TUYN CHN CHNG Bacillus A HOT TNH TRONG SN XUT PHN BểN VI SINH VT CHC NNG CHO CY KHOAI TY o Vn Thụng, Nguyn Thu H, Phm Vn Ton, Phm Thu Thy SUMMARY Selection of bacillus has multi bioactivity using production functional biofertilizer for potato Selection Bacillus has multi bioactivity will play an important role in the production and application of functional biofertilizer. This paper showed that Bacillus B16 was selected. It can be antagonize bacterial wilt caused by Ralstonia solanacerum and produce plant growth promoting substance (IAA). By colony characteristic, cell morphology, and sequencing of DNA fragment of 16S rRNA gene the B16 strain was determined as Bacillus subtilis. According to European Community, species are selected have high biosafety and they are permission to apply in common. The Bacillus subtilis B16 will be continuous research to apply for production of functional biofertilizer. Keywords: Bacillus subtilis, Ralstonia solanacerum, bacterial wilt, antagonize, potato. I. ĐặT VấN Đề Khoai tõy l cõy lng thc, cõy thc phNm cú giỏ tr. nhiu nc thuc chõu u, chõu M, khoai tõy c coi l mt loi lng thc chớnh sau lỳa mỡ, ngụ. Din tớch trng khoai tõy Vit Nam cú khong 35.000 - 37.000 ha v sn lng t 420.000 - 450.000 tn. Mt trong nhng nguyờn nhõn lm gim nng sut, cht lng khoai tõy l bnh hộo xanh do vi khuNn Ralstonia solanacearum gõy nờn. Tuy nhiờn, cho n nay cha cú bin phỏp hu hiu no cú th ngn chn v phũng tr bnh ny. Nghiờn cu trc õy cho thy nhiu loi thuc chi Bacillus cú nhiu hot tớnh sinh hc nh c ch vi sinh vt gõy bnh v sinh tng hp hot cht kớch thớch sinh trng thc vt. Bi bỏo trỡnh by kt qu nghiờn cu tuyn chn chng vi khuNn Bacillus sn xut phõn bún sinh hc cho khoai tõy cú kh nng hn ch bnh hộo xanh vi khuNn II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu - Chng vi sinh vt: Gm 15 chng Bacillus v 01 chng Ralstonia solanacearum (gõy bnh hộo xanh cõy khoai tõy, ký hiu VKHX) do Qu gen Vi sinh vt trng trt - Vin Th nhng Nụng hoỏ cung cp. - Ging khoai tõy: Ging khoai tõy Solana, l ging mn cm vi bnh hộo xanh vi khuNn do Trung tõm nghiờn cu cõy cú c - Vin Cõy lng thc v Cõy thc phNm cung cp. 2. Phng phỏp nghiờn cu - Xỏc nh c im hỡnh thỏi khuNn lc, t bo ca chng vi sinh vt bng cỏc phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc thụng dng. - Xỏc nh mt vi sinh vt theo phng phỏp nuụi cy trờn mụi trng thch a theo TCVN 4884 - 2005. - Xỏc nh kh nng c ch vi khuNn gõy bnh hộo xanh bng phng phỏp khuych tỏn trờn mụi trng thch theo 10 TCN 714 - 2006. - Xác nh kh năng sinh tng hp IAA thô theo phương pháp Salkowsky ci tin: Xác nh hàm lưng IAA to ra trong môi trưng nuôi cy có b sung 0,1% triptophan; so màu trên máy quang ph  bưc sóng 530 nm vi  th IAA chuNn. - Xác nh tên và mc  an toàn sinh hc ca các chng Bacillus bng phương pháp phân loi sinh hc phân t, da trên cơ s gii trình t gen 16s ARN ribosome, so sánh vi các trình t có sn trong ngân hàng gen quc t EMBL