Luận văn Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê Hà - Người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em tiến hành thí nghiệm và hoàn thành đề tài. Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Hoá sinh đã hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm trong thời gian triển khai đề tài. Em xin chân thành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian vừa qua. Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Trịnh thị Thuỳ DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hình 1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces Hình 1.3. Sản phẩm Marmit Hình 1.4. Sản phẩm Vegemite Hình 1.5. Chế phẩm β – glucan Hình 1.6. Vị trí xúc tác của neutrase gồm 3 gốc Asp 102, His57 và Ser195 Hình 2.1. Đường chuẩn glutamic Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.2. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme Hình 3.3. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.4. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Hình 3.7. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân Hình 3.8. Sắc ký đồ Bảng 1.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm bảng 1.2. Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân Bảng 3.1. Kết quả đo độ ẩm Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.3. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme Bảng 3.4. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.5. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men Bảng 3.8. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân nấm men DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid HdP :Hoạt độ protease KTĐ :Khô tuyệt đối TCA :Trichloroaceticacid TGTP : Thời gian thuỷ phân MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ngành công nghệ sản xuất bia ở Việt Nam ngày càng phát triển. Sản lượng bia ở Việt Nam đã tăng từ 1,29 tỷ lít vào năm 2003; 1,37 tỷ lít năm 2004; 1,5 tỷ lít năm 2005 và đạt 1,7 tỷ lít vào năm 2006. Nấm men bia là một tác nhân quan trọng không thể thiếu tham gia trực tiếp vào quá trình lên men bia. Sau khi lên men, một lượng lớn nấm men thải ra. Trung bình cứ sản xuất ra được 100 lít bia sẽ thải ra môi trường 2 lít men có thuỷ phần 88%. Men bia có hàm lượng protein cao trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô), trong thành phần protein có đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế. Ngoài ra, nó còn chứa các chất khoáng, giàu vitamin nhóm B, nhóm D và các chất kích thích sinh trưởng. Trong 1 g chất khô của nấm men chứa 300 μg vitamin B 1 , 40 μg vitamin B 2, 50μg vitamin B 6 , 600μg vitamin PP, 80μg axit pantoteic, 25μg axit folic, 1μg biotin và 500μg inozit. Trên thế giới, nấm men bia được quan tâm nghiên cứu tận dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm, làm nguồn thuốc bổ giàu axit amin và vitamin. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cách hiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi, khả năng khai thác các thành phần có giá trị sinh học trong men bia để tạo ra các sản phẩm ứng dụng cho con người còn rất hạn chế. Hơn nữa, nếu không được sử dụng triệt để thì nguồn bã nấm men này còn là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ những điều đó cùng với sự gợi ý của giáo viên hướng dẫn, để góp phần tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cho người bằng nguồn tận thu nấm men bia, em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men”. Nội dung chính bao gồm: - Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia bằng các chế phẩm enzim Neutrase và Flavourzyme (điều kiện nhiệt độ, nồng độ enzim, thời gian) và so sánh với quá trình tự phân nấm men. - Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo. - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym. 1 - Định tính một số thành phần axit amin quan trọng trong sản phẩm thuỷ phân. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Nấm men Saccharomyces và ứng dụng 1.1.1. Giới thiệu về Saccharomyces Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes, ngành nấm. Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có khả năng sinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit. Tế bào nấm men thuộc loại Eucaryot (nhân thật), có khả năng hô hấp yếm khí tuỳ tiện. Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nói đất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thực phẩm khác. Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào. Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo,… [18], [23], [25], [26], [34]. 1.1.1.1. Hình dạng và kích thước tế bào nấm men Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng khác nhau. Ngay trong cùng một loài, hình dạng tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện sống và tuổi đời. Trong môi trường đặc biệt thì nấm men có hình dạng rất ổn định. Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn. Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii. So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kích thước tương đối lớn. Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm [34]. Kích thước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,… 2 Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi. Hình 1.1. Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Hiện nay trên Thế Giới và ở Việt Nam đang sử dụng hai loại nấm men bia, đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước 2.5-10 µm chiều rộng và 4.5-21 µm chiều dài. 1.1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men là sinh vật đơn bào, hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động vật, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ,…), ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như: Ti thể, lục lạp,… [26]. 