Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 3 PHẦN II: NỘI DUNG 4 I. CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN 4 1. Enzyme cắt giới hạn 4 2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn 4 3. Tính chất của enzyme giới hạn 5 3.1 Trình tự nhận biết của RE 5 3.2 Các kiểu cắt của RE 7 4. Danh pháp 10 5. Phân loại enzyme giới hạn 11 5.1. Enzyme loại I 12 5.2. Enzyme loại III 13 5.3. Enzyme loại II 14 6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả cắt của RE 16 6.1. Độ tinh sạch của DNA 16 6.2. Mức độ methyl hóa của DNA 16 6.3. Đặc tính methyl hóa của RE 18 7. Ứng dụng của RE 18 II. CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI 19 1. Enzyme polymerase 19 1.1 DNA polymerase 19 1.2. RNA polymerase 26 2. Enzyme gây biến đổi đầu cuối DNA 29 2.1. T4 polynucleotide kinase 29 2.2. Alkaline phosphatase 30 3. Nuclease 31 3.1. DNase I (Deoxyribonuclease I) 31 3.2. Exo III (Exonuclease III ): 32 3.3. RNase A ( Enzyme Ribonuclease A): 32 3.4. RNase H: 33 3.5. RNase T1 (Enzyme ribonuclease T1) 33 3.6. Enzyme nuclease S1 34 III. CÁC ENZYME NỐI (LIGASE) 35 1. DNA ligase 35 1.1. T4 DNA ligase 36 1.2. E.coli DNA ligase 36 Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 1 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc 2. 37 3939393939393939393939393939393939T4 RNA ligase 37 PHẦN III: KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 2 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc PHẦN I: MỞ ĐẦU Sinh học phân tử không chỉ là một lĩnh vực mới mà còn trở nên cần thiết trong bất cứ chuyên ngành nào của sinh vật học. Quá trình nghiên cứu Sinh học phân tử đã diễn ra trong một thời gian dài và người ta đã ứng dụng được những thành tựu của chúng vào các lĩnh vực khác nhau để mang lại những lợi ích nhất định trong đời sống cũng như trong sản xuất. Công nghệ DNA tái tổ hợp được ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng đối với sự phát triển của sinh học cũng như cải tạo sinh giới. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác định. Enzyme là công cụ cơ bản trong kỹ thuật tạo dòng phân tử. Sinh học phân tử đã phát hiện và hiểu rõ cơ chế tác động của hàng loạt enzyme, nhờ đó đã sử dụng chúng như những công cụ hữu hiệu trong việc cắt nối và ghép các gen. Trong tạo dòng phân tử có sự tham gia của các enzyme: enzyme nuclease, DNA-polymerase, ligase và restriction endonuclease. Để hiểu thêm về các enzyme tạo dòng nên tôi đã chọn đề tài "CÁC ENZYME ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG PHÂN TỬ " Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 3 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc PHẦN II: NỘI DUNG I. CÁC ENZYME CẮT GIỚI HẠN 1. Enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù. Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn đó bị phagơ phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phagơ lại không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzyme có khả năng cắt DNA phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại enzyme này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại enzyme có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của các DNA lạ. Những enzyme đó được gọi là enzyme giới hạn. 2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi khuẩn E. coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được đưa vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số ít trường hợp DNA lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bản trong tế bào chủ. Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đó dưới sự kiếm soát của tế bào chủ. Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếu khi các thể thực khuẩn (phage) xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn. Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 4 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắt giới hạn. Chúng đều có đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau. Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ 259 bằng cách gắn thêm nhóm methyl (-CH 3 ) ở một số base nhất định trong đoạn nhận biết (recognition sequence) hay đoạn đích (target sequence). Hiện tượng methyl hoá (methylation) này thường xảy ra đối với adenine và biến đổi nó thành N-6 methyladenine. Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc thù chừng nào nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giới hạn đóng vai trò là hàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhập của các phage lạ. 3. Tính chất của enzyme giới hạn 3.1 Trình tự nhận biết của RE Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vị trí xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại: 260 loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biết và loại II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Ở đây chúng ta chỉ xét các enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng (giống như con dao mổ tinh vi) cho phép thao tác trên các gene trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận. Trong tự nhiên các enzyme hạn chế, hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 5 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không được nhận biết bởi các enzyme hạn chế. Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc biệt, đã giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, do nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn. Hiện nay, các enzyme hạn chế được phân lập từ các sinh vật prokaryote. Mỗi enzyme hạn chế chỉ nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide. Ví dụ enzyme EcoRI tách chiết từ E. coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt trình tự TGGCCA. Có hơn 900 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 chủng vi sinh vật. Đoạn nhận biết thường dài từ 4-6 cặp nu, thường có cấu trúc cân đối bộ đôi (có nghĩa là trình tự nu hướng 5’-3’ của sợi đơn này giống với trình tự nu hướng 5’-3’ của sợi bổ sung kia, một số ít có khả năng cắt lệch trên 2 sợi đơn. Hai enzyme Not I và SfiI nhận biết một đoạn dài 8 cặp nu, đoạn này ít tìm thấy trong DNA genome nên thường được dùng để cắt DNA nhằm tạo thành các đoạn lớn DNA. Bảng 1. Trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế STT Tên enzyme Vị trí nhận biết Đầu được tạo ra 1 EcoRI 5’…G↓AATTC…3’ 3’…CTTAA↑G…5’ 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAA G…5’ 2 HindIII 5’…A↓AGCTT…3’ 3’…TTCGA↑A…5’ 5’…A AGCTT…3’ 3’…TTCGA A…5’ 3 PstI 5’…CTGCA↓G…3’ 3’…G↑ACGTC…5’ 5’…CTGCA G…3’ 3’…G ACGTC…5’ 4 HpaI 5’…GTT↓AAC…3’ 3’…CAA↑TTG…5’ 5’…GTT AAC…3’ 3’…CAA TTG…5’ 5 HpaII 5’…C↓CGG…3’ 3’…GGC↑C…5’ 5’…C CGG…3’ 3’…GGC C…5’ 6 HaeIII 5’…GG↓CC…3’ 5’…GG CC…3’ Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 6 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc 3’…CC↑GG…5’ 3’…CC GG…5’ 7 BamHI 5’…GGATCC…3’ 3’…CCAT↑GG…5’ 5’…G GATCC…3’ 3’…CCAT GG…5’ 8 BglII 5’…A↓GATCT…3’ 3’…TCTAG↑A…5’ 5’…A GATCT…3’ 3’…TCTAG A…5’ 9 SmaI 5’…CCC↓GGG…3’ 3’…GGG↑CCC…5’ 5’…CCC GGG…3’ 3’…GGG CCC…5’ 10 XmaI 5’…C↓CCGGG…3’ 3’…GGGCC↑C…5’ 5’…C CCGGG…3’ 3’…GGGCC C…3’ Một số enzyme có thể cắt tốt ở trình tự này nhưng lại cắt ít hữu hiệu ở trình tự khác. Thí dụ enzyme EcoRI cắt ở nơi có trình tự AATT không tốt bằng ở những nơi có trình tự GAATTC. 3.2 Các kiểu cắt của RE Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại. Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai đầu lệch nhau một vài base. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị bắt cặp trở lại. Như vậy, khi các DNA khác nguồn nhưng cùng có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu của một RE, sau khi bị cắt sẽ có các đầu dính bổ sung giống nhau nên các đoạn DNA khác nguồn có thể nối lại để tạo ra những phân tử lai. Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền. Vị trí cắt tại liên kết phosphodiester nối giữa các đường deoxyribose của các nucleotide tạo thành các đoạn có 2 đầu xác định 5’P, 3’OH và có trình tự tương ứng với mỗi enzyme RE. Các enzyme hạn chế cắt các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau (Hình 1). Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 7 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc Hình 1. Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế. (a) tạo ra đầu so le, và (b) tạo ra đầu bằng. Một số enzyme hạn chế khác (ví dụ: BalI) cắt ở trục đối xứng để tạo ra các đoạn DNA mang đầu bằng (blunt) Cũng có trường hợp 2 hoặc nhiều enzyme nhận biết trình tự giống nhau, nhưng khi cắt sinh ra các đoạn DNA không nhất thiết lúc nào trình tự tận cùng cũng giống nhau. Nhiều enzyme có trình tự nhận biết khác nhau nhưng khi cắt lại có thể tạo ra những đầu tương hợp. Các đoạn này kết gắn với nhau bằng enzyme ligase sẽ tạo ra phân tử DNA lai. Giống như EcoRI, nhiều enzyme hạn chế đã tạo ra các đoạn DNA với đầu 5’ dính (protruding). Một số enzyme hạn chế (ví dụ: PstI) đã tạo ra các đoạn DNA có đầu 3’ lồi.Ví dụ: * Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự Eco RI cắt 5' G-A-A-T-T-C 3' 5' G 5' A-A-T-T-C 3' 3' C-T-T-A-A-G 5' 3' G-T-T-A-A 5' G 5' Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 8 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc Bảng 2: Các enzyme endonuclease hạn chế và những đoạn cắt của chúng Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn Bam III G G A T C C C C T A G G Bacillus amylolique faciens H Bgl II A G A T C T T C T A G A Bacillus globigi Hind III A A G C T T T T C G A A Haemophilus influenzeae R d Eco RII C C T G G G G A C C Escherichia coli R245 Hpa I G T T A A C C A A T T G Haemophilus parainfluenzea Hha I G C G C C G C G Haemophilus haemolyticus Taq I T C G A A G C T Thermus aquaticus YTI Vì một enzyme hạn chế chỉ nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 9 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS. Nguyễn Bá Lộc hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA. 4. Danh pháp Nguồn gốc enzyme là từ vi khuẩn vì vậy tên enzyme sẽ dựa trên tên của chủng vi khuẩn chứa nó. Theo quy tắc, các enzyme có tên gọi gồm có 3 chữ thuộc tên chủng vi khuẩn gốc; Chữ cái đầu (viết hoa) là chữ đầu của tên giống của vi khuẩn từ đó enzyme được trích li và 2 chữ tiếp theo là thuộc tên loài. 3 chữ này có thể thêm vài ký hiệu chỉ định để phân biệt 2 chủng cùng loài. Có số la mã tiếp theo để phân biệt các enzyme giới hạn khác nhau mà có nguồn gốc cùng một chủng vi khuẩn. Ví dụ 1. EcoRI: 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' - E: Giống Escherichia - Co: Loài Coli - R: Chủng RY13 - I: Enzyme được tách lần đầu tiên Một số ví dụ tương tự: PstI là enzyme giới hạn được tách từ Providencia stuartii; Fnu DI, Fnu Dn và Fnu DHI, là 3 enzyme xuất phát từ Fusobacterium nucleatum chủng D; Bst DI021 thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus chủng D102; Một số loại khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, … Học viên: Trần Thị Hải Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh Học K22 10 [...]