Đề tài "Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1" 1 MỞ ĐẦ U Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng. Để hạ n chế sự lây lan củ a virus thự c vậ t , nhữ ng biệ n phá p truyề n thố ng đang đượ c áp dng hi ện nay như loạ i bỏ nhữ ng cây bị bệ nh ngay khi mớ i phá t hiệ n , phun thuố c diệ t môi giớ i truyề n bệ nh…t ỏ ra kém hiệ u quả l ại đò i hỏ i nhiề u thờ i gian , công sứ c và ả nh hưở ng xấ u tớ i môi trườ ng. Việ c tì m ra cá c biệ n pháp đ ngăn chn sự phá t triể n và lây lan củ a virus gây b ệnh trên thự c vậ t đang là mộ t vấ n đề đượ c quan tâm nghiên cứu. Sự phát trin mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống cây trồng có khả năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát trin một xu thế mới trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật. Cng với sự phát trin của công nghệ sinh học, đã có nhiề u ứ ng dụ ng sinh họ c phân tử trong chọ n tạ o giố ng cây trồ ng khá ng virus , trong đó , công nghệ RNA interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hu hiệu nhất thông qua việc s dng các vật liệu di truyền t virus gây bệnh chuyn vào cây trồng tạo cây chuyn gen kháng chnh virus đó với hiệu quả có th lên tới 80-95%. Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyn gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dng kỹ thuật RNAi trên mô hình cây thuố c lá chuyn gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) hoc kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Nhằm tiếp tc phân tích các đc tính di truyền của gen chuyn ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứ u cá c phương phá p phân tí ch cây thuố c lá chuyể n gen khá ng bệ nh khả m lá thế hệ T1” 2 Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U 1.1. Bệ nh virus thƣ̣ c vậ t 1.1.1. Giớ i thiệ u chung về bệ nh virus hạ i thƣ̣ c vậ t Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,… Virus thực vật gây hại nng nề tới năng suất và chất lượng nông sản, mức độ thiệt hại có khi lên tới 100%. Theo ước tính thiệt hại hàng năm do bệnh virus gây ra trên thế giới vào khoảng 70 tỉ USD (Nguyễ n Văn Tỵ , 2002). Cho đến nay, với sự phát trin của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, trên 4 ngàn loại virus đã được phát hiện, trong đó có hơn 2000 loài là virus hại thực vật. Virus thự c vậ t là nhữ ng vi sinh vậ t vô cù ng nhỏ bé và có nhữ n g đặ c đi m : (PGS.TS Vũ Triệ u Mẫ n và PGS.TS Lê Lương Tề , 2002)  Virus có cấ u tạ o rấ t đơn giả n : có hai phần chnh là li axit nucleic và vỏ protein  Thông thườ ng virus thự c vậ t có vậ t chấ t di truyề n là RNA , mộ t số í t cò n lạ i c ó vậ t chấ t di truyề n là DNA  Virus là vi sinh vậ t kí sinh ở mứ c độ tế bà o . Virus thự c vậ t có thể nhiễ m bệ nh cho mộ t hay nhiề u loà i cây , và mi loài cây có th nhim một hay nhiều loài virus  Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhim vào tế bào chủ chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus s dng vật chất của tế bào đ tạo thành một số virus con mới. Do vậy cơ th thực vật bị kiệt quệ dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian t lúc virus bắt đầu xâm nhim đến khi cây thoái hóa và chết ph thuộc vào đc đim gây bệnh của các loài khác nhau và ph thuộc vào tng loại cây cũng như sức chống chịu của tng cây. 3  Virus không th phòng chống, tiêu diệt bằng x lí các chất hóa học như nhng bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất đ loại bỏ virus là phải loại bỏ nhng cây trồng bị bệnh. 1.1.2. Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biu hiện bệnh trong thời gian ngắn. Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn li. Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Sản phẩm t cây bị nhim virus thường có chất lượng kém xa so với cây trồng bình thường. Hạt lúa bị bệnh vàng li thường bị lép không cho thu hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi ăn có vị đắng. Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn ci, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp. Citrus tristeza virus hại cam quít rất nng tại vng bờ bin Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông Nam Á Bệnh làm cho quả cam chn ép và rng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nước cam nhạt không mi vị. Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, kh hậu nhiệt đới gió ma do vậy cây trồng, thảm thực vật Việt Nam và hệ sinh vật ở nước ta rất phong phú. Đây là điều kiện đ bệnh virus ở Việt Nam đa dạng về chủng loại lại d lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng tới sản xuất. Gây hại nghiêm trọng nhất có th k tới các virus gây bệnh trên cây lúa (bảng 1.1). Trong lịch s trồng lúa ở nước ta đã xảy ra rất nhiều trận dịch lớn vào các năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010 đã tiêu huỷ mấy chc vạn ha lúa, tốc độ lây lan rất nhanh. Cây lúa bị bệnh lúc đầu lá sẫm màu, sau đó cây lùn thấp lá xoè ngang, thâm lâu r đen, cây chết li nhanh chóng. Bệnh có th xuất hiện t một vài m 2 sau đó lây lan ra hàng trăm, hàng nghìn ha. Làm cánh đồng lúa t màu xanh biến thành màu nâu và chết li trong vòng 10 -15 ngày sau khi phát hiện bệnh. Gạo thu được t lúa bị bệnh thường có màu sẫm, đắng không ăn được. Do đó, thiệt hại của bệnh có th tính là 100% (1964 - 1968); đc biệt dịch bệnh lúa lùn xoắn lá, lúa cỏ, lúa vàng lùn đã 4 phá hoại ở miền tây Nam bộ trên diện tích trên 500.000 ha (năm 2006 - 2007). Gần đây (2009-2010) virus gây bệnh lùn sọc đen trên lúa cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh phía Bắc như Nam Định, Thái Bình,…(Bệ nh cây chuyên khoa - Vũ Triệu Mân ). Một số virus gây bệnh khác trên cây cà chua, khoai tây, lạc, đậu tương (bảng 1.1),… cũng có th làm ảnh hưởng đến 80% năng suấ t cây trồng. Bảng 1.1. Một số loại virus gây bệnh trên cây lương thự c và hoa mà u Cây chủ Bệnh Virus gây hại Lúa Bệ nh và ng lá tungro Rice Tungro Sperical virus-RTSV Bệ nh lú a cỏ Rice Grassy Stunt Virus- RGSV Bệ nh lù n xoăn lá Rice Ragged Stunt Virus- RRSV Bệ nh sọ c đen lù n Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV Ngô Bệ nh khả m lá ngô Maize Mosaic Virus- MMV Bệ nh khả m lù n ngô Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV Cà chua Bệ nh xoăn và ng lá cà chua Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV Bệ nh đố m hé o cà chua Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV Bệ nh khả m lá cà chua Tomato Mosaic Virus- ToMV Khoai tây Bệ nh virus Y khoai tây Potato Virus Y- PVY Bệ nh virus A khoai tây Potato Virus A- PVA Bệ nh virus X khoai tây Potato Virus X- PVX Bệ nh virus S khoai tây Potato Virus S- PVS Bệ nh virus M khoai tây Potato Virus M-PVM Bệ nh cuố n lá khoai tây Potato Leafroll Virus- PLRV Bệ nh khả m Aucuba Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV Dưa chuộ t Bệ nh khả m dưa chuộ t Cucumber Mosaic Virus- CMV 5 2.1.3 Biệ n phá p phò ng chố ng Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng tr bệnh virus hại thực vật đã được áp dng như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh cây trồng, dng giống sạch bệnh hoc giống chống bệnh, chịu bệnh. Dựa vào đc đim của tng loại virus gây hại và đc tnh cây trồng, người ta đã đề ra nhng biện pháp phòng tr cho tng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại của nguồn bệnh. 2.1.3.1 Sử dụng giống cây trồ ng có khả năng kháng bệnh virus Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhim môi trường và tạo được cây sạch bệnh. Tuy nhiên biệ n phá p g p nhiều hạn chế về số lượng giống kháng bệnh cũng như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phc v cho cho công tác lai tạo giống. Hơn na, năng suất và chất lượng của giống kháng cũng là điều đáng lưu tâm vì rất khó tích hợp được nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng. 2.1.3.2 Sử dụng hạ t, giống cây trồ ng sạch bệnh S dng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng nhất đ hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Có th tạo nguồn hạt giống, củ, cây giống sạch bệnh bằng nhng biện pháp như x lý củ/hạt bằng nhiệt hoc hóa chất hoc nhân giống in vitro tạo củ hoc cây con sạch bệnh. Nhược đim của biện pháp này là cá c loạ i cây trồ ng có thể bị nhiễ m virus trong quá trì nh canh tá c trên đồ ng ruộ ng. 2.1.3.3 Biệ n phá p canh tá c Luân canh và xen canh có th giảm bớt thiệt hại do sâu bệnh gây ra so với trồng thuần một loại cây trồng . Mặ t hạ n chế củ a biệ n phá p nà y là rấ t khó chọ n đượ c hệ thố ng luân canh và xen canh vừ a có hiệ u quả đố i vớ i mộ t số bệ nh quan trọng mà vẫn đem lại lợi ch cao về mt kinh tế . Ma v thch hợp giúp giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra mà còn giúp gia tăng năng suất rất đáng k . Gieo trồng tránh mùa phát trin của côn trùng trung gian truyền bệnh (còn gọi là né bệnh) có th hạn chế được một phần thiệt hại do virus gây ra. 6 2.1.3.4 Kim soát côn trng trung gian truyn bệnh v loại b các loại k chủ trung gian nhƣ c dại ,… Hiện nay phổ biến nhất là dung các loại thuốc tr sâu và diệt cỏ đ hạn chế các trung gian này. Tuy nhiên, nhiề u loạ i virus như TMV lây truyề n qua đườ ng cơ giớ i, virus lây lan trự c tiế p qua khí khổ ng hoặ c vế t thương trên vậ t chủ . Hơn nữ a, việ c lạ m dụ ng thuố c trừ sâu có thể gây ô nhiễ m môi trườ ng, gây nguy hiể m cho nông dân và ngườ i tiêu dù ng . Bên cạ nh đó , virus có thể đượ c lây nhiễ m vớ i số lượ ng rấ t í t môi giớ i truyề n bệ nh , v d: chỉ cần 1 con rầ y nâu / cây lú a đã có thể truyề n virus lù n lú a cỏ (RGSV). 2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua một số virus đã có th kim soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyn gen mang các gen hoc đoạn gen có nguồn gốc t chính các virus gây bệnh (Reddy el al., 2009). Các cấu trúc gen có nguồn gốc t virus gây bệnh được s dng chuyn vào cây trồng đ tạo tính kháng có th là các loại khác nhau như: các cấu trúc của vius theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) (Yin et al., 2005) và các miRNA nhân tạo có đch là các trình tự gen của virus gây bệnh (Niu et la., 2006; Qu và Fang, 2008). Thành công trong việc ứng dng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus được đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi nhng cây thuốc lá chuyn gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biu hiện tính kháng với virus này (Beachy, 1990; Register và Nelson, 1992). Sau đó Beachy và cộng sự đã phát trin nhng thí nghiệm của mình thành phương pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phương pháp này đã được áp dng tạo nhng dòng cây chuyn gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm (xem tổng quan của Hull và Davies, 1992). Tuy vậy, các cây chuyn gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyn vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát trin các giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do độ đa dạng của virus thường khá cao (Scholthof et al., 1993). Tương tự như phương pháp CP, biu hiện gen mã hóa cho enzyme liên quan tới quá trình tự sao chép hoc sao mã (các replicase) cũng có th tạo các cây chuyn gen kháng virus. Cũng nghiên cứu trên 7 đối tượng TMV, Carr và cộng sự nhận thấy nhng dòng thuốc lá mang gen mã hóa cho replicase có khối lượng phân t là 183kDa hoc 54kDa có khả năng kháng TMV tốt hơn nhng dòng cây chuyn gen CP. Biu hiện replicase của virus khoai tây X (potato virus X: PVX) hay virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus: CMV) chứng minh hiệu quả bảo vệ thực vật của phương pháp này (Braun và Hemenway, 1992; Anderson và cộng sự, 1992). Tuy vậy, tương tự như phương pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase cũng chỉ có tác dng trên tng chủng virus. Hơn na, gen mã hóa cho các replicase thường rất lớn, gây trở ngại khi biu hiện trên thực vật. Nhằm khắc phc nhng hạn chế của cấu trúc “dạng sense”, các cấu trúc dạng antisense mang một đoạn DNA có trình tự bổ sung với RNA của virus có th ức chế sự phiên mã với nhng trình tự RNA tương đồng đã được nghiên cứu và phát trin. Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,… kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc s dng nhng đoạn DNA thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm nhng dòng cây chuyn gen có khả năng kháng với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998). Cho tới nhng năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyn gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyn mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyn gen mang cấu trúc RNAi và kim tra tính kháng virus của các cây chuyn gen (Tenllado et al., 2004). Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyn gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chnh virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong nhng nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002), Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus 8 TMV và Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al., 2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong nhng nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lp lại đảo chiều thường được s dng đ chuyn vào cây và sẽ được biu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyn gen t đó kch thch cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Người ta đã nhận thấy rằng khi vng đệm của hpRNA được lp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001). Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyn gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tnh kháng lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyn gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kim tra) và nhng siRNA đã được phát hiện trong nhng dòng cây chuyn gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyn gen làm chậm sự tch lũy virus và làm chậm hoc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009) Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyn gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyn gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; B đao chuyn gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyn gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyn gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm đ được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyn gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyn gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyn gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyn gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyn gen kháng Sweet 9 potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy et al, 2009). 2.1.4. RNAi v cơ ch kháng bệnh bng phƣơng pháp chuyn gen virus RNAi là một cơ chế căn bản đ kim soát chui thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức min dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tương đồng của chúng. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khin sự biu hiện gen mã hóa protein. Nó được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân t RNA mạch kép trong cơ th sinh vật gây nên ức chế sự biu hiện gen của một loại trình tự đc hiệu. Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân t RNA chui kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong nhng enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân t RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide. Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có [...]... tỏ, cấu trúc chuyển gen RNAi TMV-CPi đã có mặt trong các cây chuyển gen T1 Hình 3.4 Kiểm tra sự có mặt gen TMV-CPi trong một số dòng thuốc lá chuyển gen T1 bằng phương pháp PCR WT1, WT2: cây không chuyển gen; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; TMV2.7, TMV2.18, TMV 2.6, TMV2.10, TMV2.22 : các dòng cây chuyển gen 27 3.4 Đánh giá tính kháng bệnh của các dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang cấu... RNAi mang chính đoạn gen CP đó theo cả 2 chiều xuôi-ngược rồi chuyển vào cây thuốc lá Ở thế hệ ban đầu (T0) đã thu được 17dòng cây chuyển gen có tính kháng TMV lớn hơn 90% Tiếp tục phát triển những nghiên cứu trên, đề tài đã tiến hành những nghiên cứu ở thế hệ T1 với mục đích: - Phân tí ch sư phân ly cua dong thuôc la chuyên gen TMV_RNAi ơ thê hê T1 ̣ ̉ ̀ ́ ́ ̉ ̉ ́ ̣ - Phân tí ch kha năng... dụng làm gen chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật Trong những nghiên cứu trước đây, vector RNAi TMV-CPi có bộ khung chứa gen nptII mã hóa cho gen kháng kanamycin đã được chuyển vào giống thuốc lá K326 và thu được những dòng cây T0 kháng virus Kiểm tra bằng phương pháp PCR đã cho thấy những dòng T0 này mang cả gen nptII và gen đích TMV-CPi Do vậy, đối với những dòng cây ở thế hệ T1 tiếp... copy, gen đích sẽ được di truyền theo định luận Menđen theo tỷ lệ phân ly 3:1 và có khả năng chọn lọc những dòng cây đồng hơp tử của gen đích ở thế hệ tiếp theo Chọn lọc cây đồng hợp tử nhằm tạo cơ sở gen đích được di truyền và hoạt động một cách ổn định qua nhiều thế hệ là một trong những yêu cầu quan trọng trong nghiên cứu phát triển cây chuyển gen thành giống Vì những lí do đó, trong nghiên. .. cây con (B) trên môi trường nảy mầm theo phương pháp khử trùng khí clo trong 6h 3.2 Phân tích khả năng phân ly của gen chuyển Trong qúa trình tái sinh cây chuyển gen, việc sử dụng các gen có khả năng chọn lọc đi kèm với gen đích là hết sức cần thiết nhằm tách ra được số lượng ít ỏi các tế bào chuyển gen trong vô số các tế bào không mang gen chuyển Các gen kháng các loại kháng sinh như kanamycine,... tồn tại của gen chuyển trong genome thực vật chuyển gen Trong nghiên cứu này, 9 dòng thuốc lá chuyển gen có sự phân ly tính kháng Kan theo tỷ lệ Mendel 3:1 sẽ tiếp tục được phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen chuyển TMV-Fi/TMV-Ri Để thực hiện phản ứng PCR, đầu tiên mẫu DNA tổng số từ các mẫu lá thuốc lá chuyển gen T1 được tách chiết theo phương pháp của Accotto và cộng sự (2000) Hình... 25 Cây mẫn cảm Tỷ lệ 2 test 13 TMV2.29 80 63 17 3:1 0.6 14 TMV2.30 80 58 22 3:1 0.267 15 TMV2.31 80 58 22 3:1 0.267 16 TMV2.43 80 78 2 - - 17 TMV2.44 80 79 1 - - 3.3 Xác định gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1 bằng PCR PCR là kỹ thuật phổ biến nhất để sàng lọc các dòng cây chuyển gen dương tính (Vikrant Nain, 2005) PCR sẽ kiểm tra sự tồn tại của gen chuyển trong genome... Trong khi đó, cây WT1 có 10/10 cây có biểu hiện bệnh ở mức độ trung bình đến nặng, các vết khảm loang lổ to xuất hiện trên khắp bề mặt các lá non và cây còi cọc Những cây chuyển gen có biểu hiện bệnh có thể do cây mang gen chuyển dị hợp tử, nên vẫn kháng được trên môi trường sàng lọc Kan 50mg/l nhưng không kháng được virus Còn những cây có biểu hiện kháng hoàn toàn là do mang gen chuyển đồng... chuyển đồng hợp tử T1TMV2.06-10 T1TMV2.06-6 WT1-1 T1TMV2.06-10 Hình 3.5: Biểu hiện bệnh TMV sau khi lây nhiễm nhân tạo virus TMV lần 1 3.5 Xác định sự có mặt của phân tử virus trên các dòng thuốc lá chuyển gen sau khi lây nhiễm virus nhân tạo bằng ELISA 29 RNAi trong cây chuyển gen sẽ phân hủy RNA của virus xâm nhập dẫn tới không hình thành các phân tử virus mới hoặc hàm lượng phân tử virus sẽ... khoa học công nghệ đề tài Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gen đa đoạn”, mã số KC.04.03/06-10 Lâm Đại Nhân (2000) Luận văn thạc sỹ sinh học “Thiết kế vector mang gen CP của virus đốm vòng Việt Nam PRSV nhằm tạo cây chuyển gen kháng bệnh” Lê Trần Bình (2008) Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh . tc phân tích các đc tính di truyền của gen chuyn ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứ u cá c phương phá p phân tí ch cây. Đề tài " ;Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1& quot; 1 MỞ ĐẦ U Cho