bng phương pháp FASTA 33 và xây dng cây phát sinh chng loi. Tên vi sinh vt ưc xác nh vi xác xut tương ng cao nht. - Thí nghim ánh giá hot tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh vi khuNn trên cây khoai tây: t trng cây thí nghim là loi t phù sa sông Hng ã ưc kh trùng. Thí nghim ưc trng trong nhà lưi, b trí ngu nhiên, 3 ln nhc li, 18 cây/ln nhc. Công thức thí nghiệm: CT1: Nhim VKHX (10 8 CFU/c ging). CT2: Nhim B05 và VKHX (10 8 CFU/c ging, t l nhim 1:1). CT3: Nhim B08 và VKHX (10 8 CFU/c ging, t l nhim 1:1). CT4: Nhim B16 và VKHX (10 8 CFU/c ging, t l nhim 1:1). CT5: Nhim B18 và VKHX (10 8 CFU/c ging, t l nhim 1:1). Ch tiêu theo dõi: T l cây nhim bnh (%) sau trng 30 ngày. - Thí nghim ánh giá nh hưng ca Bacillus n sinh trưng ca cây khoai tây: t trng cây thí nghim là loi t phù sa sông Hng ã ưc kh trùng. Thí nghim ưc trng trong nhà lưi, b trí ngu nhiên, 3 ln nhc li, 10 cây/ln nhc. Công thc thí nghim: CT1: i chng (không nhim vi sinh vt). CT2: Nhim Bacillus (10 7 CFU/c ging). Ch tiêu theo dõi: Chiu cao cây, trng lưng tươi thân lá, trng lưng khô thân lá ca cây khoai tây sau trng 30 ngày. III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 1. Tuyển chọn chủng Bacillus T các chng Bacillus do ngun gen vi sinh vt nông nghip ã xác nh hot tính i kháng vi sinh vt gây bnh héo xanh vi khuNn i vi cây khoai tây và hot tính sinh tng hp hot cht kích thích sinh trưng thc vt (IAA). Kt qu ưc tp hp ti bng 1. Bảng 1. Hoạt tính sinh học của các chủng Bacillus TT Ký hiệu chủng Bacillus Khả năng đối kháng VK gây bệnh héo xanh (Đường kính vòng ức chế vi khuẩn D - d, mm) Khả năng sinh tổng hợp IAA thô (Hàm lượng IAA thô, µ µµ µg/ml) 1 B01 - - 2 B03.2 6 71 3 B05 15 185 4 B06 3 49 5 B07 - 157 6 B08 15 186 7 B09 6 <10 8 B10 - 257 9 B11 - - 10 B12 - - 11 B13.1 - 14 12 B13.2 - 71 13 B15 - 22 14 B16 22 133 15 B18 15 263 Ghi chú: “ - ” Không có hot tính Kt qu bng 1 cho thy: - 7/15 chng Bacillus nghiên cu có hot tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh khoai tây. Trong ó bn chng có ưng kính c ch vi khuNn gây bnh héo xanh trên 15 mm (B18, B16, B08 và B05); c bit chng B16 có ưng kính c ch vi khuNn gây bnh héo xanh cao nht (t 22 mm). - 12/15 chng Bacillus nghiên cu có hot tính sinh tng hp IAA. Trong ó 5 chng có hàm lưng IAA hình thành t trên 100 µg/ml (B18, B16, B10, B08, B07 và B05). - T kt qu trên, 4 chng B18, B16, B08 và B05 ã ưc la chn cho các nghiên cu tip theo. Vi mc ính s dng chng Bacillus trong kim soát bnh héo xanh vi khuNn i vi cây khoai tây, tip tc ánh giá hot tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh ca các chng Bacillus la chn trên cây trng. Kt qu ưc th hin trong bng 2. Bảng 2. Khả năng đối kháng VKHX của các chủng Bacillus tuyển chọn trên cây khoai tây Chỉ tiêu theo dõi Công thức Cây bị bệnh (%) Cây bị bệnh so với đối chứng (%) Mức độ hoạt tính đối kháng CT1 (ĐC nhiễm VKHX) 66,6 - - CT2 (B05 + VKHX) 25,7 38,6 Khá CT3 (B08 + VKHX) 