Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú (Penaeus Monodon).
B GIÁO DC VÀ ÀO TO IăHCăTHỄIăNGUYểN HOẨNGăTHăTHUăYN NGHIểNăCUăCăIMăCUăTRÚCă MTăSăGENăTHUCăHăMINăDCHăTỌMăSÚă (PENAEUS MONODON) LUNăỄNăTINăSăSINHăHC THÁI NGUYÊN - 2012 ii LIăCAMăOAN Tôi xin cam đoan tâ t ca các kt qu nghiên c u trong lun án là trung thc và cha tng đc công b trong bt k công trình nào khác. Nê u sai tôi xin chi u tra ch nhiê m hoa n toa n. 2 Tácăgiălun án HoƠngăThăThuăYn iii MCăLC LI CM N i LIăCAMăOAN ii MC LC iii DANH MC CÁC KÝ HIU VÀ CÁC CH VIT TT vi DANH MC CÁC BNG viii DANH MC CÁC HÌNH ix M U 1 1. t vn đ 1 2. Mc tiêu nghiên cu 2 3. Ni dung nghiên cu 2 Chng 1. TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Tôm sú và các bnh thng gp tôm sú 3 1.1.1. Gii thiu v tôm sú 3 1.1.2. Tình hình nuôi va di ch bê nh tôm sú Viê t Nam 5 1.1.3. Các bnh thng gp tôm sú 7 1.1.4. Phng pha p phòng và tr bnh tôm sú 12 1.2. H min dch tôm sú 14 1.2.1. áp ng min dch t bào 15 1.2.2. áp ng min dch dch th 21 1.3. Nghiên c u gen va tiê m nng ng du ng trong pho ng tri bê nh cho tôm su 23 1.3.1. Tình hình nghiên cu genome tôm sú trên th gii 23 1.3.2. Nghiên cu gen liên quan đê n kha nng miê n di ch tôm su 24 1.3.3. Tiê m nng ng du ng cu a gen liên quan đê n miê n dich trong pho ng tr bnh tôm su 28 Chng 2. VT LIU VÀ PHNG PHÁP 32 2.1. Vt liu 32 2.1.1. Thu thp mu 32 iv 2.1.2. Hóa cht 32 2.1.3. Thit b 34 2.1.4. Các vi sinh vt đc s dng trong nghiên cu 34 2.2. Phng pháp nghiên cu 35 2.2.1. Tách chit RNA tng s 36 2.2.2. Tinh sch mRNA 37 2.2.3. Tng hp cDNA 38 2.2.4. Thit k mi phân lp mt s gen (cDNA) la chn 41 2.2.5. Khuch đi gen bng phn ng PCR 48 2.2.6. Tinh sch sn phm PCR 49 2.2.7. To dòng phân t sn phm PCR 49 2.2.8. Xác đnh trình t gen (cDNA) 50 2.2.9. Biu hin gen ALFPm3 50 2.2.10. Phân tích d liu trình t và x lý s liu 55 2.3. a đim nghiên cu 55 Chng 3. KT QU VÀ THO LUN 56 3.1. Rab7 - protein liên quan đê n c chê xâm nhiê m cu a virus 56 3.1.1. To dòng gen Rab7 t mu tôm sú Vit Nam 56 3.1.2. Xác đnh và phân tích trình t gen Rab7 58 3.2. Syntenin - protein liên quan đn con đ ng dâ n truyê n ti n hiê u 61 3.2.1. Phân lâ p đon 5‟-syntenin t mu tôm sú Vit Nam 62 3.2.2. To dòng gen syntenin hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 64 3.2.3. Xác đnh và phân tích trình t gen syntenin 65 3.3. Hemocyanin - protein có hot tính phenoloxidase 68 3.3.1. Phân lp đon 5‟-hemocyanin t mu tôm sú Vit Nam 69 3.3.2. To dòng gen hemocyanin hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 72 3.3.3. Phân tích trình t gen hemoccyanin 74 3.4. Ran - protein điê u khiê n th c ba o 76 3.4.1. To dòng mt phn đon gen Ran t mu tôm sú Vit Nam 77 v 3.4.2. Phân lp đon gen 3‟ và 5‟-Ran 78 3.4.3. To dòng gen Ran hoàn chnh t mu tôm sú Vit Nam 82 3.4.4. Xác đnh và phân tích trình t gen Ran 83 3.5. Caspase - protein tham gia va o c chê apoptosis 84 3.5.1. To dòng gen caspase t mu tôm sú Vit Nam 85 3.5.2. Xác đnh và phân tích trình t gen caspase 86 3.6. H thng các protein kháng khun, kháng nm và kháng virus 90 3.6.1. Protein kha ng virus PmAV 90 3.6.2. Peptide kha ng khuâ n t ng t crustin (crustin - like antimicrobial peptide) 94 3.6.3. Yê u tô kha ng khuâ n (ALF - antiliposaccharide factor) 99 3.7. Biê u hiê n yê u tô kha ng khuâ n tái t hp (rALFPm3) 105 3.7.1. To cu trúc vector biu hin gen 105 3.7.2. Xác đnh cu trúc gen ALFPm3 đc chuyn vào genome nm men 108 3.7.3. Xác đnh đon peptide ALFPm3 đc biu hin 109 3.7.4. Phân tích hot tính ca rALFPm3 111 KT LUN VÀ KIN NGH 113 1. Kt lun 