Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 337 TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TR ỨNG Trần Thị Thanh Khương, Đặng Hoàng Lâm, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM MỞ ĐẦU Để nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò sữa, việc áp dụng vi tiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng là cần thiết. Trứng bò thu nhận từ nhiều nguồn được nuôi trưởng thành trong TCM 199 với 20% FBS (Fetal Bovine Serum). Tinh trùng bò sữa đông lạnh được hoạt hoá bằng phương pháp swim-up trong môi trường BO. Sau khi vi tiêm, trứng được hoạt hoá. Sau 9 lần thực hiện với 44 trứng tạo, đ ược 20 phôi, với tỷ lệ thành công là 47,17% và phôi đạt giai đoạn morula là 10%. ICSI - Intracytoplasmic sperm injection là phương pháp vi tiêm m ột tinh trùng được lựa chọn từ trước đó vào bào tương trứng, với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao tác cùng với kính hiển vi đảo ngược. Kỹ thuật này ra đời vào năm 1992 do Palemo và cs đã ứng dụng thành công trên người. ICSI như là một cuộc cách mạng trong hỗ trợ sinh sản đặc biệt trong chữa trị vô sinh nam. Đối với gia súc, sau khi thực hiện ICSI, tế b ào trứng có chứa tinh trùng phải trải qua quá trình hoạt hoá với các tác nhân như xung điện, ethanol 7%, Calcium Ionophore (A23187)… Tạo phôi bò bằng phương pháp vi tiêm đã mở ra hướng mới trong nhân giống bò đem lại hiệu quả cao, đặc biệt l à bò sữa trong trường hợp nguồn giao tử có chất lượng kém hoặc nguồn trứng đông lạnh. Bên cạnh đó, việc tiếp cận kỹ thuật hiện đại còn giúp hoàn thiện các quy trình công nghệ khác trong các nghiên cứu xa như tạo dòng, sinh thiết, tạo động vật chuyển gen, bảo tồn động vật quý hiếm… VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chuẩn bị trứng: Trứng bò tươi thu nhận tại lò mổ hay trứng đông lạnh được lựa chọn, phân loại A, B. Các trứng n ày được nuôi trưởng thành trong môi trường TCM 199 (Sigma) với 20% FBS (In vitrogen). Sau 24 giờ nuôi, tiến h ành phá lớp tế bào cumulus bao quanh trứng bằng enzyme hyaluronidase (1mg/ml, Sigma). Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 338 Hình 1. Trứng bò chín. (a) Trước khi phá lớp cumulus, (b) Sau khi phá lớp cumulus Chuẩn bị tinh trùng: Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ được giải đông ở 37 o C trong 60 giây. Thực hiện swim-up 15 phút trong môi trường BO, thu nhận dịch nổi, chọn tinh trùng cho vi tiêm. Vi tiêm: Hút tinh trùng bằng kim tiêm (injection pipette) trong giọt PVP (In vitrogen) chuyển qua giọt TCM 199 chứa trứng. Kim giữ (holding pipette) trứng đ ược điều chỉnh thể cực ở vị trí 6 giờ hay 12 giờ, tiến hành tiêm tinh trùng vào bào tương trứng một cách nhẹ nhàng, nhanh chóng với thể tích đưa vào bào tương trứng ít nhất. Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương trứng (a) (b) Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 339 Chuyển trứng sau khi vi tiêm vào môi trường nuôi phôi CR1aa. Sau 4 giờ nuôi, tiến hành hoạt hoá trứng sau khi vi tiêm với TCM 199 với 7% ethanol trong 4 phút. Tiếp tục nuôi phôi trong môi trường CR1aa và theo dõi các giai đoạn phát triển của phôi. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau 9 lần vi tiêm, được 44 trứng, số phôi thu được là 20 phôi, chiếm tỷ lệ tạo phôi là 47,17%. Trong 20 phôi có 2 phôi ở giai đoạn 2 tế bào (10%), 5 phôi giai đoạn 4 tế bào (25%), 10 phôi giai đoạn 8 tế bào (50%), 1 phôi giai đoạn 16 tế bào (5 %) và 2 phôi giai đoạn morula (10%). Hình 3. Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI. (a) Phôi 2 tế bào, (b) Phôi 4 tế bào, (c) Phôi 8 tế bào, (d) Phôi morula Năm 1989, Younis và cs đã tạo được phôi bò bằng kỹ thuật ICSI truyền thống và trứng không hoạt hóa với tỷ lệ 2%. Li v à cs (1999) tạo phôi bằng piezo-ICSI có hoạt hóa bằng ethanol 7% phôi tạo ra với tỷ lệ 26,4%. Cùng năm đó Hamano đã thành công với tỷ lệ tương đối cao là 56,6 %. Năm 2004, Kato, H., Matsumoto và cs đ ã so sánh giữa hoạt hóa bằng ethanol 7% và không hoạt hóa, đạt tỷ lệ phôi là 51% so với không hoạt hóa là 13%. Takenaka và cs (2005) cùng dùng phương pháp hoạt hóa bằng ethanol 7% với tỷ lệ tạo phôi là 75,6%. (a) (b) (c) (d) Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 340 Như vậy với tỷ lệ tạo phôi là 47,17 % là tương đối cao, cao hơn hẳn với lần thực hiện đầu tiền vào năm 1989. So với các nghiên cứu gần đây thì tỷ lệ tạo phôi là tương đối thấp, tuy nhiên các nhà khoa học trên thế giới thực hiện ICSI có hỗ trợ Piezo trong khi chúng tôi thực hiện với phương pháp cổ điển, dùng lực cơ học của kim tiêm vào màng trứng. Kỹ thuật Piezo-ICSI, màng pellucida và màng noãn sẽ chịu ít sự tác động của đầu