BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG QUỐC BẢO NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực GS.TS Kwon Moosik ĐẶNG QUỐC BẢO (Pr PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  GENE CLONING PRION (PrP) FROM KOREAN BOVINE: HANWOO (Bos taurus Coreanae) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Ph.D Kwon Moosik Dr Nguyen Ngoc Tuan Student DANG QUOC BAO TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học Các Thầy Cơ Phịng Quan Hệ Quốc Tế Các Thầy Khoa Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan, Hàn Quốc Đã truyền đạt cho em kiến thức quý báu giúp đỡ em thời gian em học tập trƣờng Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: TS Kwon Moosik- Trƣởng môn Công Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em nghiên cứu thực đề tài TS Nguyễn Ngọc Tuân- Trƣởng phòng Sau Đại Học, Đại Học Nông Lâm giúp đỡ nhiều hƣớng dẫn tận tình trình viết khố luận TS Trần Thị Dung- Trƣởng mơn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm tạo điều kiện cho em thực đề tài Ths Kim Yong Hwan anh chị phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Di Truyền, Đại Học Sungkyunkwan tận tình hƣớng dẫn, bảo em suốt thời gian em thực khóa luận Xin cảm ơn bạn lớp động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ bên thời điểm Thủ Đức, ngày 10 tháng 08 năm 2006 iii TĨM TẮT ĐẶNG QUỐC BẢO, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 ―NHÂN DỊNG GEN PRION (PrP) TỪ BÒ HANWOO (BOS TAURUS COREANAE) CỦA HÀN QUỐC‖ Giáo viên hƣớng dẫn GS TS KWON MOOSIK PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN BSE bệnh truyễn nhiễm prion, bệnh đƣợc quan tâm giới nghiên cứu Hiện nhà khoa học tiến hành nghiên cứu để tạo kit chẩn đoán sớm bệnh BSE, nghiên cứu tập trung nghiên cứu cấu trúc protein PrPsc, dạng protein gây bệnh prion Bƣớc đầu nghiên cứu protein PrPsc, tiến hành nhân dịng giải trình tự gen prion Tách chiết DNA từ máu bò Hanwoo PCR để khuếch đại gen prion Gen prion đƣợc khuếch đại có kích thƣớc 651 bp, sau đƣợc kết buộc vào véc tơ pGEMT easy chuyển vào vi khuẩn E coli DH5α Khuẩn lạc chứa véc tơ tái tổ hợp có màu trắng môi trƣờng LB chuyên biệt (Amp+, Xgal, IPTG) Plasmid thu đƣợc sau trình tinh đƣợc giải mã trình tự Kết giải trình tự thành cơng cho thấy giống gần nhƣ hồn tồn trình tự gen prion bị Hanwoo bị châu Âu Việc thành cơng q trình nhân dòng bƣớc đầu quan trọng cho mục tiêu cuối nghiên cứu tạo kit chẩn đoán bệnh BSE iv ABSTRACT Prion — short for proteinaceous infectious particle — is a unique type of infectious agent, as it is made only of protein Prion was termed in 1982 by Prusiner, who was prized Nobel for his research on prion Bovine spongiform encephalopathy (BSE) is one of the most notable prion diseases BSE is not only potential risk on bovine but also on human Until now Korea is free from BSE (Tae-Yung Kim et al,2005), but the BSE is high risk damage society The study on BSE is absolutelly remarkable As the first step of our prion study, we were attempted cloning full gene of prion encoding bovine prion protein from Korean bovine PrP gene was amplified from genome DNA (gDNA) of Korean bovine by PCR following primers forward and reverses primer The recombinant PrP of full sequence cDNA is 651bp long encoding 217 amino acids Amplified gene