Tạp chí KHKT Nông nghiệp 2006: Tập IV, Số 6: 105-111 Đại học Nông nghiệp I ứng dụng công nghệ enzyme để thu nhận đờng chức năng fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mía Application of enzyme technology for fructooligosaccharides (FOS) production from sugarcane juice Ngô Xuân Mạnh 1 và cộng sự Summary The aim of the present research was to study the use D fructofuranosidase (EC: 3.2.1.26) in enzyme preparation Pectinex Ultra SP-L (Novozymes) for Fructooligosaccharide (FOS) production. Enzyme preparation Pectinex Ultra SP-L (Novozymes) contains D fructofuranosidase with the activity 58.1 U/ml. Optimal conditions were selected: Temperature = 40 o C, pH 5.6, 240 mn and ratio enzyme: sugarcane juice of 2 : 100 (v/v). The FOS syrup obtained using Pectinex Ultra SP-L has following composition: 50,4% FOS; 10.4% saccharose; 3.9% fructose and 35.3% glucose. Key words: Fructooligosaccharide (FOS), D fructofuranosidase, optimal temperature and pH, sugarcane juice 1. Đặt vấn đề Trớc đây, con ngời thờng quan tâm nghiên cứu và sử dụng những sản phẩm thực phẩm giàu dinh dỡng và giá trị năng lợng cao. Trong những năm gần đây ngoài những sản phẩm thực phẩm trên, ngời ta còn tập trung vào những sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dỡng và mức năng lợng thấp; nhng lại chứa các hoạt chất có tác dụng tốt đối với sức khỏe của con ngời - những thực phẩm chức năng (functional foods), trong số đó đờng chức năng là một nhóm thực phẩm chức năng quan trọng (Gibson và William, 2000). Có nhiều loại đờng chức năng nh: đờng panatinose, maltitol, sorbitol, lactitol, fructoolygosaccharide (FOS), xyloolygosaccharide, isomaltoolygosaccharide Trong số đó, đờng FOS đợc nghiên cứu nhiều hơn cả không phải chỉ bởi công nghệ sản xuất đơn giản, vị ngọt thấp nhng vẫn giữ đợc hơng thơm và vị ngọt đặc trng của đờng saccharose, quan trọng hơn là FOS có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe con ngời: có khả năng kích thích tiêu hóa, chống bệnh tiểu đờng, là thành phần trong chế độ ăn kiêng phòng chống bệnh béo phì. Đặc biệt FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu Fe, Mg, Ca, Cr ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt, cân bằng ion Mg 2+ , Ca 2+ trong cơ thể, chống bệnh long xơng và bệnh sâu răng ở trẻ em (Gibson và William, 2000; Mazza, 1998). Đờng FOS đợc tìm thấy trong tự nhiên ở một số loại rau quả nh: chuối, quất, mận, đào, cà chua, hành, tỏi, actiso Đi liền với sự phát triển đó, công nghệ enzyme ngày càng đợc sử dụng rộng ri trong nhiều lĩnh vực. 1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Đại học Nông nghiệp I Nớc ta là nớc có ngành công nghiệp mía đờng khá phát triển, các vùng nguyên liệu mía phân bố khá rộng ri (5 vùng sinh thái) trải rộng từ Bắc vào Nam. Do đó chúng ta sản xuất đờng FOS từ nguyên liệu ban đầu là mía khá thuận lợi. Trong bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme pectinex để thu nhận đờng chức năng FOS từ dịch mía. 2. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Vật liệu Dịch mía của giống mía chín trung bình F156 trồng trong vụ 2005 - 2006 đợc sử dụng để nghiên cứu. Đờng saccharose là loại đờng trắng tinh luyện có hàm lợng 99,62%, có độ ẩm 0,05% và đờng khử: < 0,05%. Chế phẩm enzyme pectinex Ultra SP-L (hng Novozymes, Đan Mạch) là chế phẩm dạng lỏng, màu nâu đen, đặc sánh, có mùi thơm đặc trng, trong đó có chứa enzyme -D- Fructofuranosidase đợc sản xuất từ chủng aspergillus niger. 