1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bii khí hu ngày càng din ra mnh m ng bt li t ng, n s ng và phát trin ca nhiu loài cây trng. Do s i khí quyn vi hiu ng nhà kính, nhi ca khí quyn m d hai cc s to s ngp lt  t tht, hn hán và s xâm nhp mn s tr thành v ln gây ng nghiêm trn phát trin nông lâm nghip thích ng vi nhng bii khí hu và nhng h qu ca chúng, chic chung ca ngành nông lâm nghip  tiên to ra nhng ging cây trng chng chu c khô hn, mn, ngp úng, lnh và chng chu vi t có v u lân, ng c st, ng c nhôm. Nhng bt li t môi tr khô h t nhim mn, ngp úng, nhi  c  ng làm mt cân bng v áp sut thm thu gây nh ng nghiêm trt và chng ca nhiu loài cây trng (Linhui et al., 2012). Mt trong nhng phn ng gp nht khi cây gu kin bt li v là ng tng ht chuy lo ng áp sut thm thu cho t bào. Proline c bin là mt trong nhng ch quan trng u chnh áp sut thm thu ni bào khi thc vt sng trong các u kin bt lkhô hn, mn, lnh (Sávio et al., 2012). Trong t bào thc vt, glycine betaine (GB) c tng hp t choline thông qua hai phn ng liên tip c xúc tác bi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al.,     c vt bc cao,  vi khun E. coli và  mt s ng vng sinh tng h tr   c là kh choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành GB (Takabe et al., 1998). c lng sinh tng hp GB  vi khun Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens li rn, t choline chuyn hóa thành sn phm trc tip là GB ch cn xúc tác bi choline oxydase (COD) (Ikuta et al., 1977). Sinh tng hp proline  thc vt bc cao có th c thc hing hoc t glutamate hoc t ng sinh tng hp proline t  c ch  u tiên  vi khun bi  nhiu loài sinh vn 2 khác nhau.  thc vt bc cao, chu trình này ch nh sau khi các nhà khoa hc thành công trong vic phân ln cDNA ca gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992). P5CS là mt enzyme gi hai ch nht enzyme hot hóa glutamate tr thành dng hot ng phn  to ra pyrroline-5-carboxylate. Dn xu b kh bng phn ng xúc tác bi enzyme pyrroline-5- to proline. T nhng hiu bit sâu sc v ng sinh tng hp glycine betaine và proline  sinh vt, cùng vi s phát trin mãnh m cc công ngh c bit là k thut to cây trng bii gen. Các nhà khoa hc các gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR t nhiu ngun khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tng hp GB c thit k vi các promoter biu hic hiu, mnh và chuyn thành công vào nhiu loài cây trng, các loài cây trng bin ng kh ng chu kin bt li cng (Amudha & Balasubramani, 2011). Các kt qu  : Cây Arabidopsis thaliana   codA,COX, GSMT/SDMT          ,     , chu       (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998; Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000),     (Brassica juncea)    codA        (Waditee et al., 2005, cây lúa (Oriza sativa) chuyn gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hng, cây b    codA          , hn,    và oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al., 2009). Cây thuc lá chuyn gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998; Yang et al., 2008), cây cà rt chuyn gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và ngô chuyn gen betA           c chng minh là chng chu tu kin cn cng. Kt qu nghiên cu chuyn gen P5CS, P5CR,  -OAT tham gia sinh tng hp proline vào cây thuc, lúa mì, cà rt, chanh, Arabidopsis cho thy cây chuyn gen chng chu tu king sng b mn, hn, oxy hóa, nhit cao  3 2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han & Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al., 2004). Vit Nam là mt trong nhng quc gia b ng mnh m ca vic bin i khí ht nhim m  là mt trong nhng nguyên nhân chính làm git và chng cây trng nông lâm nghip và thu hp din tíct