TCNCYH 23 (3) 2003 Kết quả xác định độ nhạy cảm với kháng sinh (MIC) của các chủng Salmonella typhi phân lập ở Đăklăk từ 1996-1998 Nguyễn Ngọc Hng 1 , Tô Song Diệp 2 , Đào Xuân Vinh 1 , Đỗ Thung 1 và CS. 1 .Viện Vệ sinh dịch tễ - Tây Nguyên 2 .Trung tâm bệnh nhiệt đới TP.Hồ Chí Minh Lần đầu tiên ở Đak Lak, chúng tôi đã phân lập đợc S. typhi từ bệnh nhân thơng hàn và tiến hành xác định M.I.C với 50 chủng S. typhi phân lập ở Đak Lak từ năm 1996 1998, kết quả nh sau: Tất cả các chủng đều nhạy cảm với các kháng sinh ở các nồng độ (1 àg/ml với Tetracycline, Trimethoprim/sulfa và 4 àg/ml với Ampicillin, Nalidixic và cephalosporin thế hệ 3 (Ceftriaxone M.I.C=0,125 àg/ml) với fluoroquinolone (Ofloxacin M.I.C=0,25 àg/ml), đặc biệt 16% đề kháng với Chloramphenicol (M.I.C = 64 àg/ml). Đây là sự khác biệt lớn so với các chủng S. typhi phân lập đợc ở miền Bắc và miền Nam Việt Nam. Phân tích đặc tính plasmid cho thấy: cả 50 chủng đều không mang R-plasmid 43 chủng mang một plasmid khoảng 70 Md. 7 chủng không mang bất kỳ plasmid nào. I. Đặt vấn đề ở Tây Nguyên trớc năm 1996 cha hề ghi nhận trờng hợp phân lập Salmonella typhi nào. Từ năm 1996 -1999 tại Đăklăk đã phân lập 50 chủng S. typhi từ bệnh phẩm máu của 250 ngời nghi sốt thơng hàn. Chúng tôi đã tiến hành xác định độ nhạy cảm các chủng S. typhi phân lập đợc với các kháng sinh thông thuờng nh: Ampicilline, Tetracycline, Bactrim, Chloramphenicol bằng phơng pháp khuếch tán trên thạch. Kết qủa cho thấy cả 50 chủng S. typhi đều còn nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Trong khi đó theo các công bố của các tác giả trong nớc, thì các chủng S. typhi phân lập đợc ở các miền Bắc, Trung, Nam đều kháng lại các kháng sinh thông thờng, đặc biệt kháng rất cao với Chloramphenicol. Nh vậy độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng S. typhi phân lập ở Đăklăk, khác với các vùng khác trong nớc. Để đánh gía một cách chính xác hơn về khả năng nhạy cảm với kháng sinh của các chủng S. typhi phân lập ở Đăklăk, chúng tôi đã kết hợp với khoa vi trùng, Trung tâm bệnh nhiệt đới (TTBNĐ) TP. Hồ chí minh cùng sự hỗ trợ của các chuyên gia thuộc Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Wellcome Trust-Đại học Oxford, tiến hành xác định MIC và Plasmid kháng thuốc của 50 chủng S. typhi phân lập đợc nhằm đóng góp thêm t liệu cho các nhà khoa học quan tâm. II. Phơng pháp và vật liệu nghiên cứu 1. Chủng vi khuẩn: 50 chủng S. typhi do labô vi khuẩn đờng ruột, Viện Vệ sinh dịch tễ Tây nguyên phân lập 27 TCNCYH 23 (3) 2003 đợc từ máu, phân của bệnh nhân nghi sốt thơng hàn ở Đăklăk. 