113 2. Kin ngh 114 CỄCăCỌNGăTRỊNHăẩăCỌNGăB LIểNăQUANăN LUN ÁN 115 TÀI LIU THAM KHO PH LC vi DANHăMCăCỄCăKụăHIUăVẨăCỄCăCHăVITăTT Tăvitătt NghaătingăVit NghaătingăAnh 5‟UTR Vùng 5‟ không dch mã 5‟ Untranslated region 3‟UTR Vùng 3‟ không dch mã 3‟ Untranslated region AAP Mi neo Abridged anchor primer AFLP a hình chiu dài DNA đc khuch đi Amplified fragment length polymorphism ALF Yu t kháng khun Anti-lipopolisaccharide factor ALFPm ALF dng 1 tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 1 ALFPm3 ALF dng 3 tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 3 AMP Peptide kháng khun Antimicrobial peptide apoptosis T bào cht theo chng trình Programmed cell death bp Cp base Base pair B.megaterium Bacillus megaterium Bacillus megaterium cDNA DNA bô sung Complement DNA DP Mi suy din Degenerate primer DNA Axit deoxyribonucelic Deoxyribonucleic acid dNTPs Hn hp các nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTPs Hn hp các deoxynicleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Dideoxyribonucleoside triphosphate dsRNA RNA si kép Double stranded RNA DEPC Cht kh Rnase Diethyl pyrocarbonate E. aerogenes Vi khun Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes E. coli Vi khun Escherichia coli Escherichia coli EDTA Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EST on trình t gen biu hin Expressed sequence tag GSP Mi đc hiu gen Gene specific primer vii kb Kb Kilo base LB Môi trng LB Luria Bertani mtDNA DNA ty th Mitochondrial DNA mRNA RNA thông tin Messenger RNA OD Mt đ quang Optical density ORF Khung đc m Open reading frame PCR Phn ng chui polymerase Polymerase chain reaction PmAV Gen kha ng virus tôm su Penaeus monodon antivrus PmRab7 Rab7 tôm sú Penaeus monodon Rab7 P. pastoris Nm men Pichia pastoris Pichia pastoris 3‟RACE Khuch đi nhanh đu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends 5‟RACE Khuch đi nhanh đu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends rALFPm3 ALF tái t hp tôm sú dng 3 t tôm sú Recombinant anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon 3 RNA Axit ribonucleic Ribonucleic acid RNAi RNA can thip RNA interference RNase Enzyme phân hy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngc Reverse transcriptase RT-PCR PCR bng enzyme phiên mã ngc Reverse transcriptase-PCR siRNA RNA can thip nh Small interfering RNA SNP a hình các nucleotide đn Single-nucleotide polymorphism SSC Dung di ch Natri citrate Solution sodium citrate TSV Virus gây hi chng taura Taura syndrome virus UAP Mi khuch đi chung Universal amplication primer UPM Hn hp mi chung Universal primer mix v/p vòng/phút rotor/minute WSSV Virus gây bnh đm trng White spot syndrome virus YHV Virus gây bnh đu vàng Yellow head virus YP Môi trng YP Yeast peptone YPD Môi trng YPD Yeast peptone dextrose viii DANHăMCăCỄCăBNG Bng 1.1. Thô ng kê ca c gen liên quan đê n hê miê n dich tôm 26 Bng 2.1. Các thit b s dng trong nghiên cu 34 Bng 2.2. Trình t các mi s dng trong nghiên cu 47 ix DANHăMCăCỄCăHỊNH Hình 1.1. Hình nh tôm sú 3 Hình 1.2. Tôm sú nhim WSSV 10 Hình 1.3. Tôm sú nhim YHV 12 Hình 1.4. Tê ba o ma u tôm su 17 Hình 1.5. H thng hot hóa proPO và tng hp melanin 19 Hình 1.6. C ch đông máu tôm 21 Hình 2.1. S đ phân lp gen 35 Hình 2.2. S đ thit k mi t gen đã bit trình t 42 Hình 2.3. S đ thit k mi t gen đã bit mt phn trình t đu 3‟ (Invitrogen) 42 Hình 2.4. S đ thit k mi t gen đã bit mt phn trình t đu 3‟ (Clontech) 43 Hình 2.5. S đ thit k mi khi bit mt phn trình t đu 5‟ ca gen 43 Hình 2.6. S đ thit k mi phân lp gen syntenin 44 Hình 2.7. S đ thit k mi phân lp gen hemocyanin 44 Hình 2.8. S đ thit k mi phân lp gen Ran 45 Hình 2.9. S đ thit k mi đ phân lp gen hoàn toàn mi tôm sú 46 Hình 2.10. S đ thit mi khuch đi đon gen mã hóa peptide ALFPm3 trng thành 46 Hình 2.11. S đ biu hin ALFPm3 51 Hình 3.1. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Rab7 57 Hình 3.2. Trình t gen và amino acid suy din ca Rab7 58 Hình 3.3. So sánh trình t nucleotide gen Rab7 ca tôm sú Vit Nam vi trình t đã công b 59 Hình 3.4. Mô phng cu trúc bc hai và phân tích các motif chc nng ca protein Rab7 60 Hình 3.5. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon 5‟-syntenin 62 Hình 3.6. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca đon 5‟-syntenin 63 Hình 3.7. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen syntenin 64 x Hình 3.8. Trình t gen và amino acid suy din ca syntenin 66 Hình 3.9. So sánh trình t amino acid ca protein syntenin gia các loài khác nhau 67 Hình 3.10. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon 5‟-hemocyanin 70 Hình 3.11. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca đon 5‟-hemocyanin 71 Hình 3.12. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen hemocyanin 72 Hình 3.13. Trình t gen và amino acid suy din ca hemocyanin 73 Hình 3.14. So sánh trình t amino acid ca protein hemocyanin gia các loài 75 Hình 3.15. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng mt phn đon gen Ran 77 Hình 3.16. Trình t nucleotide và amino acid đon gen Ran 78 Hình 3.17. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 3‟-Ran 79 Hình 3.18. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng đon gen 5‟-Ran 80 Hình 3.19. Trình t nucleotide và amino acid suy din ca gen Ran 81 Hình 3.20. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen Ran 82 Hình 3.21. So sánh trình t amino acid ca protein Ran gia các loài khác nhau 83 Hình 3.22. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen caspase 86 Hình 3.23. Trình t nucleotide và amino acid ca caspase 87 Hình 3.24. So sánh trình t nucleotide ca gen caspase ca tôm sú Vit Nam vi trình t đã công b 88 Hình 3.25. So sánh trình t amino acid suy din ca protein caspase tôm sú vi các loài tôm khác nhau 90 Hình 3.26. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen PmAV 92 Hình 3.27. Trình t gen và amino acid suy din ca protein PmAV 93 Hình 3.28. So sánh trình t amino acid ca protein PmAV 94 Hình 3.29. Kt qu đin di sn phm khuch đi và tách dòng gen mã hóa peptide kha ng khuâ n tng t crustin 96 Hình 3.30. Trình t gen và amino acid suy din ca gen mã hóa peptide kháng khun tng t crustin 96 [...]... còn l i c a thân bi i t màu nâu sang màu xanh ho t (Hình 1.1) Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là ho [209] Hình 1.1 Hình nh tôm sú [14] 4 Tôm sú , phía Tây Nam nuôi và [174] Loài tôm này - 34 0/00 Tôm sú có pha - 4 tháng c - 50 g Tôm - 250 100 - 300 - 200 - 200 g Tôm sú có sú [11] Tôm sú là loài giáp xác có tin [11] sú , Tôm cái - 280 - u trùng theo các larvae) postlarvae) chu trình [11], [145], [174]... [119] Các , ng c p mé b chìm xu Gan, t WSSV t và ng có màu tr ng ho trên , tôm (Hình 1.2) vài mm này là 1 cm [2], [51] Genome c a WSSV là DNA s c kho ng ng phân l p t genome c a WSSV WSSV phân l p t tôm sú c nh nh t 292967 bp, c l n nh t là 307287 bp, genome c a Trung Qu c là 307107 bp Genome [140] genome tôm sú và [213] WSSV [66] l tôm kho c và th nhi m b i giáp xác hoang dã trong ao và do m tr ng [50],... sông C u Long b thi t