28,9 43,4 Khá CT4 (B16 + VKHX) 16,7 25,1 Cao CT5 (B18 + VKHX) 20,5 30,8 Khá Kt qu bng 2 cho thy, 4 chng Bacillus nghiên cu u có kh năng c ch VKHX, t l cây b bnh so vi i chng t 25,1 n 38,6 %. Da theo 10 TCN 714 - 2006, chng B16 có mc  hot tính i kháng cao (t l cây b bnh so vi i chng < 30 %). Da vào kt quá ánh giá hot tính i kháng VKHX cây khoai tây ca các chng Bacillus trong iu kin phòng thí nghim và trên cây trng, ã tuyn chn ưc chng B16 có hot tính i kháng VKHX cây khoai tây cao. Ngoài ra, chng B16 còn có hot tính sinh tng hp hot cht kích thích sinh trưng thc vt. Tính a chc năng ca chng B16 có ý nghĩa trong vic nghiên cu s dng  sn xut phân bón vi sinh vt chc năng cho cây khoai tây. 2. Xác định tên, mức độ an toàn sinh học của chủng B16 2.1. Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào Bảng 3. Đặc điểm hình thái khun lạc, tế bào của chủng B16 Đặc điểm Chủng B16 Gram (+) Đặc điểm khuẩn lạc Dạng mép răng cưa, bẹt, hơi nhăn, trắng đục, kích thước khuẩn lạc 1,2 - 1,5 cm Đặc điểm tế bào Dạng hình que, bào tử hình elip Khả năng di động Chuyển động chậm Da vào c im khuNn lc và t bào cho thy chng B16 có nhiu c im ging Bacillus subtilis. 2.2. Phân loại dựa trên giải trình tự đoạn ADN 16S riboxom Kt qu gii trình t on 16S ADN riboxom ca chng B16 có 99,3% tương ng vi Bacillus subtilis. Trình t nucleotid on ADN 16S ribosome ca chng B16 như sau: Hình 1. Cây phát sinh chủng loại được hình thành trên cơ sở so sánh trình tự nucleotid đoạn AD 16S ribosome của chủng B16 với trình tự nucleotid đoạn AD 16S ribosome của Bacillus subtilis phân lập ở các nước khác nhau trên thế giới. DE: CHLB Đức; KR: Hàn Quốc; QT: Bacillus subtilis chủng Quốc tế, được các nước hợp tác giải mã toàn bộ genom; JP: hật Bản. Độ an toàn sinh học của chủng Bacillus subtilic. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 2.3. Độ an toàn sinh học của chủng Bacillus subtilis  an toàn sinh hc ca các chng vi sinh vt s dng trong i sng có ý nghĩa c bit quan trng. Theo hưng dn s 90/679/EWG ngày 26 thàng 11 năm 1990 ca Cng ng châu Âu v an toàn sinh hc, nhóm tác nhân sinh hc “Vi khuNn” ưc phân làm 4 cp  an toàn, trong ó ch các vi khuNn  cp  1 và 2 ưc ng dng trong sn xut  iu kin bình thưng. - Cp  1 (Risiko gruppe 1) là các vi khuNn không th gây bt c mt nguy him nào i vi ngưi và ng vt - Cp  2 (Risiko gruppe 2) là các vi khuNn có th gây bnh i vi ngưi, ng vt  mc  thp, không có kh năng lan truyn và có th phòng, chng và loi tr d dàng trong iu kin bình thưng. - Cp  3 (Risiko gruppe 3) là các vi khuNn có nguy cơ gây bnh nng i vi ngưi, ng vt và có kh năng lan truyn rng, song vn có th phòng chng và loi tr ưc. - Cp  4 (Risiko gruppe 4) là các vi khuNn có th gây bnh nng i vi ngưi, ng vt, có nguy cơ ln v mc  lan truyn rng và không th phòng, chng hoc loi tr. Kt qu so sánh vi danh mc các vi khuNn an toàn ca CHLB c và Cng ng Châu Âu cho thy chng Bacillus subtilis B16 thuc nhóm vi khuNn có  an toàn cao (cp  