2. Sinh vật phẩm : Môi trờng Mueller Hinton (MH2) và bột kháng sinh các loại: Ampicillin, Chloramphenicol, Ceftriaxone, Erythromycin, Nalidixic acid, Ofloxacin, Trimethoprim/Sulfamethoxazone, Tetracycline dùng trong nghiên cứu đều do hãng Sanofi cung cấp và Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Wellcome Trust của đại học Oxford, tại Trung tâm bệnh nhiệt đới TP.Hồ chí Minh tài trợ. 3. Phơng pháp: 3.1. Phơng pháp xác định MIC: Tiến hành trên môi trờng thạch: Kháng sinh đợc hòa tan vào thạch MH2 ở các nồng độ xác định, tùy theo mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh, sau đó chấm vi khuẩn với nồng dộ 10 4 CFU/ml lên mặt thạch bằng máy dập tự động và đem ủ ở 37C/24h, sau đó đọc kết quả theo bảng hớng dẫn của NCCLS (National committee for clinical laboratory Standards). Song song với các chủng thử nghiệm là các chủng kiểm tra: E. coli ATCC 25922 và S. aureus ATCC 25923. 3.2. Phơng pháp xác định Plasmid: Yếu tố R-plasmid đợc tách chiết theo phơng pháp Birboim cải tiến, sau đó đợc điện di trên thạch Agarose 0,7% để xác định Plasmid profile. Kích thớc của Plasmid sẽ đợc ớc tính dựa vào kích thớc plasmid DNA của các chủng E. coli chứng. 3.3. Xử lý kết quả: Các kết quả đợc xử lý bằng phần mềm EPI.INFO và WHONET.4 iii. KếT quả 1. Kết quả xác định MIC của 8 loại kháng sinh với các chủng S. typhi thử nghiệm (n=50.) Bảng 1: Tỷ lệ các chủng bị ức chế bởi các nồng độ kháng sinh thử nghiệm Kháng sinh 0,032 0,064 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 (àg/ml) (n) % AMP 43 2 55 CRO 71 2 27 ERY 4 96 NAL 4 96 OFL 100 SXT 100 TET 100 CHL 7 77 16 AMP: ampicillin ; CRO: Ceftriaxone; ERY: Erythromycin; NAL: Nalidixic acid OFL: Ofloxacin; SXT: Trimethoprim/Sulfame; TET: Tetracycline; CHL: Chloramphenicol. 28 TCNCYH 23 (3) 2003 Kết quả cho thấy: - Với Ceftriaxone 71% số chủng bị ức chế ở nồng độ 0,032 àg/ml; 2% ở nồng độ 0,064àg/ml và 27% ở nồng độ 0,125 àg/ml. - Với Ofloxacin 100% số chủng có M.I.C là 0,25 àg/ml. - Với Ampicillin có 32% số chủng bị ức chế ở nồng độ 1àg/ml; 2% ở nồng độ 2àg/ml và 55% ở nồng độ 0,125àg/ml -Với Trimethoprim/Sulfame và Tetracycline 100% số chủng có M.I.C là 1àg/ml - Với Chloramphenicol có 7% số chủng bị ức chế ở nồng độ 8àg/ml; 77% ở nồng độ 16àg/ml và 16% ở 32àg/ml - Với Nalidixic axit có 4% số chủng bị ức chế ở nồng độ 1àg/ml và 96% ở nồng độ 64àg/ml - Với Erythromycine có 4% số chủng bị ức chế ở nồng độ 16àg/ml và 96% ở nồng độ 64àg/ml. Bảng 2: M.I.C của 8 loại kháng sinh với các chủng S. typhi thử nghiệm Kháng sinh Ranh giới quy định (àg/ml) M.I.C 50 M.I.C 90 Kết quả (%) S R S I R Ampicillin 8 32 4 4 100 Ceftriaxone 8 64 0,032 0,125 100 Nalidixic acid 16 32 4 4 100 Ofloxacin 2 8 0,25 0,25 100 Trime/sulfa 2 4 1 1 100 Tetracycline 4 16 1 1 100 Erythromycin 5 8 16 32 100 Chloramphenicol 8 32 64 64 7 77 16 Từ bảng trên cho thấy M.I.C của 6 loại kháng sinh (Ampicillin,Ceftriaxone, Nalidixic acid, Ofloxacin, Trimethoprim/Sulfame và Tetracycline) với các chủng S. typhi thử nghiệm khá thấp hay các chủng thử nghiệm có độ nhạy cao đối với các kháng sinh này. Riêng 2 loại Chloramphenicol có 16% kháng ở mức độ thấp với M.I.C 90 là 32àl/ml và Erythromycin có tỷ lệ kháng khá cao, gấp 8 lần nồng độ kháng tối thiểu (8àl/ml). 