2.2. Phơng pháp Tiến hành 4 đợt lấy mẫu mía ở 4 giai đoạn (thời điểm) khác nhau để kiểm tra thành phần đờng trong dịch mía. Mỗi đợt tiến hành kiểm tra 3 mẫu để lấy kết quả trung bình. Hoạt tính của enzyme -D Fructofuranosidase đợc xác định theo phơng pháp do Seikagaku đề xuất (tham khảo tài liệu của Whitaker &cs, 2004), hàm lợng đờng khử theo phơng pháp Lane - Eynone (tham khảo tài liệu của Đặng Thị Thu & cs, 1997), hàm lợng đờng theo phơng pháp đợc Nguyễn Văn Mùi mô tả (2001) và thành phần và hàm lợng đờng trong sản phẩm FOS thu đợc bằng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống sắc ký HP 1100 (hng Aligence, Mỹ) tại Phòng phân tích và kiểm định chất lợng thực phẩm, Viện Công Nghiệp Thực Phẩm. Các loại đờng trong mẫu chuẩn (Trung Quốc) và mẫu nghiên cứu đợc phân chia trên cột sắc ký supelco Ca 30cm x 7,8mm ID (hng Supelco, Mỹ), tốc độ dòng chảy 1ml/min, Detector là Detector đo chỉ số khúc xạ - RI. 3. KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN 3.1 Xác định hoạt tính của enzyme -D fructofuranosidase trong chế phẩm pectinex Ultra SP-L và hàm lợng đờng saccharose trong dịch mía Để có định hớng sử dụng chế phẩm enzyme pectinex-Ultra SP-L, hoạt tính của enzyme -D frutofuranosidase đ đợc xác định. Số đơn vị hoạt tính trong 1ml dung dịch chế phẩm enzyme là 58,1 U/ml. Do chế phảm pectin ex Ultra SP-L chứa enzyme -D frutofuranosidase, do đó có thể sử dụng chế phẩm này để thu nhận các fructooligosaccharide (FOS) từ đờng saccharose. Hàm lợng 3 loại đờng chính trong dịch mía thu đợc trình bày ở bảng 1 Bảng 1. Thành phần đờng trong dịch mía Đợt kiểm tra Saccharose (%w/w) Glucose (%w/w) Fructose (%w/w) 1 90,6 6,2 3,2 2 91,6 6,3 2,1 3 90,6 6,2 3,2 4 90,6 6,2 3,2 Trung bình 90,9 6,2 2,9 Số liệu của bảng 1 cho thấy thành phần đờng trong nớc mía tơng đối đồng đều trên 4 mẫu nớc mía phân tích. Trong số 3 loại đờng xác định, dịch mía chứa hàm lợng đờng saccharose là chủ yếu (~ 90%). Ngoài ra dịch mía còn chứa đờng glucose (~6%) và đờng fructose (~3%). 3.2. Xác định điều kiện tối u cho enzyme hoạt động ảnh hởng của nhiệt độ, pH và thời gian phản ứng đến hoạt tính của enzyme và khả năng vận chuyển đờng fructose để tạo thành đờng FOS đ đợc nghiên cứu. Hình 1 cho thấy hàm lợng fructose đợc vận chuyển tạo FOS tăng dần từ nhiệt độ 25 o - 40 0 C và đạt cực đại tại giá trị nhiệt độ 40 0 C với hàm lợng là 6,9%. Sau đó hàm lợng fructose đợc vận chuyển giảm dần từ nhiệt độ 45- 50 0 C. Điều đó chứng tỏ khả năng phản ứng thể hiện hoạt tính transferase của enzyme đạt cực đại tại giá trị nhiệt độ 40 0 C. Hình 2 cho thấy khi giá trị pH tăng từ 4,5- 5,5, hàm lợng fructose đợc vận chuyển tạo FOS cũng tăng lên và đạt cực đại tại giá trị pH 5,5 với hàm lợng fructose chuyển hóa đạt 6,9%. Sau đó, khi tiếp tục tăng từ pH 5,5-7, hàm lợng fructose đợc vận chuyển lại giảm xuống. Tại giá trị pH = 7 hàm lợng fructose đợc vận chuyển chỉ bằng 09%. Tại giá trị pH 5,5 hàm lợng fructose đợc vận chuyển tạo FOS đạt giá trị cao nhất. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 25 30 35 40 45 50 Hàm lợng (%) Fructose vận chuyển Nhiệt độ (0C) Hình 1. ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng vận chuyển Fructose 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4,5 5 5,5 6 6,5 7 pH Hàm lợng (%) Fructose vận chuyển Hình 2. ảnh hởng của pH đến khả năng vận chuyển Fructose 0 1 2 3 4 5 6 7 8 30 60 120 180 240 300 Thời gian (phút) Hàm lợng (%) Fructose vận chuyển Hình 3. ảnh hởng của thời gian đến khả năng vận chuyển Fructose Hình 3 cho ta thấy thời gian phản ứng càng tăng thì hàm lợng fructose đợc vận chuyển tạo FOS càng tăng. Thời gian phản ứng tăng từ 30 đến 240 phút thì hàm lợng fuctose đợc vận chuyển tạo FOS tăng cao trên 1%. Hàm lợng fructose đợc vận chuyển ở mức thấp nhất là 0.3% ở 30 phút. Với thời gian từ 240 phút đến 300 phút thì hàm lợng fructose đợc vận chuyển tăng lên không đáng kể. Vì vậy, thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme đợc chọn là 240 phút. Lúc này, hàm lợng fructose đợc vận chuyển tạo FOS đạt 7,0%. Trên cơ sở các kết quả thu đợc nhiệt độ 40 o C, pH 5,5 và thời gian phản ứng 240 phút đ đợc chọn cho phản ứng thu nhận đờng FOS từ dịch mía. 3.2 ảnh hởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đờng Lợng chế phẩm enzyme bổ sung là một yếu tố rất quan trọng nhằm tăng khả năng thủy phân và vận chuyển, chất lợng và giá thành sản phẩm. Nếu bổ sung với lợng enzyme thấp thì khả năng thủy phân thấp, thời gian thủy phân kéo dài làm cho sản phẩm biến màu, chất lợng và thành phần đờng biến đổi không nh mong muốn. Ngợc lại nếu lợng chế phẩm enzyme bổ sung càng cao thì hiệu quả thủy phân cũng càng cao (đạt đến điểm cực đại). Tuy nhiên bổ sung enzyme trong quá trình sản xuất cần phải quan tâm đến giá thành của enzyme. Vì vậy để đảm bảo cả yếu tố kinh tế và yếu tố kỹ thuật phải chọn ra một tỷ lệ thích hợp giữa các yếu tố đó. Khi bổ sung enzyme với các lợng khác nhau từ 0,005 đến 0,04 và tiến hành phản ứng ở điều kiện: nhiệt độ: 40 0 C, pH 5,5 và thời gian phản ứng 240 phút, lợng enzyme tăng thì hàm lợng fructose vận chuyển tạo FOS cũng tăng theo (bảng 2). Điều đó chứng tỏ hoạt tính transferase của enzyme cũng tăng khi nồng độ enzyme tăng. Khi lợng enzyme tăng từ 0,005 - 0,02 thì hàm lợng fructose đợc vận chuyển tạo FOS tăng từ 0,6% đến 6,9%. Nhng khi lợng enzyme tăng từ 0,02 đến 0,04 thì hàm lợng fructose đợc vận chuyển chỉ tăng từ 6,9% đến 7,9% (=1%). Nh vậy là hàm lợng fructose đợc vận chuyển tăng rất chậm từ nồng độ ezyme trong khoảng này. Bên cạnh đó hàm lợng saccharose +FOS giảm dần theo chiều tăng của lợng enzyme, còn ngợc lại hàm lợng glucose tăng dần theo chiều tăng của lợng enzyme. Số liệu cũng cho thấy khả năng thủy phân của enzyme tăng dần khi tăng nồng độ enzyme. Kết quả thu đợc ở bảng 2 cho phép chọn tỷ lệ enzyme/cơ chất: 2ml chế phẩm enzyme cho 100ml dịch mía trong quy trình sản xuất là hợp lý hơn đáp ứng yêu cầu về giá thành cho sản phẩm. Bảng 2. ảnh hởng của tỷ lệ chế phẩm Enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đờng Tỷ lệ enzyme/nớc mía (v/v) Saccharose+ FOS (%w/w) Glucose (%w/w) Fructose (%w/w) Fructose vận chuyển (%w/w) 0 90,6 6,2 3,2 0 0.005 85,7 9,0 5,3 0,6 0.01 82,2 11,7 6,1 2,6 0.015 80,1 13,9 6,0 4,8 0.02 73,5 18,2 8,2 6,9 0.025 73,4 18,4 8,1 7,2 0.03 71,7 19,5 8,8 7,6 0.035 70,6 20,1 9,3 7,7 0.04 69,7 20,6 9,7 7,9 3.3 Thành phần đờng FOS có trong sản phẩm Thành phần và hàm lợng các loại đờng có trong chế phẩm FOS đ đợc xác định và định lợng (hình 4, 5 và bảng 3). Siro FOS thu nhận đợc theo quy trình sản xuất trình bày ở sơ đồ 1 đợc phân tích thành phần và hàm lợng các loại đờng trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu đối chứng là đờng FOS bán trên thị trờng Trung Quốc. Số liệu bảng 3 và sắc ký đồ (hình 4 và 5) cho thấy