was then transmitted in to pGEM-T easy vector Subsequently, recombination vector was transformed into compentent cell E coli DH5α Recombinant plasmid of PrP was then further analyzed through sequencing v MỤC LỤC Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng xi Danh sách bảng hình ảnh x CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Prion 2.2 Bệnh não dạng xốp bị bệnh khác có ngun nhân pion 2.2.1 Bệnh não dạng xốp bò 2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân prion 2.3 Sự nhân dòng 2.3.1 Kỹ thuật PCR 2.3.2 Kỹ thuật điện di 2.3.3 Véc tơ plasmid 2.3.4 Sự kết buộc 2.3.5 Biến nạp vi khuẩn E coli 2.3.6 Chọn lọc vi khuẩn đƣợc biến nạp 2.3.7 Giải trình tự 2.3.7.1 Phƣơng pháp Sanger Coulson 2.3.7.2 Phƣơng pháp Maxam – Gilbert 2.3.7.3 Giải trình tự hệ thống tự động CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 10 3.2 Vật liệu 10 vi 3.3 Dụng cụ hoá chất 10 3.3.1 Dụng cụ 10 3.3.2 Hóa chất 10 3.3.3 Các dung dịch 11 3.4 Mồi PCR 11 3.5 Khuếch đại gen prion từ gen bò Hàn Quốc kỹ thuật PCR 11 3.6 Kỹ thuật điện di thạch agarose phân tách gen prion 12 3.6.1 Kiểm tra sản phẩm PCR 12 3.6.2 Thạch tinh DNA 12 3.7 Tách chiết tinh DNA 12 3.8 Sự kết buộc 13 3.9 Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli 13 3.10 Chuẩn bị plasmid 14 3.11 Giải trình tự 14 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 4.1 Kết 15 4.1.1 Khuếch đại gen prion kỹ thuật PCR 15 4.1.2 Tinh đoạn PCR từ sản phẩm PCR 16 4.1.3 Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy 17 4.1.4 Biến nạp vào vi khuẩn E coli 17 4.1.5 Giải trình tự sản phẩm 18 4.2 Thảo luận 18 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 20 5.1 Kết luận 20 5.2 Đề nghị 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 PHỤ LỤC 23 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp ampicillin BSE Bovine spongiform encephalopathy (Bệnh viêm não dạng xốp bò) bp base pair (cặp base) cDNA complementary deoxyribonucleic acid CJD Creutzfeldt-Jakob disease dNTP deoxynucleoside triphosphate DNA deoxyribonucleic acid E coli Escherichia coli EDTA ethylen diamine tetraacetic acid EtBr ethidium bromide g gram gDNA genome DNA (bộ gen) Kb kilobase LB Luria-Bertani-medium (môi trƣờng Luria-Bertani) M molar MBM meat and bone meal (bột xƣơng thịt) ml millilitre μl microlitre mM millimolar mRNA messenger ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia OIE The International Office for Epizootic Diseases Văn phòng quốc tế bệnh dịch PrP prion protein PrPc cellular prion protein PrPSc scrapie-associated prion protein Rpm round per minute (vòng/phút) viii TE Tris-HCl EDTA Tris Tris hydroxymethyl aminomethane TSE Transmissible Spongiform Encephalopathies UV ultraviolet V Volt vCJD variant Creutzfeldt-Jakob disease ix 15 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ 4.1.1 Khuếch đại gen prion kỹ thuật PCR Để khuếch đại đƣợc gen prion từ gen DNA bò Hanwoo, đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trình tự gen prion (GeneBank số NM_181015) Kết gradient PCR cho thấy phổ nhiệt độ ủ bắt cặp mồi rộng, nghiên cứu sử dụng nhiệt độ bắt cặp 58oC (Hình 4.1) Hình 4.1: Gradient PCR Băng M: Thang chuẩn DNA 1Kb , 1: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 55 oC, 2: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 60 oC, 