2. Kết qủa phân tích Plasmid: Phân tích các plasmid từ các chủng S. typhi phân lập ở Daklal đợc thử nghiệm đã thu đợc kết quả: - Trong 50 chủng S. typhi: Không có chủng nào có plasmid kháng thuốc. - Có 43/50 chủng S. typhi có plasmid với trọng lợng < 70 MD, cha xác định đợc vai trò của các plasmid này. 29 TCNCYH 23 (3) 2003 - Có 7/50 chủng S. typhi hoàn toàn không có plasmid. iv. Bàn luận - ở Việt Nam, tính đến năm 1996 ở các miền Nam, Trung, Bắc đều xuất hiện nhiều ổ dịch hơng hàn do các chủng S. typhi đã kháng kháng sinh gây nên với tỷ lệ đa kháng kháng sinh là 74%, đặc biệt các kháng sinh thông thờng đều không còn tác dụng. Hiện tợng kháng cao và đa kháng là do các chủng S. typhi này đều có các plasmid kháng thuốc. Riêng các chủng S. typhi phân lập tại Daklak vẫn còn nhạy cảm cao với các kháng sinh thông thờng, do đó không có plasmid kháng thuốc. - Các chủng S. typhi phân lập ở Đaklak mới kháng Chloramphenicol nhng ở mức thấp (M.I.C là 32 àg/ml) so với các chủng S. typhi phân lập của Trung tâm bệnh nhiệt đới thàng phố Hồ chí Minh kháng với Chloramphenicol với M.I.C là 256 àg/ml. Tuy nhiên vẫn cần giám sát chặt chẽ tính kháng thuốc, của các chủng Salmonella tại địa phơng, đề phòng các chủng mang plasmid kháng thuốc từ địa phơng khác xâm nhập, vì khả năng truyền plasmid trong quần thể các Salmonella rất cao. - Trên cơ sở kết quả phân tích tính nhạy cảm với kháng sinh, có thể nói các chủng S. typhi phân lập đợc tại Đaklak có khả năng là các chủng có nguồn gốc tại chỗ. V. kết luận - Căn cứ vào M.I.C đã xác định 50 chủng S. typhi phân lập ở Đaklak từ 1996-1998 còn nhạy cảm với 6 loại kháng sinh: Ampicillin, Ceftriaxone, Nalidixic acid, Ofloxacin, Trimethoprim/Sulfame và Tetracycline. Riêng với Chloramphenicol 16% chủng kháng, 77% chủng nhạy cảm giới hạn và chỉ 7% còn nhạy cảm, 100% chủng kháng với Erythromycin. VI. đề nghị: - Trong bối cảnh kháng thuốc khá cao của các chủng Salmonella trong cả nớc hiện nay, tại khu vực Đaklak nói riêng và Tây Nguyên nói chung cần giám sát chặt chẽ tính kháng thuốc của các chủng Salmonella, đề phòng các chủng ngoại nhập lan truyền tính kháng thuốc bằng plasmid. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Thị Thanh Hà và Cs: Nhận xét tính kháng sinh của S. typhi tại một số tỉnh miền Bắc từ tháng 1 9/1995. Hội nghị khoa học, Vi sinh Y học 11.1995. 2. Lê thị ánh Hồng, Hoàng Thủy Long, Nguyễn Thị Vinh và Cs: Bớc đầu tìm hiểu khả năng lan truyền gen kháng kháng sinh của Salmonella typhi phân lập ở Việt Nam (1995- 1997). Tạp chí Y học dự phòng. 1999, tập IX, số 1(39): 433-437. 3. Nguyễn thị tuyết Hoa và Cs: Sử dụng Ofloxacine ngắn ngày trong điều trị thơng hàn. Tài liệu Y dợc học. 1995, 3. 