... không được lai trên phân tử này - Ứng dụng: + Định vị các đầu 5’ và 3’ của các mRNA bằng cách phân tích tính kháng lại enzyme S1 của phân tử DNA :mRNA lai kết hợp sử lý enzyme nuclease S1 rồi chạy điện di và phân tích chiều vệt băng + Định vị vị trí các intron bằng cách phân rã phân tử lai giữa mRNA chín với DNA của genome đã được đánh dấu bằng P32 phóng xạ S1 sẽ cắt tại những vị trí thòng lọng không được. .. hoặc dòng thực khuẩn thể Bản đồ cắt giới hạn là vị trí cắt của mỗi RE trên phân tử DNA, nhóm liên kết hay cả bộ genome - Phân cắt tạo ra các đoạn nhỏ từ DNA genome trước khi phân tách bằng điện di và tiến hành lai DNA, dùng trong phương pháp RFLP - Tạo ra các đoạn để nhân dòng trong vector thích hợp - Tạo ra các đoạn DNA mẫu dò để đánh dấu, sử dụng trong phương pháp lai DNA II CÁC ENZYME BIẾN ĐỔI 1 Enzyme. .. phức tạp của enzyme Enzyme loại I là đa khả năng, mang cả hai chức năng giới hạn và sửa đổi trong khi enzyme lọai II chỉ mang một trong hai khả năng giới hạn hoặc sửa đổi Sau này, các enzyme phức tạp được chia ra thêm loại III Đặc điểm của 3 loại enzyme này được tóm tắt trên Bảng 3 Các enzyme giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III tuy nhiên các enzyme giới hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ... vector xẩy ra Trong kỹ thuật tạo dòng, khi vector được mở ra bằng một RE rồi được loại ngay nhóm 5’ phosphate thì sẽ không thể tự nối lại được Chỉ khi có DNA khác có mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được nhân dòng vào thì phản ứng gắn nối giữa DNA đó với vector mới xảy ra 3 Nuclease Các enzyme nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit... RNA ligase là 2 enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi Có một số loại enzyme nối khác nhau, nhưng enzyme T4 DNA ligase là enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật tạo dòng 1 DNA ligase Là enzyme xúc tác việc hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 3’OH đầu này với đầu 5’-P của nu đầu kia của 2 chuỗi DNA kép DNA ligase còn có chức năng sửa chữa những khía cắt một mạch trong sợi kép... Enzyme này thường được dùng để loại bỏ các đoạn RNA sau phản ứng phiên mã ngược, để tiếp tục tổng hợp mạch thứ 2 cho cDNA thành một DNA mạch đôi, hoặc dùng để loại bỏ một cách có chọn lọc những phần của một phân tử RNA lai được với trình tự đặc thù của DNA genome - Ứng dụng + Dùng để loại bỏ RNA trong phân tử lai DNA: RNA để tổng hợp sợi cDNA + Tạo ra vết cắt đặc thù trên phân tử RNA bằng cách sử dụng. .. phân tử DNA thứ nhất, đó là enzyme terminal transferase Enzyme này sau đó lại sử dụng để đính poly T vào phân tử DNA thứ 2 Sau đó 2 phân tử DNA được kết gắn với nhau qua 2 đầu bổ sung sẽ đính kết lại (ligation) rồi được nhân dòng Học viên: Trần Thị Hải Học K22 Lớp: LL&PPDH Bộ Môn Sinh 19 Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS Nguyễn Bá Lộc lên, quá trình này sử dụng trong tạo vector tái tổ hợp từ... là các nuclease cắt ở một vị trí đặc hiệu nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu), nên còn được gọi là enzyme endonuclease Vì enzyme loại I và III chiếm tỷ lệ ít và không được sử dụng nhiều, các nét chính enzyme này sẽ được giới thiệu trước tiên Enzyme loại II sẽ được trình bày sau cùng một cách chi tiết hơn Bảng 3: Những đặc điểm của enzyme giới hạn của ba loại hệ thống giới hạn-sửa...Tiểu luận Sinh học phân tử GVHD: PGS -TS Nguyễn Bá Lộc 5 Phân loại enzyme giới hạn Enzyme giới hạn nằm trong một hệ thống bao gồm cả enzyme sửa đổi, nó không thể nào tồn tại một mình được Những chủng vi khuẩn, nếu hệ thống giới hạn sửa đổi có một enzyme sửa đổi không hoạt động được vì lý do nào đấy, thì chủng đó không thể nào sống nổi Lý do chỉ vì DNA không được sửa đổi sẽ bị enzyme giới hạn tương... Từ khi hệ thống enzyme giới hạn-sửa đổi B và K của Escherichia coli được xác định tới nay đã có hơn 2500 hệ thống khác được phát hiện .Trong đó có gần 200 trình tự đặc hiệu hoàn toàn khác nhau được enzyme nhận ra Tất cả enzyme này được phân loại khác nhau tuỳ theo thành phần phân tử, điều kiện cần thiết để hoạt động, kiểu trình tự nucleotit nhận ra và vị trí cắt Lúc ban đầu, enzyme được phân chia ra loại