3: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 59 oC, 4: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 60 oC, 5: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 61 oC, 6: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 62 oC, 7: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 63 oC, 8: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 64 oC Đoạn gen prion đƣợc khuếch đại thành cơng (Hình 4.2) Trọng lƣợng phân tử sản phẩm PCR vào khoảng 650 bp 16 Hình 4.2: Sản phẩm PCR gen prion M: Thang chuẩn DNA Kb; 1: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 58 oC 4.1.2 Tinh đoạn DNA từ sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc cho vào giếng thạch tinh có kết nhƣ Hình 4.3 Hình 4.3 : Thạch tinh DNA M: Thang chuẩn DNA Kb, 1: Sản phẩm PCR gen prion 650 bp 58 oC 17 Sau DNA đƣợc tinh kit QIAquick Gel Extraction DNA tinh khiết đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di với thạch agarose 0,8% (Hình 4.4), sản phẩm thu đƣợc sử dụng cho bƣớc Hình 4.4: Sản phẩm sau tinh M: Thang chuẩn DNA Kb, 1: Sản phẩm sau trình tinh sản phẩm PCR gen prion 4.1.3 Gắn đoạn DNA vào véc tơ pGEM-T easy Sau tinh đoạn PrP thành công, đoạn DNA đƣợc gắn vào véc tơ pGEM-T easy (Real Biotech Corp) 4.1.4 Biến nạp vào vi khuẩn E coli Véc tơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp thành công vào vi khuẩn E coli Sau q trình ni cấy thu hoạch khuẩn lạc, véc tơ tái tổ hợp đƣợc tinh từ vi khuẩn tinh plasmid Véc tơ pGEM-T easy có chứa gen prion đƣợc cắt EcoR I đƣợc ghi nhận hình 4.5 Theo ta thấy véc tơ tái tổ hợp bị enzyme EcoR I cắt vị trí tạo thành vạch thạch điện di Vạch Kbp véc tơ pGEM-T easy dạng thẳng, vạch thứ hai khoảng 650 bp gen prion 18 Hình 4.5: Véc tơ pGEM-T easy + gen prion đƣợc cắt EcoRI M: Thang chuẩn DNA Kb; 1: véc tơ pGEM-T easy 3,6 Kbp + gen prion không cắt; 2: véc tơ pGEM-T easy dạng thẳng Kbp gen prion 650 bp 4.1.5 Giải trình tự sản phẩm Kết giải trình tự đƣợc trình bày Hình B.4 Kết cho thấy trình tự base acid amin prion bị Hàn Quốc giống 99% trình tự prion giống bò châu Âu, khác hai cặp base 4.2 THẢO LUẬN Chúng thành công việc nhân dịng giải trình tự gen prion Trƣớc tiến hành giải trình tự chúng tơi cắt plasmid tái tổ hợp emzyme cắt EcoR I Kết cho thấy đoạn gen có kích thƣớc khoảng 650 bp kích thƣớc mong muốn Plasmid tái tổ hợp sau đƣợc gởi đến cơng ty Macrogen để giải trình tự Kết đƣợc trình bày Hình B.4 Theo kết ta thấy trình tự giống đến 99% có bp khác biệt vị trí 162 580 sau dịch mã sang acid amin ta thấy khơng có khác biệt, xem sai khác base không ảnh hƣởng đến gen prion khơng làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide quy định cấu trúc protein Theo sai khác xảy yếu tố khơng thể kiểm sốt đƣợc q trình thí nghiệm thực kỹ thuật nhƣ PCR, ligase, giải trình tự Điều nên đƣợc khảo sát kỹ thí 19 nghiệm sau Từ chúng tơi cho cấu trúc gen prion bị Hàn Quốc bị Châu Âu khơng khác Trên giới, việc nhân dòng prion phổ biến thành công hầu hết nghiên cứu Tuy nhiên chúng tơi thực nhân dịng số lý Trƣớc hết để làm nguyên liệu cho nghiên cứu sau Hơn nữa, việc nhân dòng giải trình tự thành cơng cịn cho thấy giống bò Hanwoo dòng bò khác, điều khẳng định khả lây nhiễm prion từ dịng khác cho bị Hanwoo hồn tồn xảy Việc nhân dịng thành cơng gen prion tạo sở nguyên liệu cho nghiên cứu xa cấu trúc protein Gen prion đƣợc chèn véc tơ pGEM-T easy tái tổ hợp đƣợc trữ lạnh -80oC Trong trình nghiên cứu, plasmid tái tổ hợp đƣợc sử dụng nhƣ nguồn gen nguyên liệu thay phải trực tiếp tiến hành PCR để thu đƣợc đoạn gen mong muốn 20 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực hiện, thành công việc nhân dịng gen prion Gen prion có 651 bp mã hố 217 acid amin Trình tự gen prion bò Hawoo Hàn Quốc giống với giống bò khác châu Âu Véc tơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α thành công đƣợc giữ lạnh -80oC 5.2 Đề nghị - Thực lại q trình nhân dịng để kiểm tra kỹ khác biệt trình tự gen prion bị Hanwoo Hàn Quốc bò châu Âu - Trữ giống cấy chuyển sau thời gian trữ lạnh để đảm bảo hoạt lực vi khuẩn - Dùng sản phẩm tiếp tục nghiên cứu sâu protein 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Bá Sửu 2004; Từ điển giải thích thuật ngữ Cơng nghệ sinh học lương thực nông nghiệp; Nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật, 304 trang Nguyễn Ngọc Tuân 2002; Vệ sinh thịt; Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 163-200 TIẾNG ANH Anderson R M., Donnelly C A., Ferguson N M., Woolhouse M E J., Watt C J., Udy H J., MaWhinney S., Dunstan S P., Southwood T R E., Wilesmith J W., et al., 1996; Transmission dynamics and epidemiology of BSE in British cattle; Nature (London) 382: 779–788 Brown T A., 2005; Gene cloning and DNA analysis; 4th edition; Blackwell Pusblishing; p: 123-210 Corsaro A., Thellung S., Russo C., Villa V., Arena S., D'Adamo MC., Paludi D., Rossi Principe D., Damonte G., Benatti U., Aceto A., Tagliavini F., Schettini G., Florio T., 2002; Expression in E coli and purification of recombinant fragments of wild type and mutant human prion protein; Neurochem Int., 41(1):55-63 Chesebro B., Race R., Wehrly K., Nishio J., Bloom M.,Lechner D., Bergstrom S., Robbins K., Mayer L., Keith J M., et al., 1985; Identification of scrapie prion protein-specific mRNA in scrapie-infected and uninfected brain Nature (London) 315: 331–333 Diedrich J F., Carp R I & Haase A T., 1993; Increased expression of heat shock protein, transferrin, and beta 2-microglobulin in astrocytes during scrapie; Microb Pathog.15: 1–6 Kang San-Gyun, Sung Keun Kang, Deog-Yong Lee, Yong-Ho Pack, Woo-Suk Hwan, and Han-Sang Yoo; 2004; Cloning, sequencing, and expression for DNA encoding bovine prion protein; J.Microbiol Biotechnol 14(2): 417-421 Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell, 2000; Molercular cell biology; 4th edition; Freeman Publishing; p: 375-377; 580-612 Nathanson N., Wilesmith J & Griot C., 1997; A new variant of Creutzfeld-Jakob disease; Am J Epidemiol 145: 959–969 22 Pan K.-M., Baldwin, M., Nguyen J., Gasset M., Serban A.,Groth D., Mehlhorn I., Huang Z., Fletterick R J., Cohen F E & Prusiner, S B., 1993; Conversion of alphahelices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins Proc Natl Acad Sci USA 90, 10962–10966 Pergami P., Jaffe H & Safar J., 1996; Semipreparative chromatographic method to purify the normal cellular isoform of the prion protein in nondenatured form; Anal Biochem 236: 63–73 Prusiner S B 1982; Novel Proteinaceous Infectious Particles Cause Scrapie; Sciene; 216: 136–144 Prusiner, 1998; Prion; Pro Nalt Acad Sci USA Vol 95: 13363-13383 Prusiner, 