ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: CHẨN ĐỐN VIRUS PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) BẰNG KỸ THUẬT ELISA Người thực hiện: Ham Mát Mssv: 06126077 Lớp: DH06SH Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Tp Hồ Chí Minh, tháng 9/2009 I.Đặc vấn đề: Hiện thể gia súc đặc biệt thể heo, động vật gần gũi mang lại lợi ích kinh tế cho người dân xuất hội chưng rối loạn sinh sản hô hấp Đây hội chứng loại virus có tên PRRS, vấn đề đặc làm để chẩn đốn virus có tồn hay không tồn thể heo? Một phương phương pháp giới thiệu để chẩn đoán virus đò phương pháp ELISA Nội dung: Đặt vấn đề Giới thiệu hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, virus PRRS Giới thiệu kỹ thuật ELISA Phương pháp chẩn đoán PRRS kỹ thuật ELISA Kết luận Tài liệu tham khảo II.Giới thiệu hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, virus PRRS Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) bệnh virus, gây thiệt hại lớn kinh tế phát Mỹ vào năm 1987 Bệnh Nidovirales, họ Arteviridae gây Các triệu chứng thường gặp lợn mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, gây chết (đối với lợn con) biểu rối loạn hô hấp lợn lứa tuổi PPRS xếp vào nhóm B danh mục bệnh Tổ chức sức khỏe động vật giới Cho đến nay, lợn động vật mắc hội chứng Virus gây bệnh Các đại thực bào với "chân giả" có tác dụng bắt giữ tác nhân gây bệnh vi khuẩn, virus tiêu diệt chúng (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) Hiện có chủng gây bệnh Mỹ Châu Âu Các nghiên cứu phân tử cho thấy viruss gây PRRS Châu Âu Mỹ tương đồng 60% nguyên liệu di truyền (bộ gene virus) PRRS virus thuộc nhóm RNA virus (RNA mạch đơn) Virus mang gene mã hóa protein trung hịa kháng thể (ORF 5, khoảng 24-25 kDa), nucleocapsid (N protein khoảng 15kDa) Virus có khả đề kháng với nhiệt độ thấp (giữ độc lực thực phẩm bảo quản lạnh) Khi bị virus phá hủy, đại thực bào khơng cịn "chân giả", khả bắt giữ tiêu diệt tác nhân gây bệnh (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) • Phân bố bệnh Tuy phát lần vào năm 1987 Mỹ số nghiên cứu dịch tễ học cho bệnh lưu hành trước Canada Bệnh xuất Châu âu vào năm 1990 hiên lưu hành nhiều nước thuộc châu lục Các kiểm tra huyết học virus học cho thấy PRRS có mặt Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, nước vùng Ca-ri-bê Trong ngày gần đây, bệnh xuất nhiều địa phương nước ta Cũng virus khác, virus gây PPRS tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn cư trú thể liên cầu khuẩn tăng độc lực gây bệnh • Triệu chứng lâm sàng Căn vào biểu triệu chứng bệnh, người ta chia thành hai giai đoạn khác nhau: Giai đoạn biểu triệu chứng rối loạn sinh sản lợn nái giai đoạn hai biểu triệu chứng hô hấp Trong khoảng 6-12 tuần có biểu bệnh đàn lợn • Các triệu chứng giai đoạn hay triệu chứng sinh sản bao gồm: - Sốt 39-40 độ - Bỏ ăn - Mệt mỏi - Giảm tỷ lệ thụ thai số đẻ - Sảy thai (tỷ lệ đến 50% đàn bị nhiễm virus) - Giảm tiết sữa sữa hồn tồn - Thai khơ (thai gỗ), chết thai - Đẻ non - Chậm động dục không động dục trở lại - Rối loạn sinh sản kéo dài đến vài tháng • Giai đoạn biểu triệu chứng hô hấp: - Loạn hơ hấp - Lợn biểu đau thở • Các triệu chứng lợn con: - Tỷ lệ chết trước cai sữa cao - Lợn gày yếu - Bỏ ăn • Các triệu chứng thuộc giai đoạn lợn con: - "Hắt hơi" - Tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng - Gày, yếu - Phù mắt, nốt phồng rộp da - Ỉa chảy, khơng vững run, đứng chỗi chân Lợn lớn có biểu sốt nhẹ, bỏ ăn Các triệu