ơ ơ n n g g p p h h a a ù ù p p đ đ ò ò n n h h l l ư ư ơ ơ ï ï n n g g p p r r o o t t e e i i n n 1 1 . . Đ Đ ò ò n n h h l l ư ư ơ ơ ï ï n n g g n n i i t t ơ ơ t t o o å å n n g g s s o o á á b b a a è è n n g g p p h h ư ư ơ ơ n n g g p p h h a a ù ù p p K K j j e e l l d d a a h h l l Theo nguyên tắc Protein được đònh lượng bằng cách xác đònh lượng nitơ tổng số và kết quả nhân với 6.25, như thế nghóa là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì trong phân tử Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn đònh khoảng 15 – 17%). Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric….Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác đònh nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác đònh nitơ Protein. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein Nitơ protein = Nitơ tổng số – Nitơ phi protein 1 1 . . 1 1 . . Đ Đ ò ò n n h h l l ư ư ơ ơ ï ï n n g g N N i i t t ơ ơ t t o o å å n n g g s s o o á á t t h h e e o o p p h h ư ư ơ ơ n n g g p p h h a a ù ù p p K K j j e e l l d d a a h h l l N N g g u u y y e e â â n n t t a a é é c c : : Quá trình gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte) nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H 2 SO 4 thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bò phân hủy và bò oxi hóa đến CO 2 và H 2 O , còn nitơ chuyển thành amoniac (NH 3 ) rồi kết hợp với H 2 SO 4 tạo thành muối amoni sulphate Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy ra trong máy cất đạm) Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH 3 ra khỏi dunh dòch bằng NaOH. (NH 4 ) 2 SO 4 + NaOH Na 2 SO 4 + NH 3 + H 2 O Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 8 Lượng NH 3 sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một erlen có chứa một lượng thừa H 2 SO 4 đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH 3 sẽ tác dụng với H 2 SO 4 chuyển thành (NH 4 ) 2 SO 4 . NH 3 + H 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 + H 2 SO 4 dư Sau đó đi chuẩn độ lượng H 2 SO 4 còn lại bằng dung dòch NaOH qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu. NaOH + H 2 SO 4 Na 2 SO 4 + H 2 O C C a a ù ù c c h h t t i i e e á á n n h h a a ø ø n n h h : : Nguyên liệu, hóa chất, thiết bò: Nguyên liệu: các mẫu cần xác đònh hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô cần được sấy khô tuyệt đối (105 o C, trong 30 phút). Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K 2 SO 4 /CuSO 4 (9:1), H 2 SO 4 đặc, H 2 SO 4 0,01N, H 3 PO 3 2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96 o , acid tricloacetic (TCA), thuốc thử đỏ metyl. Thiết bò: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger. (chen hình vào) Quá trình được thực hiện qua các bước. Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SO 2 , CO 2 ). Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô đạm để thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 – 5 ml,nếu nước quả hộp thì nên lấy 10 – 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK 2 SO 4 /CuSO 4 (hoặc selen, hay H 2 O 2 30%, hay HCLO 4 70%) và 10ml H 2 SO 4 đặc. Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung dòch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được. Lấy ra để nguội. Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 9 Chuyển sang bình đònh mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô đạm và đònh mức đến vạch đònh mức. Bước 2: Cất đạm Sơ đồ máy cất đạm Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước vào ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu C một ít nước cất (khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại. Hơi nước của bình A sẽ từ từ qua erlen E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước. Ngắt điện ở bình A, hơi nước trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước trong bình B sẽ rút qua G. khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu C và mở van 2 cho nước chảy vào B, kế đó nước sẽ rút qua G. ta có thể làm như vậy vài lần. Nếu nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho nước rút đi. Khóa van 3 và 2 lại. Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dòch H 2 SO 4 0,01N và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dòch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dòch H 2 SO 4 0,01N của erlen E Hút 10ml dung dòch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu C. đun sôi bình A, mở van 2 để dung dòch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam 10 giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa C một lần nữa với thao tác tương tự như trên. Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy xuống C từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B. Tráng phiễu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp 2 mà thôi. Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xòt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài lần như trên rồi chuẩn độ lượng H 2 SO 4 thừa bằng dung dòch chuẩn NaOH 0,01N. Bước 3: chuẩn độ Lượng H 2 SO 4 còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,01N. quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dòch chuyển từ đỏ sang màu nhạt. Xác đònh hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H 2 SO 4 0,01N và vài giọt đỏ metyl. