1 CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà 2 I. Đặt vấn đề II. Nội dung II.1. Đôi nét về Listeria II.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes II.3. Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene III. Kết luận IV. Tài liệu tham khảo 3 I. Đặt vấn đề  Trong số sáu loại Listeria, chỉ có Listeria monocytogenes gây bệnh Listeriosis rất phổ biến ở cả người và động vật. Đây là một loại bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt là đối với những người có hệ miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người già yếu.  Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm nên rất dễ lây nhiễm cho người đòi hỏi phải có công tác kiểm nghiệm thực phẩm khắt khe. 4  Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa… Nhưng do đối tượng thao thác là trên thực phẩm nên sử dụng phương pháp truyền thống là rất khó khăn, tốn kém và mất thời gian. Nhờ vậy mà các kỹ thuật gene với những ưu điểm nổi trội như nhanh, nhạy, chính xác đã được sử dụng để chuẩn đoán Listeria monocytogenes. 5 II. Nội dung II.1.Đôi nét về Listeria Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ, không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính. Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men đường. Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc và người, trong đó có loài Listeria monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân trong máu của nhiều loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người. 6 Phân loại: giống Listeria bao gồm 6 loài 1. Listeria monocytogenes 2. L. innocua 3. L. ivanovii 4. L. seeligeri 5. L. welshimeri 6. L. grayi 7 II.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes 8 Phân bố và cách lây lan  L. monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó có trong đất, nước, phân, dịch tiết đường sinh dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe  Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây truyền của vi khuẩn có khác nhau. Nếu như ở dạng phủ tạng, sự lây nhiễm qua đường ăn uống. Nếu như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt và mũi. 9 Hình thái và nhuộm màu  L. monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram dương. Trong môi trường nuôi cấy, khi tế bào còn non L.monocytogenes được tìm thấy ở dạng trực khuẩn. Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5×1-2 µm) lại chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm. Vi khuẩn không sinh bào tử, không tạo giáp mô, có khả năng di động. Ở 20-25 0 C vi khuẩn di động mạnh nhất. Ở 37 0 C vi khuẩn di động nhờ một chiêm mao ở đầu. 10  Khi nhuộm từ mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ nhầm với Streptococci. Trong trường hợp này có thể dùng phản ứng Catalase để phân biệt. Trong canh 3-6 giờ ở 37 0 C vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay hơn(đặc biệt chủng R). Sự di động của Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix. [...]... hợp nhiễm bệnh 24 II.3 Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene Dựa tên 3 gene: gene DTH-18, gene listeriolysin O (hly A) và iap 25 Phân lập L.monocytogenes từ phô mai • 25g phô mai đồng nhất với 225ml dung dịch tăng sinh Listeria( LEB)-làm giàu mẫu lần 1 => Lấy 0,1ml chuyển qua 10ml canh Fraser (Oxoid) và ủ 24 giờ ở 300C – làm giàu mẫu lần 2=>thu nhận tế bào bằng IMS => Lấy 10µl để thực... nguyên là: 1/2a; 1/2b; 4b 15 ANTIGENS SEROTYPE O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE) 1a 1b I, II, (III) I, II, (III) A, B A, B, C 2 I, II, (III) B, D 3a 3b II, (III), IV II, (III), IV A, B A, B, C 4a 4b 4ab 4c 4d 4e (III), (V), VII, IX (III), V, VI (III), V, VI, VII, IX (III), V, VII (III), VI, VIII (III), V, VI, VIII, IX) A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C 16 Độc tố • Vi khuẩn sản sinh ra men hemolysinase... pha loãng của tế bào vi khuẩn và quan sát chu kỳ ngưỡng Ct 35 Xác định và phân tích sự khác nhau của các loài Listeria bằng Multiplex PCR Sử dụng gen iap Thiết kế 5 mồi khác nhau để xác định các loài Listeria bằng Multiplex • Ino 2[5’-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3’] Khuếch đại đoạn gene của L.innocua dài 870bp • Siwi 2[5’-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3’] Khuếch đại đoạn gene của nhóm L.ivanovii, L.seeligeri và L.welshimeri... bào Trên bề mặt của tế bào vi khuẩn còn có lipo-polysaccharid độc đối với thỏ 17 Cơ chế gây bệnh Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh... trình thứ hai hỗ trợ vi c lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh  Màng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề  Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại pro-tê-in trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC... màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho vi c di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn 20 21 Chẩn đoán bằng phương pháp truyền thống Bệnh phẩm: gan, lách, não, thai bi sảy… Nuôi cấy trên môi trường LSA Nhuộm Gram Chọn khuẩn lạc Test ANTON Thỏ bị nhiễm Listeria Tiêm não thỏ (chết sau 2-3 ngày) Kiểm tra máu thỏ(Bạch... được lọc bằng Z-probe(Bio-Rad) và lai với DNA probe mã hóa cho gene DTH-18 Probe listeriolysin O được đánh dấu sử dụng trong PCR Điều kiện tương tự như miêu tả ở trên ngoại trừ 100µl thể tích phản ứng chứa 90µM dNTP và 10µM digoxigenin-dUTP PCR dựa trên gene listeriolysin O dùng để xác định kiểu huyết thanh 4a 30 Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ mẫu phô mai có chứa Listeria monocytogenes sau... bệnh khiến 15 người lớn tử vong và 6 thai nhi bị sinh non 23 • Năm 1999, loài L monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các vi n chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề • Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis ở nhiều bang ở Mỹ – một căn bệnh nguy hiểm do vi khuẩn Listeria gây ra -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca tử vong và 3 ca hỏng bào thai... (lane7) 32 Sự định lượng L.monocytogenes với SYBRGreen/Real-Time PCR Assay .Gen listeriolysin(hly A) được chọn làm mục tiêu để xác định L.monocytogenes  Mồi xuôi:5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’  Mồi ngược:5’-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA3’ Được sử dụng để khuếch đại đoạn 113bp của gene hly A(Nogva et al,2000) 33 Định lượng Real-Time PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt M×3005(Stratagene, La Jolla, CA, USA) trong... trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin sau 24-48 giờ • Môi trường Gelatin không gây tan chảy 12 Đặc tính sinh hóa Lên men chậm các loại đường như glucose, rhamnose, salicin, levulose Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng Catalaza dương tính 13 Sức đề kháng  Vi khuẩn bị diệt ở 600C trong 30 phút và 720C trong 15 giây Vi khuẩn đề kháng . 1 CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Sinh vi n thực hiện: Phạm Ngọc Hà 2 I. Đặt. dung II.1. Đôi nét về Listeria II.2. Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes II.3. Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene III. Kết luận IV.