canh tác. ,                 nông lâm nghip                                      . Trên th gii, các nghiên cu to cây trng bii gen ng chng chu kin ng bt li ch yu tp chung vào nhóm cây nông nghip, còn nhóm cây lâm nghip (cây g) mi ch có mt vài công trình công b (Yu et al., 2009, Yu et al., 2010). Trong lâm nghip, cây dPopulus sp.) c s dcây mô hình cho các nghiên cu chuyn gen. Tuy nhiên, hn ch duy nh   u kin khí hu ca Vit Nam. Vì vy, vic tìm kim mt loài cây d thích ng và ph bin  Vit Nam  làm cây mô hình cho các nghiên cng cây lâm nghip tr nên rt cn thit. t trong nhng cây trng quan trng trong chin c phát trin lâm nghip  c ta. Nó có mt  6/9 vùng sinh thái lâm nghip,         ng bng Sông Hng và vùng Nam Trung b u trong danh mc các cây trn theo quy nh s -BNN ngày 15/03/2005 ca B ng B   a, nhng kt qu nghiên c  u trong vic xây dng n gen  ng cây Xoan ta là rt có trin vng (Bui Van Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010) cho phép các nhà khoa hc có th tin hành các nghiên cu ci thin gic bit là nâng cao tính chng chu ca loài cây này và có th s dt loài cây mô hình cho các nghiên cu chuyn gen vào cây lâm nghip  Vit Nam.           nêu trên, chúng tôi          Nghiên cứu tăng cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng trên đối tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật. 4 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2.1. Mc tiêu chung: Thông qua công ngh chuy nghiên cu kh ng tính chng chu king bt li trên ng cây Xoan ta nhm b  khoa hc và thc tin cho vic to ging cây trng lâm nghip có kh ng chu tt vu king bt li. 2.2. Mc tiêu c th: (1) Xây dc quy trình chuyn gen vào cây Xoan ta t hiu su làm công c nghiên cu; (2) c hong ca promoter rd29A cm ng hn  các dòng Xoan ta chuyn gen; (3) c kh u hn ca các dòng Xoan ta chuyn gen P5CS t bin loi b hiu ng phn hc (P5CSm); (4) c kh u hn, mn ca các dòng thuc lá và Xoan ta chuyn gen codA. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Xây dng và t     n gen vào cây Xoan ta thông qua Agrobacterium tumefaciens; (2) To các dòng Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen rd29A::gus intron và  giá hot ng ca promoter rd29A u khin biu hin gen gus u kin bình ng và x lý hn nhân to; (3) To các dòng Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen rd29A:: P5CSm và  giá kic tính sinh lý, sinh hóa ca cây chuyu kin x lý hn nhân to; 5 (4) To các dòng thuc lá và Xoan ta chuyn gen mang cu trúc gen 35S::TP- codA/35S::codA và  kic tính sinh lý, sinh hóa ca cây chuyn u kin x lý hn, mn nhân to. 4. Đóng góp mới của luận án Luu tiên  Vit  gii xây dng c quy trình chuy      t hiu sut cao thông qua Agrobacterium tumefaciens. Lun án là công trình u tiên tc các dòng cây Xoan ta chuyn gen P5CSm/codA và chc kh  ng tính chu hn và chu mn  các dòng cây chuyn gen. Luu tiên s dng gen codA c thích ng mã di truyn  thc vt  chuyn vào cây thuc lá và cây Xoan ta, kt qu cho thy cây chuyn gen sinh tng h t nhiu ln so vi các công trình công b c n n b  lý lun và thc tin cho vic ng dng công ngh chuyn gen trong to ging cây trng nông lâm nghip nói chung và cây Xoan ta nói riêng chng chu tt vu king bt li. 6 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.   