3 Hình 1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào (inclusion). Thành tế bào Thành tế bào dày khoảng 25 nm và chiếm khoảng 25-30 % khối lượng khô tế bào, là lớp vỏ bao quanh tế bào nấm men, tạo hình dáng tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp trong cùng cấu tạo từ β-glucan không tan trong kiềm, lớp giữa cấu tạo từ β-glucan hoà tan, lớp ngoài cùng là mannan photphoryl. Giữa hai lớp màng phía ngoài có chứa các enzym invertaza, photphataza axit, β-glucosidaza, proteaza,…Thành tế bào chứa khoảng 15 kitin cần thiết cho sẹo nảy chồi. Glucan (chủ yếu) và mannan chiếm tới 90% chất khô của vỏ tế bào. Glucan là một polyme phức tạp, có cấu tạo phân nhánh từ các tiểu phần là D-glucoza, phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3. Glucan là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị phá vỡ hoàn toàn. Mannan là polyme phân nhánh của đường D-mannanoza, mỗi phân tử thường chứa từ 200-400 gốc mannanoza, có phân tử lượng là 5.9×10 4 , không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào. Nếu bỏ phần mannan hình dáng tế bào không bị biến đổi. 4 [...]... phức tạp tạo thành sản phẩm mà chủ yếu là rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác Nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men rượu là Saccharomyces 1.1.2.2 Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men Men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, có thể bổ sung enzym thuỷ phân hoặc không, giữ ở 50 – 55 0C, đây là nhiệt độ thích hợp cho enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men và enzym protease. .. các sản phẩm của Altech sử dụng trong nuôi thuỷ sản, … 1.2 Tổng quan về protease 1.2.1 Khái quát về protease Enzym protease là nhóm men thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự Trong các enzym công nghiệp, enzym thuỷ phân chiếm 75 % và protease chiếm khoảng 60 % tổng lượng enzym được tiêu thụ trên thế giới 1.2.1.1 Phân loại protease Người ta phân loại nhóm enzym. .. làm giảm vị đắng của dịch thuỷ phân Nấm men cũng là một nguồn protein đang được nghiên cứu nhiều để tạo sản phẩm thuỷ phân Do lượng men thải ra từ công nghiệp bia rượu ngày càng tăng mà con người vẫn chưa tận dụng hết được Các protease sử dụng trong chế biến dịch đạm thuỷ phân như Neutrase, Flavourzyme, Viscozyme, Protamex, Alcalas 1.2.2.2 Ứng dụng trong sản xuất nước mắm Để sản xuất nước mắm ngắn ngày... ở nhiệt độ thích hợp cho hệ enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men hoạt động phân huỷ các thành phần của tế bào Dịch thuỷ phân rất giàu axit amin, peptid, vitamin nhóm B và các hydratcacbon 1.3.2.2 Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease Nguyên tắc là sử dụng chế phẩm enzym protease thuỷ phân protein của nấm men trong điều kiện thích hợp cho enzym hoạt động để tạo thành các dạng đạm khác... dinh dưỡng cho sản phẩm Đây là kết quả của các axit amin và các peptide phân tử lượng thấp trong dịch thuỷ phân nấm men 1.1.3.2 Sản xuất một số sản phẩm truyền thống Dịch thuỷ phân nấm men giàu axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, vitamin nhóm B, khoáng,… được sử dụng để tạo rất nhiều sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng như vegemite, marmite, oxo, cenovis, recipe,… 1) MARMITE: Sản phẩm này có... thu nhận phong phú đa dạng, protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: Công nghiệp thực phẩm, Công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược,…Trong đó ứng dụng rộng rãi nhất của protease là trong ngành công nghiệp thực phẩm 23 1.2.2.1 Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân Hiện nay, sử dụng protease để thu dịch thuỷ phân protein được ứng dụng rất rộng rãi như sản xuất nước giải khát, thức... 1026 bao gồm các tế bào nấm men của dòng men Saccharomyces cerevisiae 1026, là một dạng men sống dùng để trộn vào thức ăn Có tác dụng kích thích tăng trưởng và hoạt động của các loại vi khuẩn có lợi cho đường ruột [1] 1.1.3 Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men 1.1.3.1 Sử dụng làm chất điều vị 11 Sử dụng một lượng nhỏ dịch thuỷ phân nấm men vào một số thực phẩm như súp, nước xốt, trứng, snack, bánh quy,…sẽ... EDTA Conovalov và Dorokhow nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần nước quả đến hoạt độ của enzym protease nhận thấy ion Na + và Ca2+ là chất hoạt hoá enzym protease Đường có tác dụng kích thích enzym protease, ngược lại axit có tác dụng ức chế enzym protease Chất chát có nồng độ 0.02 % có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzym protease 2+ 1.2.2 Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein Với nguồn gốc... làm tăng giá thành sản phẩm vì hiệu suất sử dụng đạm cao Đạm thuỷ phân bình quân tăng 10.7%, đạm sử dụng trong sản xuất bình quân tăng 13.8% Hiệu suất sử dụng đạm tăng 2.6% Tiêu hao nguyên liệu giảm 12.1% [21] 1.2.2.3 Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia Việc ứng dụng các chế phẩm proteolitic trong sản xuất bia giúp cho người sản xuất có thể sử dụng hoàn toàn protein đại mạch do các enzym này chuyển... protein nói chung Vì vậy, việc tận dụng nguồn protein nấm men để tạo ra dịch thuỷ phân có giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh học cao mà lại an toàn cho người và gia súc là rất cần thiết 1.1.2.3 Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì Sinh khối nấm men làm nở bột mì là sinh khối men Saccharomyces cerevisiae còn sống, còn hoạt tính lên men rượu, khi trộn với bột mì sẽ lên men rượu, giải phóng ra CO2 làm . protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men . Nội dung chính bao gồm: - Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia bằng các chế phẩm enzim. dẫn, để góp phần tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cho người bằng nguồn tận thu nấm men bia, em tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu ứng dụng enzym protease