Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E L L L U U U Ậ Ậ Ậ N N N V V V Ă Ă Ă N N N T T T Ố Ố Ố T T T N N N G G G H H H I I I Ệ Ệ Ệ P P P Đ Đ Đ Ạ Ạ Ạ I I I H H H Ọ Ọ Ọ C C C N N N G G G À À À N N N H H H N N N U U U Ô Ô Ô I I I T T T R R R Ồ Ồ Ồ N N N G G G T T T H H H Ủ Ủ Ủ Y Y Y S S S Ả Ả Ả N N N C C C H H H U U U Y Y Y Ê Ê Ê N N N N N N G G G À À À N N N H H H B B B Ệ Ệ Ệ N N N H H H H H H Ọ Ọ Ọ C C C T T T H H H Ủ Ủ Ủ Y Y Y S S S Ả Ả Ả N N N 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E L L L U U U Ậ Ậ Ậ N N N V V V Ă Ă Ă N N N T T T Ố Ố Ố T T T N N N G G G H H H I I I Ệ Ệ Ệ P P P Đ Đ Đ Ạ Ạ Ạ I I I H H H Ọ Ọ Ọ C C C N N N G G G À À À N N N H H H N N N U U U Ô Ô Ô I I I T T T R R R Ồ Ồ Ồ N N N G G G T T T H H H Ủ Ủ Ủ Y Y Y S S S Ả Ả Ả N N N C C C H H H U U U Y Y Y Ê Ê Ê N N N N N N G G G À À À N N N H H H B B B Ệ Ệ Ệ N N N H H H H H H Ọ Ọ Ọ C C C T T T H H H Ủ Ủ Ủ Y Y Y S S S Ả Ả Ả N N N CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH NGUYỄN THỊ TIÊN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM ƠN Được làm luận văn tốt nghiệp là mong muốn của rất nhiều sinh viên, trong đó có bản thân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn này là cả một quá trình phấn đấu, phải mất nhiều thời gian và công sức để nghiên cứu, đồng thời phải được sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô. Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn sinh học và bệnh thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong thời gian tôi theo học và nghiên cứu tại trường. Xin cám ơn gia đình đã động viên giúp đỡ không chỉ về vật chất mà cả về tinh thần từ khi tôi bước chân vào trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Xin gởi lời cám ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và thầy Đoàn Nhật Phương đã nhiệt tình quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cố vấn học tập. Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng và bệnh học thủy sản K30 đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Chủng vi khuẩn tham khảo E223 cùng với 2 chủng C1, C2 phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4 chủng trong tủ âm của khoa thủy sản CAF258, CAF255, 2B1, 3B3 được sử dụng cho việc dịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kiểm tra API 20E. Sau khi phục hồi trên TSA tiến hành test các chỉ tiêu cơ bản gồm. Tất cả các chủng đều có đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri như dạng hình que, gram âm, cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, không có khả năng sinh khí H 2 S và không tạo sản phẩm indole. Hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau ở cả 2 phương pháp. Đề tài cũng tiến hành điện di, kết quả sản phẩm PCR có sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri tất cả đều hện vạch tại vị trí 407pb. Chọn ngẫu nhiên 5 chủng CAF258, E223, 3B3, C1 và C2 tiến hành gây cảm nhiễm. Kết quả 3 bể CAF28, C1 và C2 cá có xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Sau khi tái phân lập và tái định danh tất cả các chủng đều có đặc điểm giống chủng ban đầu, cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v Chương I : Giới thiệu 1 Chương II: Lược khảo tài liệu 3 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra ở ĐBSCL 3 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá da trơn 4 2.31. Bệnh xuất huyết 4 2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra 5 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp 8 Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 11 3.1 Thời gian và địa điểm 11 3.1.1 Thời gian 11 3.1.2 Địa điểm 11 3.2 Nội dung thực hiện 11 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11 3.3.1 Vật liệu 11 3.3.2 Thiết bị 11 3.4 Thuốc thử, môi trường dùng cho nghiên cứu 12 3.3.4 Số chủng vi khuẩn cần thiết 12 3.5 Phương pháp nghiên cứu 13 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv 3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết 13 3.5.2 Nguồn vi khuẩn 13 3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 14 3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14 3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API20E 15 3.5.6 Phương pháp PCR 16 3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 17 Chương IV: Kết quả- thảo luận 19 4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống 19 4.2 Kết quả test API 21 4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR 23 4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn 24 4.5 Thảo luận 28 Chương V: Kết luận – Đề xuất 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài 13 Bảng 3.2: Bảng test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn 14 Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng bộ kít API 20E 15 Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR 16 Bảng 4.5: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 19 Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi bằng bộ kit API 20E 22 Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 26 Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E 27 Bảng 4.9: Các đặc điểm khác nhau giữa loài E. ictaluri với các loài khác thuộc nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003) 29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 18 Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri 20 Hình 4.3: Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của E. ictaluri 20 Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole cua vi khuẩn E. ictaluri 21 Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithine và lysine của E. ictaluri 21 Hình 4.6: Kết quả test API của vi khuẩn E. ictaluri 23 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn E. ictaluri 23 Hình 4.8: Thận cá tra nhiễm dòng vi khuẩn CAF258 25 Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri 25 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Một trong bảy vùng kinh tế quan trọng của cả nước Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản phát triển. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản đã đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu ở Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập, xóa đói giảm nghèo cho các vùng nông thôn. Nổi bật là nghề nuôi cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước (www.fistenet.gov.vn) Tuy nhiên khi diện tích nuôi được mở rộng, nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại cũng nhiều hơn. Có thể nói trong những năm gần đây nghề nuôi thủy sản đang phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ do sự suy thoái về môi trường và lây lan của mầm bệnh. Trong đó bệnh truyền nhiễm mà nhất là bệnh vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng cá nuôi với sự nổi bật là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Các kết quả nghiên cứu gần đây xác định bệnh mủ gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E. Tuy nhiên, chưa có những thông tin về sự đồng nhất hay sai khác khi xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của hai phương pháp này khi định danh vi khuẩn E. ictaluri. Đề tài “Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E” được thực hiện nhằm tìm ra những chỉ tiêu sinh hóa giống và khác nhau khi sử dụng hai phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 Mục tiêu nghiên cứu So sánh các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn E. ictaluri được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kit API 20E. Nội dung nghiên cứu  Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri xác định bằng phương pháp truyền thống.  Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri bằng bộ kit API 20E.  Xác định kết quả định danh bằng phương pháp PCR [...]... vi khuẩn bị biến đổi đặc tính vì trữ lâu trong tủ âm -80C 4.2 Kết quả test API Song song với vi c xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống, đề tài cũng tiến hành xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ kít API 20E Kết quả được trình bày ở Bảng 4.6 21 Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn bằng bộ kít API. .. cảm nhiễm dòng E ictaluri Xuất huyết ở các gốc vây ( ) Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được thực hiện với vi khuẩn được tái phân lập gồm: nhuộm Gram, phản ứng O/F, oxidase, catalase, tính di động Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở Bảng 4.7 Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E được... thấy sự hiện diện của vi khuẩn ở bất kỳ cơ quan nào 27 4.5 Thảo luận Đề tài được thực hiện với nội dung tìm hiểu những chỉ tiêu sinh hóa khác nhau khi sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E Nhìn chung hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau khi sử dụng hai phương pháp này Tuy nhiên, vẫn có sự sai khác ở một số chỉ tiêu là ornithine dương tính đối với phương pháp sinh hóa truyền. .. của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993) Các chỉ tiêu sinh hóa được thực hiện cho phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Các chỉ tiêu sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất hai lần lặp lại Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách... đi khác nhau cho từng loài vi khuẩn Vi c định danh vi khuẩn dùng sơ đồ gia phả đã được áp dụng bởi nhiều tác giả, và định danh ra các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio, Edwardsiella, Aeromonas… Năm 2004, Buller dùng phương pháp định danh truyền thống với 41 chỉ tiêu cho các chủng E ictaluri để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa Tương tự, thì Plumb và ctv (1983) cũng đã dùng test sinh hóa truyền thống, ... oxidase, catalase, O/F, tính di động Sau đó kiểm tra các đặc điểm sinh hóa theo phương pháp của của Barrow và Feltham (1993), mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại Bảng 4.5 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Chỉ tiêu CAF255 CAF258 2B1 3B3 C1 C2 E223 Chủng chuẩn của... sinh hóa truyền thống, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý của E ictaluri với 47 chỉ tiêu Bộ kít API 20E Trung Kit API 20E là bộ kit do hãng bioMerieux sản xuất, nó được dùng cho vi c định danh các loài vi khuẩn gram âm, hình que Mặc dù API là phương pháp được ứng dụng cho vi c định danh các loài vi khuẩn trên động vật nhưng ngày tâm Học liệudụng rộng rãiThơ @ Tài do cáchọc tậpnhanhnghiên cứu ĐH... công các loài vi khuẩn trong môi trường nước, góp phần vào vi c nghiên cứu, tìm ra tác nhân gây bệnh Không phải tác giả nào cũng đưa ra các chỉ tiêu giống nhau để định danh vi khuẩn, chẳng hạn chỉ tiêu này là quan trọng cho loài này nhưng lại không cần thiết cho loài khác, nhưng nhìn chung tất cả đều dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản Người ta chia vi khuẩn thành các nhóm khác nhau, nhóm vi khuẩn gram âm và. .. biến trong vi c định danh vi khuẩn đặc biệt là đối với các loài vi khuẩn gram âm Nếu so sánh giữa API và sinh hóa truyền thống mà không nói về độ chính xác của kết quả thì dễ dàng nhận thấy API sẽ được chấp nhận nhiều hơn do không mất nhiều thời gian, công sức mà lại còn cho kết quả nhanh chóng Nếu xét riêng từng phương pháp thì kít API hay phương pháp sinh hóa truyền thống đều có những ưu và nhược điểm... 3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn - Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường TSA, ghi nhận kết quả phục hồi của vi khuẩn sau 24-48 giờ ở 28 C - Chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đặt trên máy lắc sau 24 - 48 giờ kiểm tra kết quả 3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống Hình dạng, kích thước tính ròng và các đặc điểm sinh hóa của vi . KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E. KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E