Thc vm v trng thái sc thù bám tr t ti mt ch, không di chuyn t sng  sng khác trong sut quá trình phát tring vt, thc vi mt trc tip vi u kin ngoi cnh bt lng và phát trin. Nhng bt li t ng có th gây ra nhng bii sinh lý, hóa sinh và hình thái; t  t và chng cây trng. 1.1.1. Tác hại của hạn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Hn hán là mt nguyên nhân quan trng làm git và chng sn phm ca cây trng hn hán cây b stress mt c dn nhiu hu qu nghiêm trng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013): (i) Gây nên hing co nguyên sinh và làm cho cây b héo. S co nguyên sinh cht xy ra khi t bào b stresc trong t bào tht thoát ra ngoài nên khi nguyên sinh cht ca t bào co li, th tích không bào b thu hp. Khi cây sng trong ng thic kéo dài, t bào mc dn các mô tr nên mm yu và s héo xy ra. Mô thc vt b héo tm th n nu s thic xy ra nghiêm trng và trong thi gian dàing sng b khô hn cn tr s vn chuyc trong mch g. Khi thic do khô hn s cung cc cho r   thy  thic ban ngày, d n các lông hút b t  lp ngoài vùng v b ph cht sáp (suberin) làm gim áp sut r nên nh y cc lên cao trong mch gc bit khi thic s hình thành nhiu bt khí trong mch g dn phá v tính liên tc ca cc nên cc trong mch g y lên liên tc. (iii) Hn hán làm dày lp cutin trên b mt lá làm gim s c qua biu bì. (iv) S thic làm gi quang hc 7 trong lá còn khong 40 -50% quang hp ca lá b . c bit, hn hán cn tr s ng ca cây trng. Thic n các hong sinh lý, nht là quang hp nên làm ging t cây trng nghiêm trng. 1.1.2. Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng t mn là lot chng mui cao (>0,2%) có nhic. Nu hng mui t cao, áp sut thm thu ca dung dt rt cao, có th t 200 - t nhim mn có áp sut thm thu cao nên cây không th   c t  ng gây nên hi ng hn sinh lý   ng không th sng có áp sut thm thu trên 40 atm. Ngoài ra, trong t nhim mn còn cha nhic. Các ion này cnh tranh vi chng trong quá trình hút ca r làm cho r khó hút chng dn cây trng  ng chm và gi  t m  t nhim mn có các mui NaCl, Na 2 SO 2 , Na 2 SO 4 , Na 2 CO 3 , MgCl 2, , v.v. các mui này ng cao trong t c vào trong t bào s gây ra ri lon  i cht ca t c s c ch hong ca các enzyme, các chng dn làm ri lon các i cht và các hong sinh lý ng ca t  c còn làm nh ng bt ln nguyên sinh cht, làm gim m nht, tính thm ca nguyên sinh cht làm cho t bào mt chng. Các hong sinh lý ca t bào    ng nghiêm trng khi cây b  ng ca mui mn. Quá trình quang hp gim mnh do lá kém phát trin, sc t quang hp ít do các chc c ch quá trình tng hp các sc t quang hp. Quá trình hô h cht b phân hy mu qu tng thp do phn lng ca các quá trình d hóa b thi dng nhit làm cho t bào thing  duy trì các hong ng. Phân hy mnh, tng hp li yu nên  ng vt cht do hô hp phân hy, dn các cht d tr b hao ht mnh,  ng hong chm, còi cc và t 8 thp. Cây s b cht nu b tác ng cng nhim mn cao hay nhim mn trong thi gian dài (Jouyban, 2012). 1.1.3. Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Thc vt là sinh vt bin nhit nên nhi ng có ng ln hong sng c nhi sinh lý ca cây khong 1  45 o C. Stress nhit do nhi ng xung quanh cao là mt ma nghiêm tri vi cây trng sn xut trên toàn th gii (Hall, 2001; Harrison et al., 2011). Nhi n hoc liên tc là nguyên nhân gây ra mt loi v hình thái gii phu, sinh lý và sinh hóa  thc vt, n s ng và phát trin ca thc vt và có th dn suy gim sng. S tip xúc ca thc vt ti nhi cao, ht ging có th y nhanh quá trình lão hóa, làm gim s u qu, trng ht ging và làm gitu này là do thc vng chuyn ng các ngu chng li stress do nhin ch ng và sinh sn. Mt ng khác ca stress do nhit cao cho nhiu loài thc vt là gây ra vô sinh khi nhit cao tác dng c hoc trong khi n hoa. Cây h c bit nhy cm vi stress do nhit  n n hoa, ch có mt vài ngày tip xúc vi nhi cao (30  35 o C) có th gây ra tn tht nt thông qua ging hoa hoc tình trng không phát tri ca v qu.  nhi rt cao gây t bào nghiêm trng và thm chí làm cho t bào b cht trong vòng vài phút, dn s s nhanh chóng ca các t chc t bào (Schoffl et al., 1999).  nhi cao va phi, tn c cht ch có th xy ra sau khi tip xúc lâu dài. Tn c tip do nhi cao bao gm s bin tính protein và s kt t, ng ca màng lipid. Tp hoc tt chm bt hot các enzyme trong lc lp và ty th, c ch tng hp protein, suy thoái protein và màng t bào mt tính linh hot (Howarth, 2005). 