1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Sinh viên thực hiện ĐẶNG THỊ THU THẢO MSSV: 0753040084 LỚP: ĐH NTTS K2 Cần Thơ, 2011 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGs.Ts. NGUYỄN VĂN BÁ ĐẶNG THỊ THU THẢO ThS. NGUYỄN THÀNH TÂM 2011 3 XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Luận văn kèm theo đây với tựa đề: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men”. Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm luận văn thông qua. Phản biện Ủy viên Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011 Chủ tịch hội đồng 4 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và sinh hoạt. Cảm ơn quý Thầy Cô Khoa Sinh Học Ứng Dụng đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ những ngày đầu bước chân vào trường đến nay. Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men” được kết thúc thành công. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Nguyễn Văn Bá đã hỗ trợ môi trường nuôi cấy và các dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm luôn theo sát hướng dẫn đề tài và cung cấp một số tài liệu liên quan. Cảm ơn Cô Trần Ngọc Huyền – cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để đề tài kết thúc đúng thời hạn và xin cảm ơn anh Lê Văn Toàn (lớp ĐH NTTS K2) cùng hai em Nguyễn Thị Thùy Trang và Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện. Cảm ơn Thầy cố vấn học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hoài Phương (Khoa cơ bản) và các thành viên lớp ĐH NTTS K2 đã sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Chân thành cảm ơn! Đặng Thị Thu Thảo 5 TÓM TẮT Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men thực phẩm. Chúng sinh ra nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H 2 O 2 và chất kháng khuẩn. Do đó, việc tìm ra những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic nhằm bổ sung cho những nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng dụng chất kháng khuẩn vào trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu sử dụng môi trường MRS để phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp trực tiếp để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Kết quả cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 37 mẫu mắm và nước mắm (thu ngẫu nhiên ở những chợ thuộc vùng nước ngọt và nước lợ mặn) và có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ thị. Độ dày vòng kháng khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, trong đó có 9 dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn 0,1 cm là nhỏ nhất. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp, Pediococcus pentosakeus. 6 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1 Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản 3 2.2 Vi khuẩn lactic 7 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men axit lactic 7 2.2.2 Cơ chế của quá trinh lên men axit lactic 8 2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá 8 2.4 Chất kháng khuẩn 9 2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus 12 2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước 13 2.6.1 Những nghiên cứu trong nước 13 2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước 14 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 15 3.1.1 Địa điểm 15 3.1.2 Thời gian thực hiện 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu 17 3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm 18 3.4 Phân tích và xử lý số liệu 20 3.4.1 Phân tích VKL 20 3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 21 4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men 21 4.1.1 Thu mẫu 21 4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1 21 4.1.3 C ấy ria trên đĩa pêtri 23 7 4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram 25 4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2 26 4.1.6 Lưu trữ mẫu 26 4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 26 4.2.1 Tối ưu hóa quy trình 26 4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 27 CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT 31 5.1 Kết quả 31 5.2 Đề xuất 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC A A PHỤ LỤC B B PHỤ LỤC C C PHỤ LỤC D D1 PHỤ LỤC E E PHỤ LỤC F F1 PHỤ LỤC G G 8 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL 10 Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu 17 Bảng 4.1: Địa điểm và số lượng mẫu thu 21 Bảng 4.2: Kết quả tăng sinh lần 1 22 Bảng 4.3: Kết quả cấy ria VKL trên đĩa thạch 23 Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuẩn 28 Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus 30 Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth A Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar A Bảng D1: Bảng mã mẫu D1 Bảng D2: Kết quả thử khả năng sinh CKK của VKL phân lập được D3 Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc F1 9 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá 3 Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép 4 Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm 5 Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc 5 Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm 6 Hình 2.6: Pediococcus 12 Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm 19 Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình 19 Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 20 Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL 21 Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO 3 25 Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính . 25 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của mẫu 27 Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh ra từ VKL 30 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VKL: Vi khuẩn lactic CKK: Chất kháng khuẩn 10 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá và các loài thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu. Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách. (Bùi Quang Tề, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic (VKL). VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hoá chất bột đường và chúng được xếp vào họ Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men (Lương Đức Phẩm, 2004). Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và csv., 2009). Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy sản lên men có khả năng kháng khuẩn ” được thực hiện. [...]... nghiên cứu Nhằm tìm ra một số dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men 1.3 Nội dung nghiên cứu • Phân lập một số dòng VKL trong các sản phẩm mắm và nước mắm • Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhóm VKL phân lập được 11 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Một số quy trình lên men thủy sản Mắm là sản phẩm đặc trưng của các tỉnh Nam Bộ, tùy vào điều kiện tự nhiên... VKL có khả năng sinh CKK, kết quả này phù hợp với kết quả của Penson Jumriangrit (2004) nghiên cứu về khả năng sinh CKK từ các sản phẩm thủy sản lên men của Thái Lan Khả năng sinh CKK của những dòng VKL là khác nhau, phụ thuộc vào: dòng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy, giai đoạn phát triển, thời gian nuôi cấy Đa số những dòng vi khuẩn lactic sau 8h bắt đầu sinh CKK, vòng kháng khuẩn khá rõ sau 12 giờ và. .. ở nước ta vi c nghiên cứu về CKK do VKL sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên, các nghiên cứu về ứng dụng của CKK còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan Một số nghiên cứu tiêu biểu về VKL và CKK • Tuyển chọn định hướng VKL sinh CKK từ một số thực phẩm giàu protein lên men lactic ở Vi t Nam (Mai Thị Hằng và csv, 2000) • Phân lập và tuyển chọn một số chủng VKL... năng sinh CKK của Enterococcus faecium được phân lập từ các sản phẩm thủy sản lên men của Thái • Năm 2004, Todorov, S.D., Van Reenen, C.A và Dicks K.M (Nam Phi) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley • Năm 2006, 50 chủng VKL được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân. .. không lên khuẩn lạc + có lên khuẩn lạc Kết quả cấy ria có 82 đĩa pêtri xuất hiện sự phát triển của khuẩn lạc Trong đó, có 15 đĩa mẫu bị nhiễm nấm, 67 đĩa mẫu không nhiễm nấm và được 57 mẫu có khả năng phân giải CaCO3 Qua quá trình quan sát khuẩn lạc nhận thấy đa số khuẩn lạc phân lập được có dạng hình tròn, một số có hình dạng tròn không đều rìa dợn sóng Bề mặt khuẩn lạc lồi, nhẵn bóng, một số khác... tham gia vào quá trình lên men chúng phải được thủy phân thành glucose hay fructose nhờ các enzyme tương ứng Lên men axit lactic là quá trình chuyển hoá yếm khí đường thành axit lactic (Lê Văn Nhương và csv, 2009) Có 2 kiểu len men lactic Trong lên men lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit lactic, etanol, axit acetic và CO2... đời như lên men rau hoa quả, lên men thịt, lên men cá Nhưng mãi đến năm 1878, Lister mới phân lập được VKL, ông gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus lactic) Từ đó đến nay, nhiều loại VKL được phát hiện và ứng dụng có ích của chúng ngày càng đựợc mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và thực phẩm chức năng Công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có thể nói... mắm thành phẩm Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm (Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009) 15 Bã 2.2 Vi khuẩn lactic Lên men lactic là quá trình thu nhận năng lượng nhờ VKL, bao gồm sự biến đổi một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra (Lương Đức Phẩm và csv, 2009): C6H12O6 = 2CH3CHONCOOH + 0,075x106J VKL được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Các sản phẩm lên men axit lactic truyền... Đặc điểm của vi khuẩn lên men lactic Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại cảnh khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có một số đặc điểm sau: chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào tử, catalase âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều... sinh cấy 1 điểm lên đĩa MRS_agar Xuất hiện khuẩn lạc của VKL Quan sát vòng kháng khuẩn Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 3.4 Phân tích và xử lý số liệu 3.4.1 Phân tích VKL • Quan sát hình dạng khuẩn lạc • Đo kích thước khuẩn lạc • Quan sát sự phân giải CaCO3 3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn • Đo kích thước vòng kháng khuẩn • Quan sát hình dạng vòng kháng khuẩn Số liệu được tổng hợp và phân tích trên . TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN Sinh vi n. NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN MÃ SỐ: 304 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN