BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Tiểu luận: NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT BỘ MÔN: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT GVHD : TS. PHẠM THỊ LƯƠNG HẰNG Tp. Hà Nội, năm 2009 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Hoa mười giờ Portulaca granflora nở hoa trong ống nghiệm 06 Hình 2. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 07 Hình 3. Nuôi cấy phôi 08 Hình 4. Nuôi cấy mô 09 Hình 5. Mô phân sinh dinh dưỡng đang hoạt động của cây Tím Phi 09 Hình 6. Nuôi cấy bao phấn ở cây lúa 10 Hình 7. Sự nuôi cấy chuối bom (Musa acuminata) từ protoplast 11 Hình 8. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 13 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 121 0 C (Burgerr, 1988) 19 Bảng 2. Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất diệt khuẩn xử lí mô cấy thực vật 20 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ rất lâu, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp. Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng, gọi là giâm cành, chiết cành… Hay chắp nối những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành. Cùng một lúc chúng ta có thể nhân giống cây lên hàng loạt mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn. Bên cạnh đó người ta lại có một công nghệ hiện đại hơn, gọi là công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt. Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. 4 PHẦN I TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 5 1.1 Khái niệm Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Hình 1. Hoa mười giờ Portulaca granflora nở hoa trong ống nghiệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng vào sự phân hóa và sự phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Tính toàn năng của tế bào: Tế bào bất kỳ nào của cơ thể sinh vật đa bào nào cũng đều có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Đó là tính toàn năng của tế bào (Theo Gottlied Haberlandt trong cuốn ‟Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” ). Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào: Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô cơ quan khác nhau. Đó là sự phân hóa. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hóa tế bào. 6 1.2 Sơ lược các kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào Hình 2. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (A) Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B) Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum. 1.2.1 Nuôi cấy phôi Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy 7 thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom. Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng. Hình 3. Nuôi cấy phôi Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA 3 , auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi. Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. 1.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Lon và Ball (1946) với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn. Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng ( nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn, Co,Zn, ). Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B 1 , B 6 , B 3 , ) và các chất điều hoà sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới. 8 Hình 4. Nuôi cấy mô Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khử năng tổng hợp các chất này. 1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm ÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Hình 5. Mô phân sinh dinh dưỡng đang hoạt động của cây Tím Phi 3 tháng tuổi và Nụ hoa Tím Phi được nuôi cấy từ gốc cánh hoa (nách lá đài) sau 45 ngày trên môi trường MS với BA 1mg/l, IAA 0,1mg/l. Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA, Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. 9 1.2.4 Nuôi cấy bao phấn Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono (1968) trên lúa. Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan. Hình 6. Nuôi cấy bao phấn ở cây lúa 1.2.5Nuôi cấy tế bào đơn Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX. Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym. Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào. 1.2.6 Nuôi cấy protoplast Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960). Ông là người đầu tiên dùng enzym để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 10 [...]... http://www.scq.ubc.ca/your-guide-to-plant-cell-culture/ 7 http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S071858392009000100014&lng=pt&nrm=i&tlng=en 31 MỤC LỤC ĐẶ VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1 Khái niệm 1.2 Sơ lược các kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.2.1 Nuôi cấy phôi 1.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời 1.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh 1.2.4 Nuôi cấy bao phấn 1.2.5 Nuôi cấy tế bào. .. của tế bào Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sang cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine,... cấy Không đưa vào tủ cấy các bình cấy đã bị nhiễm vì bào tử có thể phát tán trong tủ cấy 2.4 Môi trường Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài 20 và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo... bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6- - -dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino )-1 -Hpurine-6-amine (kinetin), và 6-( 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các... - Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…) - Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…) 2.4.1 Các muối khoáng Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật: - Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P ) cho sự tổng hợp... 1.2.6 Nuôi cấy protoplast 1.3 Những mối đe dọa đối với đa dạng sinh học PHẦN II KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO 2.1 Nguyên liệu 2.2 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào 2.2.1 Các thiết bị, dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô 2.2.2 Các thủ tục cơ bản trong phòng thí nghiệm 2.3 Đảm bảo điều kiện vô trùng 2.3.1 Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật 2.3.2 Khử trùng 2.4 Môi trường... truyền - Tủ hút, tủ ấm - Cân các loại - Máy cắt tiêu bản - Máy đo pH - Ly tâm lạnh - Máy điện di, máy soi AND - Máy PCR,máy sắc kí,quang phổ - Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu - Lò vi sóng - Pipet tự động các loại - Máy soi và chụp ảnh gel - Các tủ đựng hóa chất, tủ hút khí độc * Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: có 3 nhân tố chính: - Đảm bảo điều kiện vô trùng - Chọn đúng môi... vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi Thông thường một chu kì nuôi cấy mô và tế bào thực vật dài từ 1-5 tháng, trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một vài ngày... của môi trường nuôi cấy, đặc điểm di truyền của loài cây, trạng thái sinh lý của cây cho mẫu và đôi khi chịu ảnh hưởng của các mùa trong năm 2.2 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào 2.2.1 Các thiết bị, dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thường bao gồm: - Phòng rửa dụng cụ - Phòng chuẩn bị môi trường, hấp tiệt trùng và chứa dụng cụ - Phòng cấy. .. thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,… Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát . VẬT 5 1.1 Khái niệm Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân. phản phân hóa tế bào. 6 1.2 Sơ lược các kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào Hình 2. Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (A) Mô sẹo từ Catharanthus