9 Stress nhit cao n t chc ca các cu trúc vi ng bng cách chia tách và/hoc kéo dài ca chúng, hình thành các th sao hình ng trong các t bào phân bào và kéo dài ca vi ng ht vách. Ti cùng dn ti c ch s ng, gim dòng ion, to ra hp chc hi và các loi ôxy phn ng (reactive oxygen species = ROS) c cho t bào (Howarth, 2005). ng ca cây trng gim sút là kt qu chính ca vic cây ng u kin nhi cao. Nguyên nhân ch yu là do nhi cao làm gim t quang hp, ng to ra gim sút nghiêm trng. Có gi thit cho rng trong các phn ng ca pha sáng, nhi cc tng hp ATP liên tc (bng quá trình vn chuyn t có tính chu trình) n khi cân bng vng ATP tiêu th (Bukhov et al., 1999). Trong các phn ng pha ti ca quá trình quang hp, s honh c trung gian, s hot hóa này b c ch  3540C dn vic gim tiêu th CO 2 và gim to ra các carbohydrates (Dubey, 2005; Wahid et al., 2007). Trong ty thu kin bt lng s là nguyên nhân phá hy NAD+, ATP tiêu th t tri và vic hô hp s c phá v NAD+ mt phn do nguyên nhân ca vi  ng ho ng ca poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), cht s d tng hp ADP-ribose. Quá trình poly(ADP) u hòa sau dch mã cc c khu bi s oxi hóa và các dng khác ca vic phá hng DNA. S suy yu gây ra bu kin bt li mang li s suy yu cng khi mà các phân t  tái tng hp NAD+ (Zidenga, 2005). Cui cùng, có th nói rng vic chng chu nhi ca cây là mt quá trình tiêu tn nhing ni bào    i phó nhi cao. Nói chung các phn    ng sn xut ROS, rt cuc có th gây cht t bào, mô và c th (De Block et al., 2005). 10 1.1.4. Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng và phát triển của cây trồng Nhi thp làm cho lá cây b héo mng v c do nhit  thp c ch s c ca h r và s vn chuyc ca h mch. Nhi thc ch quá trình quang hp ca lá, làm gim hô hp, c ch các quá trình tng hp nht là tng hp các phân t protein do các enzyme hong yu.  nhi thp làm cho màng nguyên sinh cht b ti thm nên tht thoát ch ng ca t bào ra bên ngoài. Nhi thp nh n cu trúc và cha h r. S c và cht khoáng b gim mnh làm cho cây thic và chng. Nhi thp còn làm tn hi màng lc lp, ty th dn ng nghiêm trng n các quá trình sinh lý ca p, hô hp. Nói chung nhi thp làm gim mnh sinh t và chng sn phm ca cây trng (Gulzar et al., 2011). 1.1.5. Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện môi trƣờng bất lợi Các yu t c            ng lên lá. Hn, úng và mn mung lên b r. Các yu t cng gây ra din rng v các phn ng ca thc vt, t vii biu hii cht trong t n nhi ln t t cây trng. Nhng bii ln m i cht khi gp các yu t cng s làm thay i s biu hin cu t vic nhn bit tín hiu  m t bào, lan truyn tín hiu này trong t bào và tin kh sinh vt. S biu hin ca các gen phn i vi các yu t c hiu tiên là  mc  t n m toàn b , tip theo là s i v hình ng, phát trin và cui cùng làm n kh t và chng sn phm ca cây trng (Trn Th  S biu hin các gen phn ng vi các yu t cc ng ph thuc vào kh n bit chúng. Bng chng các chu khin [...]... tố cực đoan của môi trƣờng (Buchanan et al., 2000) 12 1.2 TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI CỦA THỰC VẬT 1.2.1 Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trƣờng bất lợi Điều kiện bất lợi từ môi trƣờng sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học nhƣ mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh... 1.2.3.1 Proline đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật Proline là một trong những axít amin đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi ở thực vật Ở nhiều loài thực vật khác nhau hàm lƣợng proline tăng lên rất cao khi gặp các điều kiện môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nóng, nồng