h i l n nh t do t p trung kho ng 87% di n tích nuôi tôm c ac c Hi các t nh ven bi n phía Nam t - 1994 b nh u vàng b m tr ng và b ng tôm ch t hàng lo t nh tôm sú có lo i [8], [10], [11] N trung [9], sú [3], [4], [13] sú [2] phòng [15] sú [1], [12], 7 1.1.3 Các 1.1.3.1 liên quan B tôm kitin, mang, , , Các , gây tôm nuôi là Vibrio, chitin [103] hi Vibrio V cholerae, V parahaemolyticus... crustin ng t tôm 98 Hình 3.32 K t qu n di s n ph m khu i và tách dòng gen ALF 100 Hình 3.33 Trình t nucleotide và amino acid suy di n c a ALFPm 101 Hình 3.34 Trình t nucleotide và amino acid suy di n c a ALFPm3 102 Hình 3.35 So sánh trình t nucleotide c a gen ALFPm v i trình t 102 Hình 3.36 So sánh trình t nucleotide c a gen ALFPm3 v i trình t tôm sú Vi t Nam tôm sú Vi t Nam... maker 24 microsatellite marker genome là 2033,4 cM marker [243] - EST) EST/cDNA genome tôm sú lite và [203] 1.3.2 phân tích các (Expressed sequence tag, EST/ cDNA) 25 [111] [195], [196] EST quan t [203] Nh ng nghiên c u v ph n ng t bào và d ch th c các nhà khoa h c r c bi các nhân t mc a ng mi n d ch [26], [27], [172] Trong nh hi tôm khi b nhi i s phát tri n c i, nh ng nghiên c k t qu góp ph n làm sáng... có hàm amino acid cao, ngoài ra còn vitamin cho B6, E, A, D Alzheimer Các : H selenium c (apoptosis [143], [231] Tôm sú là loài [174] [16] 1.1.2 Tình hình tôm sú 32 , ong phú 6 [201] công, con (postlarva 15 [3] Theo th ng kê c a B Thu S n (1995), t - 1995 d ch b nh tôm th ng di n tích nuôi tôm có d ch b nh là 84.558 ha v i s kho ng 294 t ng thi t h c tính là 5.225 t n, tr giá n nay, d ch b nh v n t n... dài 150es [44], [228] [215], b YH associated virus - [53] [103] 12 [8] Tôm n [35], [44] [70], [71], dot blot [129], [148], RT - PCR [229] Western blot [147], [200] [183], [184] 1.1.4 ph phòng và tôm sú 13 K c tr 7-10 ngày [8] P các là [238] và [8] gây ra là phòng CR 14 mang cho tôm [2], [117] Có tôm không có xúc [68] [90], [215] và tôm tác nhân theo [212] các sau khi WSSV, và WSSV Các Sargassum polycystumwas... [134] sinh v [155] virus trong Tuy nhiên, n mã hóa protein có các gen trì hoãn quá trình apoptosis M vào các caspase - , virus Quá trình apoptosis Các caspase là protein trung tâm trong quá trình apoptosis caspase WSSV tôm nuôi , tôm Marsupenaeus japonicus) gen , apoptosis apoptosis vai trò trong apoptosis trong tôm kháng virus WSSV là tôm càng tiêm WSSV vào ngày 3 Apoptosis sau [119] [227] 21 1.2... 2004, các protein tôm tách dòng và Lo và cDNA gen HSP70 , stress và [125] tôm sú amino acid HSP70 bào máu tôm 3 sau và sau 30 phút là (Antimicrobial peptides - AMPs) có protein , [141] AMPs có sinh trùng, màng peptide này và màng chí vi , [36], [83] zyme có vai trò polysaccharide Gram (-), các 23 , cho phép các lysozyme các bên trong và bên ngoài sterases và chitinases [55] 1.3 1.3.1 genome [107] [223]... i ch ng B megaterium 111 Hình 3.45 Ho t tính c i v i ch ng E aerogenes 112 1 1 Vibrio spp g V harvey (Yellow head virus - YHV), t liên quan immune sy (White spot syndrome virus - sequence tag - 2 , các gi phòng phòng cho tôm Tuy nhiên, các làm phòng tôm sú (Penaeus monodon 2 , 3 - - g 3 1.1 Penaeus monodon Ngoài ra, loài tôm này [11] Penaeidae và [38] Animalia Ngành: Arthropoda : Malacostraca . cho nghiên cu phòng tr bnh tôm sú, chúng tôi tin hành thc hin đ tài: Nghiên cu đc đim cu trúc mt s gen thuc h min dch tôm sú (Penaeus. bê nh tôm sú Viê t Nam 5 1.1.3. Các bnh thng gp tôm sú 7 1.1.4. Phng pha p phòng và tr bnh tôm sú 12 1.2. H min dch tôm sú 14 1.2.1.