L/O/G/O Chuyên đề Lớp 42 CNSH Công nghệ sinh học thực phẩm Sản xuất penicillin từ vi sinh vật Nội dung PHẦN I – MỞ ĐẦU PHẦN II – NỘI DUNG PHẦN III - KẾT LUẬN PHẦN I MỞ ĐẦU Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây vi khuẩn Hiện giới người ta phát 8000 chất kháng sinh năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh phát Trong tương lai chắn cịn có nhiều chất kháng sinh khác tìm đa số vi sinh vật có khả tạo thành chất kháng sinh nghiên cứu thuộc chi Streptomyces Bacillus PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu chung chất kháng sinh Ø Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Ø Chất kháng sinh hiểu chất hố học xác định, khơng có chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấpa (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị PHẦN I MỞ ĐẦU 1.2 Cơ chế tác dụng Ø Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất PHẦN I MỞ ĐẦU 1.2 Cơ chế tác dụng Hình Vị trí tác dụng số chất kháng sinh PHẦN II NỘI DUNG 2.1 Penicillin 2.1 Giới thiệu chung ØPenicillin phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vịng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Ø Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột ØNăm 1942, tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng toàn giới ) PHẦN II NỘI DUNG 2.1 Giới thiệu chung Ø Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến PHẦN II NỘI DUNG 2.1.2 Công thức cấu tạo Penicillin Ø Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm vịng thiazolidine, vịng b-lactam, nhóm amino có gắn với CO2 mạch bên (R) Tất penicillin dẫn suất acid 6-aminopenicillanic Sự thay R tạo nhiều acid amin khác Hình Cấu tạo chung phân tử penicillin PHẦN II NỘI DUNG 2.1.3 Công nghệ sinh tổng hợp Penicillin từ nấm mốc Ø Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng chủng có hoạt lực cao thuộc lồi P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P.chrysogenum công nghiệp PHẦN II NỘI DUNG 2.2.1 Các kỹ thuật lên men Ø Kỹ thuật nên men chìm: Quá trình lên men môi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - - Pha thứ hai lên mên thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại PHẦN II NỘI DUNG 2.2.1 Các kỹ thuật lên men Ø Kỹ thuật nên men chìm: Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose ln mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) PHẦN II NỘI DUNG 2.2.1 Các kỹ thuật lên men Ø Kỹ thuật nên men chìm: Ngồi nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy q trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) PHẦN II NỘI DUNG 2.2.1 Các kỹ thuật lên men Ø Kỹ thuật nên men chìm: Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hòa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang cơng đoạn trích ly tinh chế thu penicillin Trong nên men chìm chế độ khuấy, sục khí ln đuợc đẩm bảo, theo dõi chặt chẽ Hiện thông số kỹ thuật suốt trình nên men điều khiển tự động thơng qua phần mềm lập trình sẵn PHẦN II NỘI DUNG 2.2.1 Các kỹ thuật lên men Hình Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin PHẦN II NỘI DUNG 2.3 Xử lý dịch lên men tinh chế sản phẩm Ø Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ mơi trường ni cấy, là: Ÿ Trích ly dung môi hữu ŸHấp phụ ŸTrao đổi ion Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung môi hữu sử dụng nhiều phương pháp dựa ưu điểm sau: ŸMuối penicillin dễ tan nước ŸAcid penicillic dễ tan dung môi hữu PHẦN II NỘI DUNG 2.3 Xử lý dịch lên men tinh chế sản phẩm Ø Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt sơ đồ: Hình Sơ đồ tóm tắt cơng đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên PHẦN II NỘI DUNG 2.3.1 Lọc dịch lên men Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc PHẦN II NỘI DUNG 2.3.2 Trích ly Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 30C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, q trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dịng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 H3PO4 lỗng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung mơi trích ly vào thiết bị PHẦN II NỘI DUNG 2.3.2 Trích ly Hình Sơ đồ cơng nghệ trích ly lần dung môi tinh chế penicillin PHẦN II NỘI DUNG 2.3.3 Tảy màu Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung mơi xử lý hồn ngun, phục vụ cho mẻ sau PHẦN II NỘI DUNG 2.3.4 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH lỗng (hay NaOH lỗng), tiến hành chân khơng nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin PHẦN II NỘI DUNG 2.3.4 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy khơng khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Ngồi ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác phương pháp phân tán tĩnh điện nguyên tắc phương pháp sử dụng hiệu điện cao (lên đến 25 kV) để tạo vi giọt dung dịch chứa penicillin PHẦN III KẾT LUẬN Penicillin thông thường sản xuất phương pháp lên men ưa khí chìm chiết xuất độ pH thấp từ dịch lên men sử dụng butyl axetat kerosen Do tính khơng ổn định penicillin độ pH thấp, quy trình chiết xuất cần thực nhiệt độ thấp, song có tới 1015% sản phẩm bị thất sử dụng quy trình cơng nghiệp Ngoài suất tương đối thấp, phương pháp sản xuất truyền thống có chi phí cao, tiêu thụ nhiều lượng để thu hồi butyl axetat từ chất – quy trình địi hỏi nhiều cơng đoạn Vì phải tiếp tục nhiên cứu phát nhiều quy trình sản xuất penicillin có đột phá vượt trội mặt công đoạn sản phẩm L/O/G/O Lớp 42 CNSH Thank You! Công nghệ sinh học thực phẩm ... men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G) s Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên s Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin. .. penicillin tự nhiên) s Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại PHẦN II NỘI DUNG 2.2 Quy trình sản xuất penicillin Hình Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)).. .Sản xuất penicillin từ vi sinh vật Nội dung PHẦN I – MỞ ĐẦU PHẦN II – NỘI DUNG PHẦN III - KẾT LUẬN PHẦN I MỞ ĐẦU Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà