Trường ĐH Nông Lâm Tp HCM Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH CHỦ ĐỀ : GVHD: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: BÙI THỊ HỒNG GẤM MSSV: 06126031 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 1 MỤC LỤC YZ I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 2 1. Định nghĩa 2 2. Tính chất của enzyme 2 II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 3 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế enzyme 3 2. Thu nhận enzyme thô 5 III. TINH SẠCH ENZYME 6 1. Các phương pháp tủa protein/enzyme 6 2. Sự thẩm tách 8 3. Sắc ký 8 4. Phương pháp dùng chất h ấp phụ 14 IV. KẾT TINH PROTEIN ENZYEM 15 V. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME 15 1.Xây dựng đường biểu diễn về độ hòa tan 15 2. Phân tách protein/enzyme bằng điện di trên gel 16 3. Phương pháp siêu ly tâm 17 4. Kỹ thuật khối phổ 18 VI. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 18 VII. TỔNG KẾT 19 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Ðó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua tr ọng của enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men. Đến nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp, hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, glucoseoxydase, cellulase, lipase…Các chế phẩm này đã được khai thác và tinh ch ế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu việt hơn dạng tự nhiên. Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụ ng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người. TÓM TẮT Enzyme bản chất là protein được thu nhận từ ba nguồn: động vật , thực vật, vi sinh vật. Do đó rất đa dạng về cấu trúc, tính chất, chức năng…Nên việc thu nhận và tinh chế enzyme khá phức tạp vì quá trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất của từng loại enzyme mục tiêu, và phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau tùy từng loại enzyme. Tuy vậy, các quá trình tinh sạch enzyme vẫn ứng d ụng các phương pháp cơ bản sau: thu dịch chiết (cơ học, lý , hoá), tủa ( bằng muối, dung môi hữu cơ, điểm đẳng điện), thẩm tách, từng bước tinh sạch bằng sắc ký ( sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lỏng cao áp), kết tinh chế phẩm, đánh giá kết quả tinh sạch và kiểm tra hoạt tính enzyme: xây dựng đường biểu diễn về độ hoà tan, điện di (điện di một chiều, điện di dựa vào điểm đẳng điện, điện di hai chiều, điện di mao dẫn), siêu ly tâm, khối phổ, I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1. Định nghĩa Enzyme (E) là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. E có tất cả trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. (CNSH Enzyme và Ứng Dụng - Phạm Thị Trân Châu,Phan Tuấn Nghiã). Trong phản ứng E xúc tác các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất (substrate), E sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác h ữu cơ và vô cơ khác. E không chỉ có thể xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống , mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện nhất định.Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym [1]. E có tính đặc hiệu cao, nghĩa là mỗi E chỉ tác dụng trên một hay một số S (cơ chất ) nhất định ở nhiệt độ và áp suất bình thường. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 3 2. Tính chất của enzyme 1. Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein. Đa số E có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. 2. Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. 3. Không bền dưới tác dụng của nhiệt, nhiệt độ cao E bị biến tính. Môi trường axít hay bazơ cũng làm E mất khả năng hoạt động. 4. Enzym có tính lưỡng tính: Tùy pH của môi trường mà tồn tại ở các d ạng: cation, anion hay trung hòa điện. 5. Enzym chia làm hai nhóm: E một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin, amylase và các E hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phải protein).  Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu. • Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế E Như đã nói ở trên, E là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi rất không bền, có thể dễ bị biến tính (denaturation) và bị mất hoạt độ. Do đó, khi làm việc với E phải chú ý tránh làm mất hoạt tính của nó. Thông thường phần lớn E hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung tính (pH = 7+ 2). Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh đều dễ gây biến tính E. Nhiệt độ cao và các chất oxy hoá và chất khử, …cũng là một trong số những nguyên nhân gây biến tính E. Tuy nhiên các E khác nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân gây biến tính khác nhau. Vì thế, khi tách và tinh sạch E cần tiến hành ở nhiệt độ thấp từ 0 o C đến 5 o C. Đối với các E không bền quá trình tinh sạch được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn từ -5 o C đến -20 o C. Trong trường hợp này người ta sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO 2 hoặc nước đá với muối NaCl, hoặc thậm chí dùng hỗn hợp nước đá với sulfuric acid đậm đặc… Bảng 1: Hỗn hợp làm lạnh Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được Nước đá : muối 100:33 (3:1) -21,3 o C Nước đá : H 2 SO 4 đậm đặc 100:25 (4:1) -20,0 o C Tiến hành tinh sạch ở nhiệt độ thấp vừa hạn chế biến tính E cũng như tác dụng phân giải của các E proteolytic có mặt trong dịch chiết. Đối với nhiều E có thể bổ sung chất ức chế của E proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thủy phân đối với E quan tâm. Các E [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 4 proteolytic được phân thành 4 lớp: protease serin, protease cystein, protease acid, protease chứa kim loại. Trên cơ sở 4 lớp của protease này, người ta cũng chia chất ức chế của E này thành 4 lớp tương ứng. chất ức chế hai E protease serine và protease cystein được sử dụng nhiều do sự phổ biến của hai E này. Đối với một số E nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4 loại chất ức chế đều được sử dụng. Bảng 2: Một số chất ức chế E proteolytic thường dùng trong tách chiết, tinh sạch protein/E Chất ức chế Nồng độ và thời gian hiệu quả Dung môi pha dung dịch gốc và nồng độ chất ức chế Điều kiện và thời gian bảo quản ở dạng dung dịch gốc E proteolytic bị ức chế Phenyle methyl sulphonyl fluoride (PMSF) 0,1-1mM vài giờ 100mM trong ethanol hoặc isopropanol 2-3 tháng ở nhiệt độ phòng Protease serine Leupeptin 10-100μM 10mM trong H 2 O 1 tuần ở 4 o C hoặc 1 tháng ở -20 o C Protease kiểu trypsin và một số kiểu protease cystein Iodoacetic acid hay iodoacetate (IAA) 10-100μM vài giờ 100mM trong H 2 O Chỉ chuẩn bị trước khi dùng Protease cystein Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) 1-2mM, lâu dài 500mM pH 8,0 6-12 tháng ở nhiệt độ phòng Protease chứa kim loại (trừ loại chứa Ca 2+ thì phải dùng EGTA) Pepstain A 1μM vài giờ 1mM trong tanol 3-4 tháng ở -20 o C Một số protease acid Bổ sung các yếu tố làm bền (như CaCl 2 hay MgCl 2 với nồng độ 2-5mM, glycerol 10- 20% ), chất chống oxy hoá (β-mercaptoethanol hay dithiothreitol 1-5mM…). Xây dựng quy trình đơn giản cũng là cách để bảo toàn hoạt tính E. Đối với một số E bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt (70-80 o C, trong vòng 15-30 phút) và xử lý acid (pH 3-4) đối với các E bền acid nhằm hạn chế tác dụng phân cắt của proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không mong muốn. Tránh tạo bọt khí vì nhiều E sẽ biến tính ở mặt phân cách hai pha nước và khí. Để tránh bọt khí. Chỉ sử dụng các gụng cụ inox để cắt xay nguyên liệu để tránh tác dụng của kim loại nặng làm mất hoạt tính E. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 5 2. Thu nhận enzyme a . Chọn nguồn nguyên liệu Việc điều chế chúng bằng phương pháp hoá học rất khó khăn và tốn kém, nên người ta thường thu nhận chúng từ nguồn nguyên liệu sinh học. Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học:  Động vật: Tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim…dùng để tách E rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease, và một số E khác. Ví dụ : Renin tách từ dạ dày bê nghé làm đông sữa trong sản xuất fomat.  Thực vật: Thông thường E có mặt nhiều ở cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều E chuyển hoá chất ấy. Ví dụ: hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu nành có nhiều E urease, papain thu từ nhựa đu đủ xanh, bromelain thu từ các bộ phận cây dứa, fixin tách từ dịch ép của thân và lá cây Ficus… Tuy nhiên từ nguồn nguyên liệu động thực vật thì không thể sản xuất chế phẩm E với quy công nghiệp bởi các nhược điểm: - Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài - Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được - Đây là ngu ồn nguyên liệu dùng làm thực phẩm không thể dùng để sản xuất sản phẩm ảnh hưởng an ninh lương thực.  Vi sinh vật: Là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất E có nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (16-100 giờ). Hệ E vi sinh vật vô cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ. E vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng. b. Thu dịch chiết E thô Các E nội bào không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào chứa chúng. Do đó, để chiết rút E nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa E và chuyển chúng và dung dịch. Biện pháp cơ học như nghiền tế bào với cát thuỷ tinh hay cát thạch anh, làm đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá (homogenizator). Đối với mô thực vật thì ta thường thái nhỏ mẫu hoặc cho trương nước để tăng hiệu quả phá vỡ tế bào. Còn ở mô động vật khi chiết E người ta cần cắt bỏ mô liên kết. Đối với các E trong cấu tử ( nhân, microsome, ty thể, lyosome…) tế bào, để thu nhận dịch chiết E ta có thể dùng các yếu tố vật lý và hoá học khác như sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt, dùng E (lyoyme, mutanolizin), dung môi hữu cơ (butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate…), chất detergent. Các chất này có tác dụng tốt trong phá vỡ cấu tử tế bào do trong các bào quan này thường có chứa nhiều mỡ. Sau khi đã phá v ỡ cấu trúc tế bào, E được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính. * Một số lưu ý khi chiết rút E + Chiết rút và kết tủa E ở nhiệt độ thấp ( 3 - 5 o C ) [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 6 + Các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly được thêm vào để tăng hiệu quả chiết rút E như NaCl, ZnCl 2 , CaCl 2 … * Lưu ý : Các nguyên liệu động vật, thực vật thường có mặt những chất có màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch và xác định hoạt lực của E, nên ta thêm vào chất khử để loại màu. Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để tăng nồng độ E, hoặc bổ sung các tác nhân gây kết tủa protein/E để loại một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan E trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. III. TINH SẠCH ENZYME Thu nhận E dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Hỗn hợp chứa E sẽ phải trải qua nhiều công đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên đặc tính nhất định để thu được một E tinh sạch. Sau mỗi bước thu nhận ta đều phải tiến hành xác định hoạt tính và nồng độ E để đảm bảo hiệu quả tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa, màng bán dẫn, sắc ký. 1. Các phương pháp tủa protein enzyme Có nhiều phương pháp khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein/E, dùng nhiệt. Trong đó tủa bằng muối được sử dụng nhiều nhất. a. Tủa bằng muối Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out), mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ nhất định. Lượng muối có thể được loại bỏ thông qua bướ c thẩm tách. Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đó S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Hình1. Độ tan theo nồng độ muối (http://sosnick.uchicago.edu/precpsalt.html ) Khả năng tủa protein phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống. Hiệu quả tủa protein/E của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 7 Để tủa E từ dịch chiết thô ta có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese (NH 4 )2SO 4 , do nó có độ hoà tan rất cao trong nước (720g/l,nhiệt độ 25 o C), ít làm mất tác dụng E thậm chí còn có tác dụng làm bền E. Ngoài ra ammonium sulfatese có khả năng tủa chọn lọc protein, do đó giúp loại một số protein không mong muốn ra khỏi dịch chiết. Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa + Dạng bột: Người ta cho từng ít một vào dịch chiết E. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của E. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. 0,515 x V (S 2 -S 1 ) X(g) = 1-0,272S 2 + Dịch bão hòa: Cho dung dịch (NH 4 )2 SO 4 vào dịch chiết E thì độ (NH 4 )2 SO 4 không tăng dột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2h để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lâu). Kết được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọc qua phễu Buckner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca ++ làm bền (CaCl 2 hoặc Ca(COOH)2). Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian thẩm tích thường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt. Có thể loại muối bằng cách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran. Ưu thế của phương pháp này là tiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ E. Muối có trọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các E có trọng lượng phân tử lớn xuống trước. Giai đ oạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng. Chuyển trạng thái từ dịch nước đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng. Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH 4 ) 2 SO 4 bão hòa hoàn toàn, còn amylase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bão hòa của dung dịch muối này. Ðiều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH 4 ) 2 SO 4 cao hơn các muối khác. 100 ( S 1 -S 2 ) V (ml) = 1-S 2 * Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfatese + Cho muối vào dung dịch E một cách từ từ, đồng thời khuấy đều để tránh tăng nhanh cục bộ nồng độ muối dẫn đến mất tính kết tủa chọn lọc, thậm chí làm mất hoạt tính E. + Sử dụng muối ammonium sulfatese mất nhiều thời gian và cần phải ly tâm tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp để tách protein tủa. b. Tủa bằng các dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, trừ một số dung môi như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng ở nồng độ cao. Ethanol hay aceton thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi (nồng độ dung môi thường chiếm 80% (v/v) trở lên). Sau X: khối lượng (NH 4 ) 2 SO 4 S1: độ bão hoà cho trước S2: độ bão hoà cần thiết V: thể tích (NH 4 ) 2 SO 4 S1: độ bão hoà cho trước S2: độ bão hoà cần thiết [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 8 đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong không khí. Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5 o C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0 o C và có thể đến – 20 o C, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein E. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng tách dùng máy ly tâm. Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu. Ví dụ: Hình 2 : Mức tinh sạch và hiệu suất thu hồi protease có trong dịch trích từ ruột cá Basa khi sử dụng các tác nhân kết tủa khác nhau (Nghiên Cứu Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Protease Từ Ruột Cá Basa (Pangasius Bocourti)-TrầnQuốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn - Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II - Truờng Ðại Học Bách Khoa, ÐHQG-HCM) c. Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi pH của môi trường thay đổi, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. + pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). + pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H + ). + Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH. Hình 3: Tỷ lệ protein tủa theo pH (http://sosnick.uchicago.edu/precpph.html ) Phương pháp này thường dùng cho các protein [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 9 đậu nành (có pI= 4.6) d. Dùng nhiệt Ngoài ra có thể dùng nhiệt để loại bỏ các protein E tạp ra khỏi dịch chiết E. Tuy nhiên phương pháp này ít đuợc dùng vì hiếm E bền với nhiệt. 2. Sự thẩm tách Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất cóphân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích(dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch E vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các ch ất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn. 3. Sắc ký Sắc ký là phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng định lượng và định tính. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha tĩnh và pha động.Bốn phương pháp được ứng dụng nhi ều nhất trong tinh sạch E là: o Sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy) o Sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy) o Sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) o Sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy). Hình 4: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein Túi cellophane Đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M Hình5: Hai phương pháp sắc ký cơ bản A: Sắc ký trao đổi ion, dựa vào sự tích điện của protein B: Sắc ký phân loại kích thước, dựa vào kích thước protein [...]... lần, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất cũng như thu nhận E TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 1 Công Nghệ Sinh Học (tập ba) Enzyme và ứng Dụng-Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa -Chương2: Các phương pháp nghiên cứu enzyme (trang 15-28) 2 Enzyme Học – Giáo trình điện tử - http://www.ebook.edu.vn - Chương 2: Phương pháp nghiên cứu enzyme (trang 19-41) 3 Chromatographic... protein enzyme ở trạng thái tinh thể không thể được coi là tinh khiết hoàn toàn Đặc biệt là các tinh thể protein E kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein E khác Quá trình kết tinh protein E được thực hiện trong dung dịch (NH4)2SO4 Quá trình kết tinh kéo dài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tinh khiết Thường ta là thêm muối (NH4)2SO4 vào... lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng E mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng Vì vậy, mức độ tinh sạch và yield là 2 thông số để đánh giá quá trình tinh sạch Một quá trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp có... loại ra khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh V ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH ENZYME Sau khi nhận được một E ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể... hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có được làm sạch với hiệu suất cao Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch E) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làm sạch E Chất hấp phụ chủ yếu thuờng được dùng là hydroxyapatite cho hiệu quả 13 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 phân tách đặc biệt cao Hấp phụ chọn lọc enzyme. .. phụ enzyme Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC Bằng cách đổi độ pH hoặc lực ion của dung môi thích hợp, các E được hấp phụ có thể được chiết khỏi chất hấp phụ IV KẾT TINH PROTEIN ENZYME Ðây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai đoạn tinh chế cuối cùng Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trường hợp riêng biệt, ta tiến hành kết tinh. .. Kat = 6.10 7 U 1 Và 1 U = microkatal 60 VII TỔNG KẾT Để thu được một chế phẩm E tinh khiết và vẫn đảm bảo hoạt tính xúc tác, thì quá trình tách từng phần và tinh sạch E phải trải qua nhiều công đoạn khác nhau Tuỳ theo nguồn cho, loại E, mục đích sử dụng và điều kiện sẵn có mà ta lựa chọn phương pháp cũng như trật tự các phương pháp sao cho đạt hiệu tinh sạch quả tốt nhất Trong từng bước tinh sạch các... Mẫu E 10 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 urease đậu nành sau khi tinh sạch bằng phương pháp tủa phân đoạn sunfatamon qua thẩm tích đối nước và qua cột trao dổi ion DEAE – cellulose, dùng hệ đệm phosphat pH7 1/15M, gradient bằng muối NaCl nồng độ từ 0 – 1M Hình7: Sắc ký đồ trên DEAE-Cellullose Hình 8: kết quả điện di sau các bước tinh sạch Kết quả điện di cho thấy, hiệu quả tinh sạch cũng... tăng lên và đường biểu diễn có một điểm uốn Nếu trong mẫu có một protein thứ hai thì sau khi đạt được độ bão đối với protein ít hòa tan hơn, loại protein thứ hai còn có thể hòa tan nữa 14 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 Kết quả là có một điểm bão hòa thứ hai và đường biểu diễn có hai điểm uốn Nếu dịch chiết có nhiều protein E thì sẽ có nhiều điểm uốn Phương pháp này được Northrop và Kunitz... co nên sẽ ra sau cùng Hình 9: Hình minh hoạ sắc ký lọc gel 11 [Thu nhận và tinh chế enzyme] October 24, 2009 Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 dến G200 phục vụ trongviệc lọc phân tử cho phép các chất có trọng luợng phân tử khác nhau lọtvào ở các nguỡng sau đây: Các loại sephadex G 10 G 15 G 25 hạt tinh (F) hạt thô (C) G 50 hạt tinh (F) hạt thô (C) G 75 G 100 G 150 G 200 Trọng luợng phân tử 0 . enzyme 2 II. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME THÔ 3 1. Một số lưu ý khi tách chiết và tinh chế enzyme 3 2. Thu nhận enzyme thô 5 III. TINH SẠCH ENZYME 6 1. Các. năng…Nên việc thu nhận và tinh chế enzyme khá phức tạp vì quá trình tinh chế dựa vào đặc điểm cấu tạo, tính chất của từng loại enzyme mục tiêu, và phải trải