4. Nguyễn thị tuyết Hoa, Tô song Diệp, Lê thị Phỉ, Nguyễn văn Bảy, John Wain, Amanda Walsh, Julia Ling: Đặc điểm vi sinh học của Thơng hàn kháng thuốc tại các tỉnh phía Nam. Báo cáo hội nghị Thơng hàn, Trung tâm bệnh nhiệt đới Tp Hồ chí Minh. 1996. 5. Nguyễn ngọc Hng, Đỗ Thung, Đào xuân Vinh và Cs: Một số kết quả nghiên cứu Vi sinh vật bệnh thơng hàn ở tỉnh Đaklak (1996-1997). Báo cáo Hội nghị khoa học, Tp. Hồ chí Minh. 1998: 32-38. 6. Đoàn mai Phơng, Lê đăng Hà, Nguyễn xuân Quang, Phạm văn Ca, Đặng lan Oanh: Nồng độ ức chế tối thiểu (M.I.C) của các chủng S. typhi đa kháng phân lập đợc trong năm 1994-1996. Kỷ yếu công trình nghiên cứu 30 TCNCYH 23 (3) 2003 khoa học-Nhi khoa miền Trung lần IV: 333- 335. 7. Nguyễn hứa Phục, Đỗ thị ngọc Mai, Trần thị Hoa và Cs: Nhận xét tính kháng kháng sinh của S. typhi phân lập tại khoa nhi bệnh viện Trung ơng Huế trong vụ dịch 1996. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học- Nhi khoa miền Trung lần IV, 112-115. 8. Nguyễn thị kiều Phơng và Cs: Độ nhạy với kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh thờng gặp tại một số tỉnh thành phố phía Nam Việt Nam. Phụ san chuyên đề vi khuẩn và kháng sinh, Th viện Y học Trung ơng, Số 2. 1995. 9. Butler, T.Arnoid.K.Linh, N.N. and Coll: Chloramphenicol-resitant typhoid fever in Viet Nam associated with R factor.lancet. 1973, III : 984-985. 10. Kim Y R: Management of multidrug- resitant typhoid fever. Med Progs. 1996, 23 (12): 27-29 . Summary Minimal inhibitory concentration (M.I.C) of antiobiotics to S. typhi strains isolated at Daklak from 1996-1998 For the first time in Daklak, S. typhi strains were isolated from cases of suspected typhoid fever. M.I.C was investigated on 50 strains of S. typhi isolated in Daklak from 1996-1998. The results were as following: - All these isolated were fully sensitive to common antibiotics (1 àg/ml for Tetracycline, Trimethoprim/sulfamethoxazole and 4 àg/ml for Ampicillin, Nalidixic acid and the third generation cephalosporines (Ceftriaxone M.I.C=0,125 àg/ml) and the fluoquinolones (Ofloxacin M.I.C=0,25 àg/ml), especially to 16% of Chloramphenicol-resistant isolates (with M.I.C =64 àg/ml). This is a great difference to compare with S. typhi strains isolated in Northern and the Southern Viet Nam. - Concerning the plasmid profile analysis, from 50 strains of S. typhi, the results showed that: + All these strains do not harbour any R-plasmid. + 43 strains harboured a plasmid lower than 70Md. + 7 strains do not harbour any kind of plasmids. 31 . TCNCYH 23 (3) 2003 Kết quả xác định độ nhạy cảm với kháng sinh (MIC) của các chủng Salmonella typhi phân lập ở Đăklăk từ 199 6- 1998 Nguyễn Ngọc Hng 1 ,. hành xác định M.I.C với 50 chủng S. typhi phân lập ở Đak Lak từ năm 1996 1998, kết quả nh sau: Tất cả các chủng đều nhạy cảm với các kháng sinh ở các