hàm lợng FOS đạt giá trị cao nhất, chiếm 50,4%, hàm lợng fructose chiếm tỷ lệ thấp nhất 3,9%. Bên cạnh đó hàm lợng saccharose còn lại với tỷ lệ thấp (10,4%) và lợng glucose chiếm tỷ lệ khá cao (35,3%). Điều này chứng tỏ hiệu quả thủy phân và khả năng vận chuyển fructose của chế phẩm enzyme pectinex Ultra SP-L đạt tỷ lệ cao. Với hàm lợng fructose chiếm 3,9% cho thấy hiệu suất chuyển hóa rất cao. Minutes 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Volts 0.000 0.025 0.050 7.975 FOS 8.608 Sucrose 9.800 Glucose 11.708 Fructose 15.158 RID Lanhuong SV DHNN 08.5.2006 x20lan Name Retention Time Mẫu kiểm tra Hình 4. Sắc ký đồ của đờng FOS và các loại đờng trong mẫu nghiên cứu Minutes 0 10 20 30 40 50 60 Volts 0.00 0.01 0.02 0.03 7.975 Fos 8.608 sucrose 9.817 Glucose 11.733 Fructose 15.100 RID Lanhuong FOS 08.5.2006 Name Retenti on T i me Mẫu chuẩn Hình 5. Sắc ký đồ của đờng FOS chuẩn Điều kiện: Detector: RI Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút Cột sắc ký: Sulpelco Ca, 30cm x 7.8mm ID Bảng 3. Thành phẩn và hàm lợng đờngcó trong sản phẩm FOS Loại đờng Hàm lợng (%) FOS 50,4 Saccharose 10,4 Glucose 35,3 Fructose 3,9 Ghi chú: Kết quả trên tính theo tổng các loại đờng có trong mẫu (100%). Với việc sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L cho siro FOS có chất lợng tơng đơng nh đờng FOS của Trung Quốc bán trên thị trờng. 3.4. Quy trình sản xuất Trên cơ sở các kết quả thu đợc, chúng tôi đề xuất quy trình sản xuất siro FOS từ nớc mía có sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L nh ở sơ đồ 1. Sơ đồ1. Quy trình sản xuất siro FOS từ nớc mía có sử dụng enzyme Pectinex Ultra SP-L 4. KếT LUậN Hoạt tính của Enzyme -D fructofuranosidase có trong chế phẩm Pectinex Ultra SP- L là 58,1U/ml. Mía nguyên liệu Dung dịch nớc mía - Xử lý enzyme Pectinex Ultra SP-L. (Tỷ lệ enzyme: Dịch mía 2: 100, T=40 o C, pH 5,5, t=240 ph.) - Vô hoạt enzyme. - Lọc trong. Dung dịch Fructoolygosaccharide - Tẩy màu. - Cô đặc đến 70 0 Bx Siro FOS 70 0 Bx - Chọn và làm sạch - ép Các điều kiện cho việc xử lý enzyme Pectinex Ultra SP-L đ đợc lựa chọn gồm: - Nhiệt độ thích hợp là 40 0 C. - pH thích hợp là 5,5. - Thời gian phản ứng là 240 phút. - Tỷ lệ enzyme/nớc mía (20 0 Bx) là 2ml/100ml dịch mía. Từ đó nghiên cứu đề xuất một quy trình sản xuất siro FOS từ nớc mía có sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L với Siro FOS thành phẩm có thành phần và hàm lợng các loại đờng là: đờng FOS: 50,4%, saccharose: 10,4%, fructose: 3,9% và glucose: 35,3%. Tài liệu tham khảo Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành hóa sinh học. Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Đặng Thị Thu và CS., (1997). Thực hành hoá sinh công nghiệp. ĐHBK Hà Nội Gibson G.R & William C.M., (2000). Functional foods - Concept to product. Woodhead publishing Ltd. & CRC Press. 9 - 27 p. J.R.Whitaker, A.G.J.Voragen, D.W.S. Wong, (2004). Handbook of food Enzymology, 805 - 822p. Mazza G. Edt., 1998. Functional foods: Biochemical and processing aspects.Agriculture and agrifood, Canada, woodhead publishing Ltd . nghiệp I ứng dụng công nghệ enzyme để thu nhận đờng chức năng fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mía Application of enzyme technology for fructooligosaccharides. FOS từ nguyên liệu ban đầu là mía khá thu n lợi. Trong bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme pectinex để thu nhận đờng chức