chứng khác nhẹ Lợn đực giống có biểu giảm hưng phấn, giảm thể tích chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực nồng độ tinh trùng) • Bệnh tích * Đối với lợn nái, triệu chứng sảy thai, tăng tỷ lệ thai chết, lợn mắc bệnh thường khơng có bệnh tích đặc thù - Lợn thường mang bệnh tích rõ lợn lớn, bao gồm: -Dịch thẩm xuất đướng tiêu hóa đường hơ hấp (đặc biệt phế quản) -Phù -Thanh dịch xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc tung cách mạc -Sưng hạch bạch huyết -Da nhiều vùng có màu xanh tím III.Giới thiệu kỹ thuật ELISA • Khái niệm ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm sinh học Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể • Lịch sử phát triển -Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN, KT Trong phương pháp này, KT hay HN có gắn chất đánh dấu phóng xạ diện chúng xác định thơng qua tín hiệu phóng xạ Tuy vậy, chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm người ta nghĩ đến phương pháp tín hiệu phát khơng phải nhờ phóng xạ Khi người ta biết số loại enzyme peroxidase phản ứng với số chất định Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid phát màu Màu sinh từ phản ứng sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu thị) -Tuy nhiên, để tín hiệu sử dụng chất phóng xạ radioimmunoassay, tín hiệu màu phát phải đồng nghĩa với có mặt KT hay KN Chính vậy, giải pháp đưa enzyme gắn với KN hay KT Kỹ thuật gắn kết enzyme với KN hay KT phát triển Stratis Avrameas G.B Pierce Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide Porath phát triển phương pháp gắn KN KT bề mặt rắn (bề mặt vi phiếm hay đĩa) nhờ mà KN hay KT khơng gắn kết dễ dàng rửa trôi -Peter Perlmann Eva Engvall (Thụy Điển) với nhóm Anton Schuurs Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp đặt tên ELISA (EIA) dựa tất bước phát triển nói Phương pháp thức đời vào năm 1971 • Các phương pháp ELISA ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm bước chính: - Chuyển KN biết lên bề mặt cứng ( gọi chung đĩa) KN cố định bề mặt Nồng độ mẫu kháng nguyên dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ kháng nguyên mẫu chưa biết - Chuyển mẫu KN chưa biết vào giếng khác KN chưa biết hòa tan loại dung dịch đệm giống mẫu KN chuẩn - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) albumin huyết bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất mẫu (kể mẫu chuẩn) Bước gọi "blockin" protein huyết có tác dụng ngăn cản hấp phụ protein khác lên bề mặt đĩa - Rửa bề mặt đĩa sau chuyển kháng thể (biết trước) vào tất giếng đĩa KT kết hợp với KN cố định mà không kết hợp với protein huyết - Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp kết hợp với KT cịn dư (bước bỏ qua kháng thể dùng để phát KN gắn với enzyme) - Rửa đĩa, kháng nguyên gắn enzyme dư loại bỏ - Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng yếu tố khuyếch đại) -Nhược điểm bản: Bước cố định KN khơng có tính đặc hiệu nên protein gắn với bề mặt đĩa KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với protein khác huyết gắn kết với bề mặt đĩa Sandwich ELISA hạn chế nhược điểm Sandwich ELISA: -Phương pháp sử dụng để phát KN mẫu nghiên cứu bao gồm bước sau (quy trình thay đổi nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không gắn kết bị rửa trôi (5) Thêm KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết bị rửa trôi (8) Thêm chất Enzym biến đổi chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua xác định có mặt hàm