pipette mà thay vào đó là có sự hỗ trợ của tia piezo. Một trong những thuận lợi của kỹ thuật piezo là giảm đáng kể sự phá hủy trứng trong suốt quá tr ình thụ tinh. Trong khi với kỹ thuật cổ điển, lực của đầu kim gồm lực tiếp tuyến v à lực xoay đã phần nào tác động đến tế bào chất trứng. Như vậy, với kỹ thuật ICSI cổ điển chúng tôi đ ã tạo ra phôi với tỷ lệ 47,17% cùng với sự hoạt hóa của ethanol 7%. Tuy ethano l7% không phải là tác nhân hoạt hóa nhân tạo tối ưu nhưng tỷ lệ tạo phôi cũng tương đối cao. Hơn thế nữa, ethanol 7% là hóa chất dễ có và tiện lợi trong điều kiện chúng tôi Có thể khẳng định rằng với nguồn mẫu ổn định, trứng chất l ượng tốt, hệ thống vi thao tác tốt, ổn định cùng với tay nghề của kỹ thuật viên thao tác cao thì tỷ lệ phôi bò bằng phương pháp ICSI không chỉ dừng ở tỷ lệ 47,17% mà còn cao hơn nữa. Đối với trứng người, tỷ lệ ICSI cao hơn so với IVF, nhưng ở bò: theo Kim tea Chung và cs (1999) tỷ lệ phôi IVF là 75%, của Phan Kim Ngọc và cs (2006) là 72,19% tỷ lệ tạo phôi bằng ICSI thấp hơn do bản chất của trứng bò khó hoạt hóa hơn so với trứng người và để tạo thành hợp tử, chúng phải nhận những kích thích nhân tạo. Tuy nhiên, Gyu-Jin Rho và cs (1998) đã tiến hành xác định giới tính tinh trùng bằng phương pháp Flow Cytometry với tỷ lệ 80% và tiến hành vi tiêm tinh trùng đã xác định giới tính. Tỷ lệ phôi đạt được với phương pháp này là 46,6% và phôi ở giai đoạn blastocyst là 6,9%. So với kết quả tạo phôi của chúng tôi là 47,17 % cao hơn. KẾT LUẬN Trong phương pháp chuẩn bị giao tử, swim-up dùng cho hoạt hoá tinh trùng phù hợp với ICSI. Tác nhân ethanol 7% có vai tr ò hoạt hoá trứng sau khi vi tiêm, cho kết quả tạo phôi tương đối cao và phù hợp với điều kiện thực hiện. Bằng kỹ thuật ICSI cổ điển, với tác nhân hoạt hoá là ethanol 7% tỷ lệ tạo phôi 47,17% với phôi đạt giai đoạn morula là 10%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Carlos A. Guerrero. (2006) Cryopreservation And Intracytoplasmic Sperm Injection With Bovine Epididymal Spermatozoa . .S. Louisiana State University. 2. Henry E. Malter & Jacques Cohen.(2002) Intracytoplasmic sperm injection: technical aspects. Gamete source, manipulation and disposition. 3. Heuwieser W, Yang X, Jiang S, Foote RH: Fertilization of 21. Yanagida K, Katayose H, Yazawa H, et al(1992): Successful fertilizabovine oocytes after microsurgical injection of spermatozoa Theriogenology Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 341 4. Jin-Tae Chung (1999). Activation of bovine oocytes following intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Department of Animal Science Macdonald Campus McGill University, Montreal, Quebec, Canada. 5. Keith J. Betteridge (2004). New reproductive Technologies in Cattle: A Veterinary Perspective. Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada. 6. Kimura, Y & R. Yanagimachi (1995). Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol. Reproduction. 52: 709-720. 7. Mapletoft RJ & J. F. Hasler (2005). Assisted reproductive technologies in cattle: a review. (1) Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK S7N 5B4, Canada (2) AB Technology, Bionich e Animal Health USA, Inc., Pullman, WA 99163, United States of America. 8. Ragaa Mansour (1998). Intracytoplasmic sperm injection: a state of the art technique Human Reproduction Update, Vol. 4, No. 1 pp. 43-56. 9. Toshitaka Horiuchi (2002) Application of Intracytoplasmic Sperm Injection to Animal Production. Faculty of Life and Environmental Sciences Department of Life Sciences. SUMMARY Bovine embryo production by intracytoplasmic sperm injection Tran Thi Thanh Khuong, Dang Hoang Lam, Pham Van Phuc, Phan Ki m Ngoc University of Sciences HCMCity Due to bovine oocyte source is rare. To increase fertilization effect, application of intracytoplasmic sperm injection method is nessesary. In our research, bovine oocytes are collected at slaughter-house and cultured with TCM 199 plus 20% FBS (fetal bovine serum) until maturation. Cryopreserved bovine semen is thawed and activated with BO medium. After injection, oocytes are treated with 7% ethanol in TCM 199 for 4 min for activation. In 9 repeats, 44 oocytes were in jected, with 20 embryo that are formed, with 47,17% cleavage rate, 10% morula embryo. . Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI. (a) Phôi 2 tế bào, (b) Phôi 4 tế bào, (c) Phôi 8 tế bào, (d) Phôi morula Năm 1989, Younis và cs đã tạo được phôi bò bằng kỹ. vào bào tương trứng ít nhất. Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương trứng (a) (b) Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 339 Chuyển trứng sau khi vi tiêm