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trò trung bình của 3 lần chuẩn độ T T í í n n h h k k e e á á t t q q u u a a û û : : Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau: x là tỉ số giữa thể tích H 2 SO 4 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ. Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH. Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức: X= 01 * *0,0014*100*100 10* v v x m Trong đó: X: % khối lượng nitơ trong mẫu V o : số ml H 2 SO 4 đem hấp thụ NH 3 V 1 : số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H 2 SO 4 thừa [...]... đònh gián tiếp Nitơ tổng số = Nitơ Protein + Nitơ phi Protein Ta xác đònh nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau đó tính nitơ Protein Nitơ Protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi Protein Protein = Nitơ Protein * 6,25 2 Đònh lượng Protein bằng phương pháp so màu 2.1 Đònh lượng Protein theo phương pháp Biure Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu2+ trong môi trường... thực phẩm, một mặt đánh giá giá trò protein, acid amin trong thực phẩm 7 Phương pháp Dumas: Dumas là một phương pháp đònh lượng để xác đònh lượng nito trong một chất dựa trên một trong các phương pháp đầu tiên được mô tả của Jean- Baptiste Dumas 27 Các phương pháp đònh lượng protein 7.1 GVHD: TS Trần Thò Bích Lam Nguyên tắc: Phương pháp Dumas dùng để xác đònh lượng protein thô Quy trình dùng một thiết... 3.2 Cách tiến hành: Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử Biure thành thuốc thử BCA 3.3 Tính kết quả: Cách tính kết quả cũng tương tự phương pháp Biure 3.4 Độ nhạy và khả năng ứng dụng: Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure Nó phát hiện Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg Nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng Cu 22 Các phương pháp đònh lượng protein. .. vào đường cong mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm 15 Các phương pháp đònh lượng protein GVHD: TS Trần Thò Bích Lam Độ nhạy và khả năng ứng dụng: Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg/ml 2.2 Đònh lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): Nguyên... Phương pháp này dựa trên tương tác màu của protein với các tính chất đặc trưng của phức hệ PRM với một giới hạn hàm lượng protein Căn cứ vào sự hình thành phức hệ, màu sẽ chuyển từ hồng sang tía đen (dark purple) Phương pháp này hữu dụng, đơn giản, rẻ tiền vì phức màu ít hấp thụ đặc biệt và ít phản ứng với các chất khác ngòai protein, có thao tác đơn giản so với các phương pháp khác 32 Các phương pháp. .. Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ Protein trong dung dòch Phương pháp này không dùng được cho các dung dòch có nồng độ Protein thấp (dưới 0,05- 0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng vùng cực tím (ví dụ: đệm, acid nucleic và một số chất béo) hoặc khi Protein ở trong dung dòch huyền phù 24 Các phương pháp đònh lượng protein GVHD: TS Trần Thò Bích Lam So với phương pháp. .. chiếu vào đường cong mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm 18 Các phương pháp đònh lượng protein GVHD: TS Trần Thò Bích Lam Độ nhạy và khả năng ứng dụng: Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác đònh dung dòch mẫu chứa vài chục µg Protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 – 2,000mg Protein Tuy nhiên phương pháp này không dùng để đònh lượng các Protein không chứa acid amin vòng... trong đó cặn chứa nitơ Protein, còn dòch lọc chứa nitơ phi Protein Đem vô cơ hóa dòch lọc và tiến hành xác đònh hàm lượng ni tơ theo phương pháp Kjeldahl 1.3 Đònh lượng Protein trong nguyên liệu: Có thể tiến hành theo 2 cách sau: cách 1: xác đònh trực tiếp Xác đònh hàm lượng ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết quả nhân với 6,25 Protein = Nitơ Protein * 6,25 Cách 2: xác đònh gián tiếp... 32 Các phương pháp đònh lượng protein GVHD: TS Trần Thò Bích Lam III So sánh một số phương pháp đònh lượng protein 1 So sánh mẫu bia có và không qua thẩm tích Hàm lượng Protein trong bia (mg/ml) 1 Kết luận Các phương pháp khác nhau cho kết quả không giống nhau Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 4 tỷ tân thực phẩm có protien và vì vậy số lượng thực phẩm cần phải phân tích protein là rất lớn Vì vậy... Protein làm dung dòch có màu xanh Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein trong dung dòch Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra hàm lượng Protein trong mẫu Phản ứng cho màu Coomassie 19 Các phương pháp đònh lượng protein GVHD: TS Trần Thò Bích Lam Tiến hành: Hóa chất: Chuẩn bò dung dòch mẫu Protein cần xác đònh Dung dòch Albumin chuẩn 1mg/ml Cách pha dung dòch Albumin: Cân chính xác 10mg Albumin pha trong . Kjeldahl và nitơ phi Protein sau đó tính nitơ Protein. Nitơ Protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi Protein Protein = Nitơ Protein * 6,25 2 2 . . . nitơ phi Protein. Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác đònh nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác đònh nitơ Protein. Nitơ tổng số = Nitơ protein