2004; Prion biology and diseases 2nd Ed, CSHL press: 1-87 Prusiner, 1991; Molecular biology of prion diseases Science 252: 1515–1522 Sambrook J G., Russell R., et al., 2002; Fugu orthologues of human major histocompatibility complex genes: a genome survey; Immunogenetics 54(6): 36780 Sandy Primrose, Sandy Primrose, Richard Twyman and Bob Old, 2004; Principle of Gene Manipulation; 4th edition; Blackwell Pusblishing; p: 319 Kim T Y., Kim Y S., Kim J K., Shon H J., Lee Y H., Kang C B., Park J S., Kang K S and Lee Y S., 2005; Rist analysis of BSE in Korea; J.Vet Med Sin 67(8): 743752 Wilesmith J W., Ryan J B M & Atkinson M J.; 1991; Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies on the origin; Vet.Rec 128: 199–203 23 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Bảng A.1 Các bệnh prion Bệnh Vật chủ Kuru iCJD vCJD fCJD GSS FFI Ngƣời tiền sử Ngƣời Ngƣời Ngƣời Ngƣời Ngƣời sCJD Ngƣời FSI Ngƣời Scrapie BSE TME CWD FSE Cừu Bò Chồn La, hƣơu,nai Mèo Exotic ungulate Encephalopathy Greater kudu, nyala, oryx Cơ chế gây bệnh Lây nhiễm tục lệ ăn thịt ngƣời Lây nhiễm prion Lây nhiễm prion từ bò? Đột biến giai đoạn phôi gen prion Đột biến giai đoạn phôi gen prion Đột biến giai đoạn phôi gen prion (D178N, M129) Đột biến tế bào sinh dƣỡng chuyển đổi cấu trúc PrPc thành PrPSc? Đột biến tế bào sinh dƣỡng chuyển đổi cấu trúc PrPc thành PrPSc? Thƣờng gây bệnh di truyền cừu Lây nhiễm prion có MBM Lây nhiễm prion từ bị cừu Khơng rõ Lây nhiễm prion có mơ bị MBM Cảm nhiễm prion gây bệnh từ MBM iCJD, iatrogenic CJD; vCJD, variant CJD; fCJD, familial CJD; sCJD, sporadic CJD; GSS, GerstmannStraăusslerSheinker disease; FFI, fatal familial insomnia; FSI, fatal sporadic insomnia; BSE, bovine spongiform encephalopathy; TME, transmissible mink encephalopathy; CWD, chronic wasting disease; FSE, feline spongiform encephalopathy; HGH, human growth hormone; MBM, meat and bone meal 24 PHỤ LỤC B A B Hình B.1: Cấu trúc protein PrP vị trí đoạn mồi gen prion A: Cấu trúc polypeptide PrP, protein PrPc PrPsc; B: vị trí đoạn mồi gen prion Bo-F : 5’- aag aag cga cca aaa cct gga gga – 3’ K K R P K P G G Bo-R : 5’ - tgc ccc tcg ttg gta ata agc ctg – 3’ Q A Y Y Q R G A Hình B.2: Các đoạn mồi đƣợc thiết kế cho dịng hố 25 Hình B.3: Bản đồ gen vị trí cắt véc tơ pGEM-T easy Hình B.4: Phân tích trình tự gen prion bị Hanwoo dịng bị châu Âu Ori : Bò châu Âu, 58: Gen prion bò Hanwoo, PCR 58oC; 64: Gen prion bò Hanwoo, PCR 64oC consensus: so sánh trình tự 26 27 PHỤ LỤC C C.I Qui trình C.I: QIAquick Kit ly trích DNA từ thạch agarose Cắt đoạn DNA từ thạch agarose với dao bén Chú ý cắt nhỏ tốt cho khơng dính phần agarose khơng cần thiết Bỏ vào tube cân miếng thạch vừa đƣợc cắt Thêm đơn vị dung dịch đệm QG vào đơn vị thạch (100 mg = 100 µl) Ví dụ: Thêm thêm 300 µl dung dịch đệm QG vào 100 µl thạch Ủ 500C vòng 10 phút thạch tan hoàn toàn Để tăng khả tan thạch, vortex - phút suốt trình ủ Sau trình ủ, thạch phải tan hồn tồn có màu vàng nhạt (cùng màu với dung dịch đệm QG chƣa có thạch) Thêm đơn vị isopropanol vào mẫu trộn Ví dụ: mẫu thạch agarose có khối lƣợng 100 mg, thêm 100 µl isopropanol Bƣớc ảnh hƣởng lên DNA có chiều dài dƣới 500 bp Kbp, mẫu nằm hai độ dài ảnh hƣởng khơng đáng kể Cần ý khơng ly tâm suốt q trình Đặt cột quay QIAquick vào tube thu DNA ml Để thu