Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 Học Viên Nguyễn Hữu Quân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. ĐỊNH NGHĨA 2 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI 2 1.2.1. Nguồn gốc 2 1.2.2. Phân loại enzyme 3 1.3. CẤU TRÚC 5 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất 5 1.3.2. Cấu trúc không gian 6 1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC 8 1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae 10 1.6. Ứng dụng 11 1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 11 1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12 1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 13 1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 14 1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 14 1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 16 1.7.1. Nguồn carbon 16 1.7.2. Nguồn nitrogen 17 1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy 18 1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng 18 1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME 19 1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 19 1.8.2. Ảnh hƣởng của pH 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại 20 1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa 21 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22 2.1.1. Chủng giống 22 2.1.2. Thiết bị 22 2.1.3. Hóa chất 22 2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào 23 2.1.5. Môi trƣờng 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP 25 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme 25 2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27 2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 29 2.2.6. Điện di SDS-PAGE 30 2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 30 2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 32 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao 36 3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA 37 3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39 3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 39 3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 41 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon 43 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen 44 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen 45 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy 46 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy 47 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase 48 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 50 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 50 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu 51 3.5.3. Độ bền nhiệt 52 3.5.4. Độ bền pH 54 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ 55 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa 56 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 KẾT LUẬN 59 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 TIẾNG VIỆT 61 TIẾNG ANH 64 PHỤ LỤC 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 22 Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23 Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae 37 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 42 Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 49 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 57 Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose 69 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 69 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 70 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 70 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 74 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase 75 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase 76 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của Cel12A từ H. grisea 7 Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea 8 Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase 9 Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 10 Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose 26 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 29 Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae 36 Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI (C). 38 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 39 Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A. oryzae VTCC-F-045 40 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 41 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 44 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 45 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo- β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 47 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β- 1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 48 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) 49 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4- glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 51 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 52 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 53 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 54 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 55 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 56 [...]... chúng tôi đã chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4glucanase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái... hợp enzyme của vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay kiềm pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase là 6,5-7,0 và pH tối ƣu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt là 7,0-7,5 và pH tối ƣu là 7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008) Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh nhất... thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase Kawamori và cs (1987) khi nghiên cứu trên chủng Thermoascus aurantiacus A-131 và Thermoascus reese QM 9414 cho thấy Avicel là nguồn carbon thích hợp nhất để chủng T reese QM 9414 sinh tổng hợp CMCase, tiếp đến là bã mía, cellulose, lactose, CMC và xylan Trong khi lõi ngô và xylan lại là nguồn carbon thích hợp cho chủng T aurantiacus A-131 sinh tổng. .. nhiệt độ 20-37°C Các loài chịu nhiệt sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50°C Khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B subtilis nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme là 37°C (Tang et al., 2004) Đối với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt thì nhiệt độ thích hợp để các chủng này sinh enzyme cao từ 45-55°C (Nguyễn Lan... trình sống của vi sinh vật nói chung và của nấm mốc nói riêng Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm là nhóm vi sinh vật ƣa lạnh và chịu lạnh; nhóm vi sinh vật ƣa ấm và nhóm vi sinh vật chịu nhiệt Các loài ƣa lạnh sinh trƣởng đƣợc trong điều kiện nhiệt độ dƣới 15°C; các loài ƣa ấm sinh trƣởng và phát... bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 21 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1 Chủng giống Ba mƣơi lăm chủng nấm A oryzae do Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội) cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn chủng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất 2.1.2 Thiết bị Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt... hay peptone Tùy loài vi sinh vật mà nguồn nitrogen đƣợc sử dụng là khác nhau Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài Tang và cs (2004) khi tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng B subtilis nhận thấy nguồn nitrogen vô cơ không thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase; ... cao nấm men và bột đậu tƣơng rất thích hợp cho khả năng sinh enzyme (Tang et al., 2004) Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tƣơng ảnh hƣởng mạnh mẽ tới quá trình tổng hợp cellulase của chủng A niger NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và cs (2008) khi nghiên cứu trên chủng A niger cho thấy peptone, ammonium sulfate và urea là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng A niger sinh tổng hợp cellulase... pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003) Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002) CMCase của A niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002) 1.8.3 Ảnh hƣởng của các... (46%) và EglB từ chủng A niger (49%) Ở chủng A oryzae KBN616, Kitamoto và cs (1996) đã nhân dòng phân tử, tinh sạch và mô tả đặc điểm của 2 gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase là CelA và CelB Gene CelA gồm 877 pb với 2 đoạn intron Protein do CelA mã hóa gồm 239 amino acid và đƣợc xếp vào họ cellulase H Gene CelB chứa 1248 bp không chứa đoạn intron Protein do CelB mã hóa gồm 416 amino acid và đƣợc xếp vào . QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC. TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học