độ chất kim loại cao, nhiễm các loại bệnh, thiếu... bởi các yếu tố bất lợi của môi trƣờng, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc hoặc hoormon giúp chúng có khả năng thích ứng Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng ở thực vật đang đƣợc tập trung vào hƣớng nghiên cứu làm tăng cƣờng các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nƣớc Sự tăng cƣờng các chất điều. .. chức năng của các đại phân tử GB xuất hiện nhƣ một yếu tố quyết định tới khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở cây trồng Chất này có hiệu quả lớn và liên quan mật thiết đến khả năng sinh trƣởng của cây trồng trong điều kiện môi trƣờng hạn hán và nhiễm mặn Mức độ tích lũy GB tƣơng quan với khả năng chống chịu điều kiện bất lợi GB đƣợc tích lũy chủ yếu trong lục lạp, nó đóng vai trò quan trọng trong điều. .. nhau, năng suất hạt của cây chuyển gen cao hơn đáng kể so với các cây đối chứng không chuyển gen Cây bông chuyển gen CDH cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn (Lv et al., 2007) Các cây bông biến đổi gen tích lũy hàm lƣợng GB lên đến 2,3 - 2,9 lần cao hơn so với các cây đối chứng không chuyển và cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn hẳn so với cây không chuyển gen từ giai đoạn cây con... loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi các gen đã đƣợc phân tích có sự tích lũy GB dẫn 32 đến tăng cƣờng đƣợc khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ mặn muối, khô hạn, lạnh, băng giá, nhiệt độ cao và tác nhân oxy hóa 1.3.2.1 Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng chống chịu mặn muối Độ mặn cao gây ra sự mất cân bằng ion, gây độc hại cho tế bào chất và tăng. .. thành công từ cây lúa và khi đƣợc chuyển trở lại vào cây lúa nhằm tăng cƣờng hoạt động của gen này, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh đƣợc cải thiện rõ rệt (Hong et al., 2000; Hur et al., 2004) 31 Bảng 1.1: Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp proline, chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng bất lợi Khả năng chống chịu bất lợi Loài cây Gen. .. NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG BẤT LỢI 1.3.1 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp proline chống chịu tốt với điều kiện môi trƣờng bất lợi Các nhà khoa học đã phân lập đƣợc các gen: P5CS, P5CR, P2CR, α-OAT, v.v mã hóa cho các enzyme tham gia vào chu trình sinh tổng hợp proline Các gen này đã đƣợc thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng Các. .. đến tích chống chịu các điều kiện cực đoạn của thực vật Nhƣ vậy, khi gặp các yếu tố cực đoan đột ngột, thực vật phải điều chỉnh để thích ứng với sự thay đổi môi trƣờng sống nhằm kéo dài khả năng tồn tại, sinh trƣởng và phát triển Phản ứng của thực vật khi gặp điều kiện nhƣ hạn, mặn, v.v gây mất nƣớc tế bào, chúng thƣờng tăng cƣờng biểu hiện các gen liên quan đến tổng hợp các chất thứ cấp nhƣ các loại... cực đoan không giống nhau Các loài thực vật khác nhau sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan của môi trƣờng phụ thuộc vào bản chất di truyền (hệ gen) của chúng Vì vậy, khi đối mặt trực tiếp với các yếu tố bất lợi của môi trƣờng có loài cây có thể chống chịu đƣợc để tồn tại, sinh trƣởng và phát triển, có loài cây sẽ bị chết Ngay trong cùng một loài cây, các cá thể khác nhau cũng . Nghiên cứu tăng cƣờng khả năng chống chịu các điều kiện bất l i của môi trƣờng trên đối tƣợng cây Xoan ta (Melia azedarach L. ) bằng công nghệ gen thực. proline ở thực vật 1.2.3.1. Proline đối với tính chống chịu điều kiện môi trƣờng bất l i ở thực vật Proline l mt trong nhc quan tâm nghiên