lượng KT Các bước Sandwich ELISA: (1) Phủ đĩa KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN KN (nếu có) gắn với KT (3) kháng thể dùng để phát thêm vào kết hợp với KN (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme KT thứ cấp gắn với KT dùng để phát (5) Thêm chất Enzym làm biến đổi chất phát tín hiệu phát đo 3 ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không đánh dấu với KN (2) Đưa hỗn hợp vào giếng vi phiếm có chứa KN (3) Rửa đĩa, KT không gắn kết bị rửa trôi Lượng KN lớn, lượng KT gắn thành công với KN đĩa thấp "cạnh tranh" (4) Thêm KT thứ cấp (KT KT bước 1) KT thứ cấp gắn với enzym (5) Thêm chất Lượng enzym dư giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu -Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc cao, tín hiệu sản sinh yếu - Một số trường hợp, enzym gắn với KN KT • Ứng dụng Một số ứng dụng ELISA: - Xác định nồng độ KT huyết thanh; - Kiểm tra có mặt KN; - Phát yếu tố có khả gây dị ứng thực phẩm; - Xác định có mặt dược phẩm; - Xác định hoạt tính hợp chất sinh học IV.Phương pháp chẩn đoán PRRS kỹ thuật ELISA • Lấy mẫu - Mẫu máu - Mẫu quan: Phổi, hạch hạnh nhân, hạch bạch huyết, lách • Tiến hành chuẩn đốn -Xử lý mẫu -Thực bước kỹ thuật ELISA với kit đặc hiệu để có kết xác, tránh giảm tối đa tương dương tính giả -ngoài số kit ELISA thương mại cho phép thực chuẩn đốn phân biệt hai dịng virus châu âu châu mỹ khác biệt gen từ 0.5% - 1% -Kháng thể phát sau nhiễm 1-2 tuần: khoảng thời gian phát kháng thể khoảng tháng sau bị nhiễm -Đọc kết *Bộ kít chuẩn đốn virus V.Kết luận -Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) bệnh virus, gây thiệt hại lớn kinh tế phát Mỹ vào năm 1987 -Hiện có chủng gây bệnh Mỹ Châu Âu Các nghiên cứu phân tử cho thấy viruss gây PRRS Châu Âu Mỹ tương đồng 60% nguyên liệu di truyền (bộ gene virus) - Tiếp xúc lợn ốm lợn khỏe đường truyền lây bệnh nên bệnh lây cá thể đàn hay từ đàn sang đàn khác (nếu lợn bị bệnh chuyển đàn, chuyển trại ) Lợn mang virus giải phóng virus thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi phát khống chế bệnh - Áp dụng phương pháp phòng tránh chung loại bệnh truyền nhiễm đặc biệt bệnh virus đảm bảo vệ sinh chuồng trại, nhiệt độ chuồng nuôi, thực luân chuyển chuồng tiêu độc định kỳ, đảm bảo dinh dưỡng v.v Làm theo hướng dẫn cán thú y trường hợp nghi đàn có lợn nhiễm bệnh hay dịch sảy - Thực quy định kiểm dịch động vật việc nhập giống, tinh dịch - Kiểm tra lợn xuất, nhập chuồng thực vệ sinh thú y vận chuyển đàn -Một phương pháp chẩn đoán virus phương pháp ELISA với độ đặc hiệu độ nhạy cao nhờ dụng kit ELISA thương mại cho kết xác so với phương pháp khác VI.tài liệu tham khảo Công nghệ sinh học thú y (nhà xuất nông nghiệp tp.hcm) http://Thuvienkhoahoc.com tủ sách khoa hoc VLOS Các trang thuộc http://google.com.vn Bài giảng kỹ thuật công nghệ sinh hoc ... hô hấp lợn, virus PRRS Giới thiệu kỹ thuật ELISA Phương pháp chẩn đoán PRRS kỹ thuật ELISA Kết luận Tài liệu tham khảo II.Giới thiệu hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, virus PRRS Hội chứng... Các nghiên cứu phân tử cho thấy viruss gây PRRS Châu Âu Mỹ tương đồng 60% nguyên liệu di truyền (bộ gene virus) PRRS virus thuộc nhóm RNA virus (RNA mạch đơn) Virus mang gene mã hóa protein trung... IV.Phương pháp chẩn đoán PRRS kỹ thuật ELISA • Lấy mẫu - Mẫu máu - Mẫu quan: Phổi, hạch hạnh nhân, hạch bạch huyết, lách • Tiến hành chuẩn đốn -Xử lý mẫu -Thực bước kỹ thuật ELISA với kit đặc hiệu