1). Như vy, chng B16 la chn là chng vi sinh vt bo m an toàn sinh hc; có th s dng trong sn xut phân bón vi sinh vt. 3. Đánh giá ảnh hưởng chủng B16 đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Kt qu ánh giá nh hưng ca chng B16 n sinh trưng ca cây khoai tây sau 30 ngày trng ưc th hin trong bng 4. Bảng 4. Ảnh hưởng của chủng B16 đến sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Công thức Chiều cao cây (cm) Trọng lượng tươi thân lá (g) Trọng lượng khô thân lá (g) CT1 (ĐC) 39,70 40,80 3,92 CT2 (nhiễm B16) 43,20 44,95 4,43 CV% LSD 0,05 4,10 3,867 4,20 4,097 4,40 0,419 Kt qu bng 4 cho thy,  công thc nhim B16 (CT 2), chiu cao cây, trng lưng tươi và trng lưng khô thân lá u cao hơn so vi i chng. iu này cho thy, chng B16 có nh hưng tích cc n sinh trưng và phát trin ca cây khoai tây. Như vy, t các kt qu trên cho thy chng Bacillus subtilis B16 có kh năng kim soát bnh héo xanh vi khuNn và có nh hưng tích cc n sinh trưng, phát trin ca cây khoai tây. Chng Bacillus subtilis B16 s ưc gii thiu cho sn xut phân bón vi sinh vt chc năng cho cây khoai tây. IV. KÕT LUËN - T 15 chng Bacillus nghiên cu ã tuyn chn ưc chng Bacillus subtilis B16 có hot tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh cho cây khoai tây cao, có kh năng sinh tng hp cht kích thích sinh trưng thc vt (IAA); ng thi là chng vi sinh vt có mc  an toàn sinh T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 hc cao (cp  1). ây là chng vi sinh vt có giá tr s dng trong sn xut phân bón vi sinh vt chc năng. - Th nghim trên cây khoai tây cho thy, chng Bacillus subtilis B16 có kh năng hn ch bnh héo xanh vi khuNn, tăng kh năng sinh trưng và phát trin i vi cây khoai tây. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. 10 TCN 714:2006 Phương pháp ánh giá hot tính i kháng ca vi sinh vt có kh năng i kháng vi khuNn Ralstonia solanacearum gây bnh héo xanh cây trng cn. 2. Bais HP, Fall R and Vivanco JM (2004), Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134, 307 - 319. 3. Borriss R (2002), Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant - growth - promoting effect. Microbiol. 148, 2097 - 2109. 4. Danielsson J, Reva O and Meijer J (2007), Protection of oilseed rape (Brassica napus) toward fungal pathogens by strains of plant - associated Bacillus amyloliquefaciens. Microb. Ecol. 54, 134 - 140. 5. Idriss EE, Makarewicz O, Farouk A, Rosner K, Greiner R, Bochow H, Richter T and Jacobsen B, Zidack N and Larson B (2004), The role of Bacillus based biological control agents in integrated pest management systems: Plant diseases. Phytopathology 94, 1272 - 1275. Người phản biện GS. TSKH. Trần Duy Quý . sinh trưng, phát trin ca cây khoai tây. Chng Bacillus subtilis B16 s ưc gii thiu cho sn xut phân bón vi sinh vt chc năng cho cây khoai tây. . các chủng Bacillus tuyển chọn trên cây khoai tây Chỉ tiêu theo dõi Công thức Cây bị bệnh (%) Cây bị bệnh so với đối chứng (%) Mức độ hoạt tính