nhận DNA, cho mẫu vào cột quay thực ly tâm 12000 vòng/phút (rpm) phút Tối đa cho 800 µl vào cột quay, mẫu nhiều phải ly tâm thêm lần Bỏ phần dung dịch đặt cột quay QIAquick trở lại tube thu DNA (Không bắt buộc) thêm 0,5 ml dung dịch đệm QG vào cột quay ly tâm 12000 rpm phút Bƣớc loại bỏ tất agarose Bƣớc bắt buộc DNA đƣợc sử dụng trực tiếp cho việc giải trình tự, dịch mã in vitro vi tiêm 10 Để rửa isopropanol, thêm 0,75 ml dung dịch đệm PE vào cột quay QIAquick ly tâm 12000 rpm phút Chú ý: Nếu DNA đƣợc sử dụng cho ứng dụng nhạy với muối, nhƣ kết buộc với đầu giải trình tự trực tiếp, để yên cột vòng 2-5 phút thêm dung dịch đệm PE trƣớc ly tâm 28 11 Đổ bỏ phần dịch ly tâm cột QIAquick thêm phút tốc độ 10000 rpm Chú ý: ethanol dung dịch đệm PE khơng đƣợc loại bỏ hồn tồn không đổ bỏ phần dịch trƣớc ly tâm 12 Đặt cột QIAquick vào tube 1,5ml 13 Để hồ tan DNA, thêm 20 µl dung dịch đệm EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) nƣớc vào màng QIAquick ly tâm phút tốc độ tối đa Để tăng nồng độ DNA, thêm 30 µl dung dịch hoà tan vào màng QIAquick để yên khoảng phút trƣớc tiến hành ly tâm Chú ý: chắn dung dịch hoà tan đƣợc cho vào trực tiếp lên màng cột QIAquick để DNA bám vào Trung bình lƣợng hồ tan thu đƣợc 48 µl từ 50 µl dung dịch hồ tan 28 µl từ 30 µl Hiệu trình tinh phụ thuộc vào pH Quá trình hoạt động tốt pH từ 7,0 đến 8,5 Khi sử dụng nƣớc, đảm bảo pH phải đƣợc ổn định, không nên trữ lạnh -20oC làm thái hố DNA khơng có số tác nhân dung dịch đệm DNA tinh khiết hồ tan TE (10 mM Tris-Cl; mM EDTA, pH 8,0) nhiên EDTA làm hoạt tính phản ứng enzyme 29 C.II Qui trình C.II: Chuẩn bị plasmid (Phƣơng pháp kiềm) Chuyển khuẩn lạc vào ml môi trƣờng LB có chứa chất kháng sinh thích hợp Ủ mẫu để nuôi cấy 37oC qua đêm máy ủ lắc Cho 1,5 ml dịch nuôi cấy vào tube Ly tâm 12000 rpm 30 giây 4oC Loại bỏ phần nổi, làm khô phần tủa khô tốt Cho vào phần tủa 100 µl dung dịch đƣợc giữ lạnh vortex mạnh Thêm 200 µl dung dịch vừa đƣợc chuẩn bị Trộn hỗn hợp cách đảo nhanh tube lần Thêm 150µl dung dịch đƣợc giữ lạnh Trộn hỗn hợp cách đảo nhanh tube lần Để tube vòng 3-5 phút Ly tâm 12000 rpm 15 phút 4oC Chuyển phần dịch sang tube Kết tủa DNA phần EtOH, vortex Bỏ hỗn hợp vào trữ lạnh -20oC 20 phút Ly tâm 12000 rpm 15 phút 4oC 10 Nhẹ nhàng loại bỏ phần dịch nổi, để yên tube, mở nắp đậy giấy thấm tube khơ hồn tồn 11 Rửa DNA với 1ml EtOH 4oC Loại bỏ phần dịch nhƣ bƣớc 10, để phẩn kết tủa khơng khí khơng cịn mùi cồn (thƣờng 10 phút) 12 Hồ tan DNA với 50µl TE nƣớc cất, vortex Dung dịch 50 mM đƣờng glucose 25 mM Tris-Cl (pH 8,0) 10 mM EDTA (pH 8,0) Dung dịch 0,2N NaOH 1% SDS Dung dịch 5M potassium acetate 60 ml glacial acetic acid H2 O 11,5 ml 28,5 ml ... TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NHÂN DÕNG GEN PRION (PrP) TỪ GIỐNG BÕ HANWOO (Bos Taurus Coreanae) CỦA HÀN QUỐC LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:... 5 2.3 Sự nhân dịng Khố luận bƣớc đầu q trình nghiên cứu nhóm nghiên cứu Hàn Quốc với mục tiêu thực nhân dòng giải mã đoạn gen prion giống bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) Hàn Quốc Gen prion đƣợc... dạng protein gây bệnh prion Bƣớc đầu nghiên cứu protein PrPsc, tiến hành nhân dịng giải trình tự gen prion Tách chiết DNA từ máu bò Hanwoo PCR để khuếch đại gen prion Gen prion đƣợc khuếch đại