Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối Nguyễn Quốc Tuấn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Hoá phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: PGS.TS. Phương Thiện Thương Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tách được 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone (CO -1) từ nụ vối. Xây dựng được phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học. Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid bằng sắc ký bản mỏng (TLC). Tìm ra được điều kiện chạy HPLC định tính chất CO-1 từ nụ và lá vối. Xác định được flavonoid toàn phần trong lá và nụ vối của một số mẫu dược liệu vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc. Xây dựng được phương pháp định lượng CO-1 bằng HPLC. Ứng dụng phương pháp xây được trong việc định lượng các mẫu lá và nụ vối thu hái ở các tỉnh phía Bắc. Keywords: Hóa học; Hóa phân tích; Cây Vối Content MỞ ĐẦU Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực. Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý như chống ung thư, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm Trong dự thảo Dược Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chưa có tiêu chí về định tính và định lượng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng. Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng dược liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu trên thị trường. Các mục tiêu của đề tài gồm có: • Phân lập được một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng flavonoid. 2 • Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây vối 1.1.1 Tên gọi - Tên tiếng Việt: Cây vối, vối nhà - Tên Latin: Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry - Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb. - Họ Sim (Myrtaceae). 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây vối là loại cây gỗ nhỡ, cao 5-10 m, có khi hơn, vỏ thân nứt nẻ, màu nâu đen. Cành nhánh có nhiều vảy, cành non tròn hay hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá đơn mọc đối, có cuống dài 1- 1,5 cm, dai, cứng, phiến lá hình trái xoan hay hình trứng, dài 8-20 cm, rộng 5-8 cm giảm nhọn ở gốc, có mũi ngắn. Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7-12 mm, xù xì, khi chín có màu tím, thể chất nạc, vị ngọt. a) Cây vối b) Nụ vối tươi b) Nụ vối khô ơ Hình 1.1: Hình ảnh Cây và Nụ vối 1.1.3 Thành phần hóa học Lá Vối chứa rất ít tanin, vết alcaloid (nhóm indolic) và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần trong đó thành phần chính là (Z)-β-ocimen, myrcen, (E)-β-ocimen. Trong lá vối có chứa flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường tự do và sterol. Vỏ cây chứa triterpen nhóm ursan là acid usolic. Nụ vối chứa nhiều flavonoid khác nhau, với nhiều thành phần đã xác định cấu trúc hóa học. 1.1.4 Tác dụng sinh học của các flavonoid trong lá và nụ vối Các flavonoid còn có khả tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ. 3 Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol. - Tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư: 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'- dimethylchalcone phân lập từ nụ vối có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thƣ với các dòng TB ung thƣ khác nhau. - Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng ức chế maltase đường ruột làm giảm đường huyết trên chuột gây bệnh tiểu đường. - Tác dụng chống oxy hóa: ức chế các enzym α-glucosidase. - Tác dụng chống Alzheimer: các flavonoid như quercetin, kaempferol, tamarixetin được phân lập từ nụ vối có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase. 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid 1.2.1 Phƣơng pháp định tính a) Phương pháp ống nghiệm Phản ứng với hơi amoniac Nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH 3 . Có thể quan sát sự biến đổi màu này bằng mắt thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại. Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda). Phản ứng do sự có mặt nhân γ-penzopyron trong đa số flavonoid. Thuốc thử là HCl đặc và bột Magie kim loại. Phản ứng bằng thuốc thử Sibata và dung dịch H 2 SO 4 đậm đặc Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài mililit H 2 SO 4 đậm đặc, sau đó cho thêm 0,1 gam Mg, tiếp theo thêm từ từ rượu isoamylic theo thành ống nghiệm. Đun nóng, có màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang đỏ cam hoặc đỏ tím [6]. Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5%. Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu xanh đen. b) phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) SKLM là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt hỗn hợp các chất cần tách . 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid a) Phương pháp cân: Ứng dụng khi nguyên liệu giàu có flavone hoặc flavonol và dịch chất ít tạp chất. b) Phƣơng pháp trắc quang Nguyên tắc: Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch phức tạo thành giữa chất cần xác định với thuốc thử vô cơ hay hữu cơ trong môi trường thích hợp khi được chiếu bởi chùm sáng. Phương trình định lượng của phép đo dựa trên định luật Lamber-Beer: A = K.C 4 Trong đó: A: Độ hấp thụ quang K: Hằng số thực nghiệm C: Nồng độ chất phân tích Phương pháp này cho phép xác định nồng độ chất ở khoảng 10 -5 – 10 -7 M và là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến. Đối với flavonoid cho tạo màu khi phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu với AlCl 3 , muối titan… Phương pháp trắc quang có độ nhạy, độ ổn định cũng như độ chính xác khá cao và là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích. c) Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nụ và lá vối nhà, Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae) được thu hái ở các địa phương khác nhau, ở các tỉnh phía Bắc. Sau đó phơi và sấy ở 50 0 C cho đến khô. Các mẫu nụ và lá vối được lưu ở Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập một flavonoid chính từ nụ vối. Tinh chế hoạt chất đạt độ tinh khiết cần thiết cho việc định tính, định lượng. - Xây dựng phương pháp định tính flavonoid từ lá và nụ vối. - Xây dựng phương pháp định lượng một flavonoid chính từ lá và nụ vối. 2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ - Cân kỹ thuật Precisa XT 620M - Cân phân tích Precisa XT 220A - Máy cất quay Buchi B481 - Tủ sấy Binder – FD 115 - Đèn tử ngoại - Hệ thống HPLC _ LC10A, hãng Shimadzu (Nhật Bản) - Máy TLC chấm mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT5, CAMAG REPROSTAR3. - Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm, hãng Shimadzu (Nhật Bản) 2.3.2 Hóa chất, dung môi 5 - Dung môi: methanol, n-hexan, ethyl acetat, toluen… dùng cho sắc ký đạt tiêu chuẩn phân tích, dung môi dùng trong chiết xuất đạt tiêu chuẩn công nghiệp được chưng cất lại trước khi dùng. - Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck). - Silica gel sắc ký cột pha thường, cỡ hạt 40-63µm (Merck). - Hóa chất: các hóa chất để làm các phản ứng định tính bằng phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang, HPLC. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối 3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm 3 lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lượng vừa đủ 0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan. Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ 3.1: 3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml). Tất cả các bình hứng đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và cô cách thủy đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g). a) Hình ảnh SKLM b) Hình ảnh chất CO-1 Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối 6 3.1.3. Xác định cấu trúc chất phân lập Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-127 0 C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập được có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hiện ở hình 3.2 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 mAU 0 100 200 34016 1457 5242 1199 1875 691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113 259 545 258 165 179 252 83 251 206 966 581 381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat Area Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1 Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1 H-NMR và 13 C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'- dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C 18 H 18 O 4 và KLPT 298 amu. Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H] + , có m/z = 299; ở [M-H] + có m/z = 297, tương ứng với khối lượng phân tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu. Công thức cấu tạo của chất CO-1 được trình bày trong hình 3.3. Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CO-1 Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 125-127 o C. Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối. 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối 3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học Bảng 3.1: Kết quả định tính flavonoid trong nụ và lá vối 3.2.2 Định tính bằng TLC 3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dược liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm các phép định tính. 7 Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách được ở nụ vối) trong MeOH (hàm lượng khoảng 1 mg/ml). b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v ) Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước =10:1:1:2 (v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v ) Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước = 7:3:1,5:1 (v:v:v) Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các vết màu đen xám khi soi dưới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H 2 SO 4 10% /ethanol và sấy ở 105 0 C, ở miền ánh sáng trắng cho các vết có màu vàng (R f =0,47) đặc trưng của flavonoid. Như vậy có thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nụ, lá vối. 3.2.3 Định tính bằng HPLC * Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xác định hàm lượng. * Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hút ra chính xác 1ml đem hòa tan định mức thành 10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi tiêm sắc ký. * Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1, thêm chính xác 1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút. Hút chính xác 0,50 ml đem pha loãng bằng methanol tới 5,00 ml để được nổng độ của CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký. 8 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 mAU 0 100 200 34016 1457 5242 1199 1875 691 2476 66 6412 2036 1009 2351 1201 15949 4250687 506 116 160 102 142 300 197 358 314 146 113 259 545 258 165 179 252 83 251 206 966 581 381 144 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat Area Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 mAU 0 20 40 60 80 1885 597620 40768 31034145292 37467 107289 68840 63088 52777 35304 1652910 5215 4829 5537 3529 77788 54358 3252 2988 5471 1672 1178 1307 425 227 61169 429 452 254 93 140 171 155 9: 341 nm, 8 nm nuvoihungyen nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat Area Sắc ký đồ của nụ vối (N) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 mAU 0 100 200 300 400 9: 341 nm, 8 nm lavoi lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat Area Sắc ký đồ của lá vối (L) Hình 3.5 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lưu t R . 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối 3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang 3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hưng yên. Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang STT 1 2 3 4 5 6 m mẫu (g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831 Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193 Số liệu thống kê SD = 0,83.10 -2 ; RSD = 4,45% Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 4,45% (< 5%). 3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.6). Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1 Nồng độ (mg/l) 12 24 36 48 72 100 A 510 (Abs) 0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332 9 y = 0.0033x + 0.0026 R 2 = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ CO-1 (mg/l) Độ hấp thụ quang Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1 Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ của chất đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 0.0033x + 0.0026 với hệ số tương quan R 2 = 0.9990. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy là S y = 0,00366 và S A = 5,04.10 -5 ; S B = 0,0028. Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571 phƣơng trình hồi quy đầy đủ: y = (0,0033 ± 1,30.10 -4 )x + (0,0026± 0,0072) Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là 45, 90, 180, 360 và 450 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.7). Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin Nồng độ (mg/l) 45 90 180 360 450 Độ hấp thụ quang A 510 (Abs) 0,107 0,214 0,457 0,890 1,091 y = 0.0024x + 0.0022 R 2 = 0.9993 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 100 200 300 400 500 Nồng độ Catechin (mg/l) Độ hấp thụ quang Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ của chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 0,0024x + 0,002 với hệ số tương quan R 2 = 0.9993. Tra bảng được t(0,95; 4) = 2,776. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 ta tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy như sau: S y = 0,01289 và S a = 3,70.10 -5 ; S b = 0,01013. Phƣơng trình hồi quy đầy đủ là: y = (0,0024 ± 1,07.10 -4 )x + (0,002 ± 0,0028) 3.3.1.4 Giới hạn phƣơng pháp. a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ: 10 Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng cách lấy vào 10 bình định mức cỡ 10 ml: Cho vào bình có chứa sẵn khoảng 4 ml nước cất + 0,3 ml NaNO 2 5% + 0,3 ml AlCl 3 10% + 2 ml NaOH 1M sau đó định mức bằng nước cất hai lần, sau khoảng 10 phút thì đem đi đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên ở bước sóng 510 nm (với dung dịch so sánh là nước cất) ta thu được kết quả như trong bảng 3.7. Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004 Kết quả trên ta tính được giá trị trung bình: O A = 0,0026 Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,843.10 -3 Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối chiếu: LOD = 3. Y S b = 3. 3 0,843.10 0,0033  = 0,77 mg/l LOQ = 10. Y S b = 10. 3 0,843.10 0,0033  = 2,55 mg/l Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn: LOD = 3. Y S b = 3. 3 0,843.10 0,0024  = 1,05 mg/l LOQ = 10. Y S b = 10. 3 0,843.10 0,0024  = 3,51 mg/l b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên của đường chuẩn cho đến khi tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không còn tuyến tính nữa. Đối với chất đối chiếu CO-1: Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1 Nồng độ CO-1 (mg/l) 48 72 100 110 120 130 A 510 0,160 0,231 0,332 0,351 0,376 0,381 [...]... 1,650 Hm lng flavonoid ton phn xỏc nh theo cht chun CO-1: Trong cỏc mu lỏ vi trong khong 15,443 22,418 mg/g Trong n vi khong t 25,791 30,995 mg/g Hm lng flavonoid ton phn xỏc nh theo cht chun catechin: Trong cỏc mu lỏ vi trong khong 20,728 30,331 mg/g Trong n vi khong t 34,978 42,114 mg/g Qua bng 3.10 nhn thy hm lng flavonoid ton phn trong n vi cao hn so vi hm lng flavonoid ton phn trong lỏ vi 3.3.2... qu nh lng flavonoid ton phn trong n v lỏ vi Hm lng flavonoid ton phn trong n v lỏ vi c tớnh theo khi lng cht chun catechin (g) v cht i chiu CO-1 (g) c tớnh trong 1 g khi lng mu dc liu khụ tuyt i Giỏ tr kt qu ca hm lng flavonoid ton phn c lm lp li 3 ln v kt qu bng 3.12 c biu din : m SD Bng 3.10 : Kt qu xỏc nh flavonoid ton phn STT Tờn mu (ni thu hỏi) mmu (g) Hm lng Hm lng flavonoid ton phn flavonoid. .. lng CO-1 trong lỏ vi nm trong khong 0,43 - 0,49%, thp hn nhiu so vi hm lng trong n vi trong khong 1,32 1,86% Kt qu nghiờn cu ny gi ý cho vic xõy dng tiờu chun cho dc liu n v lỏ vi kim nghim cht lng dc liu vi s dng cho y hc c truyn 17 KT LUN 1 ó phõn lp c mt flavonoid chớnh (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone) trong n vi lm cht i chiu trong xõy dng phng phỏp nh tớnh, nh lng flavonoid. .. tớnh, nh lng flavonoid Xỏc nh c tinh khit ca flavonoid chớnh bng HPLC (98,21%) 2 ó xõy dng c phng phỏp nh tớnh flavonoid trong n v lỏ vi bng cỏc phn ng húa hc, sc ký bn mng (TLC), sc ký lng hiu nng cao (HPLC) ó a ra cỏc phn ng nh tớnh flavonoid trong n v lỏ vi gm: phn ng vi cỏc thuc th NH3, NaOH, (Mg + HCl), v FeCl3 Tỡm ra c h dung mụi nh tớnh flavonoid trong sc ký bn mng (TLC) gm: H 1: n-Hexan : EtOAc... nh ca phng phỏp phự hp ó xỏc nh c hm lng flavonoid ton phn trong 14 mu n v lỏ vi thu hỏi cỏc tnh min bc Vit Nam Kt qu cho bit hm lng trong cỏc mu n l 25,791 30,995 mg/g, mu lỏ 15,443 22,418 mg/g (tớnh theo cht i chiu CO-1) Tớnh theo cht chun catechin : mu n l 34,978 42,114 mg/g, mu lỏ 20,728 30,331 mg/g Kt qu ó ỏnh giỏ c hm lng flavonoid trong n vi cao hn trong lỏ vi cú ý ngha thng kờ b) Bng sc... (v:v:v) nh tớnh c flavonoid chớnh bng HPLC thụng qua thi gian lu (tR = 9,3 phỳt) v so sỏnh vi cht i chiu CO-1 c tỏch t n vi 3 Xõy dng c phng phỏp nh lng flavonoid: a) Bng phng phỏp trc quang Xõy dng c phng phỏp nh lng flavonoid ton phn theo cht i chiu CO1 (c tỏch t n vi) v theo catechin Xỏc nh c khong tuyn tớnh v ng chun xỏc nh lng flavonoid l ; Gii hn phỏt hin v gii hn nh lng ca phộp o nm trong khong LOD... (HPLC) a ra c iu kin, dung mụi phự hp chy sc ký trong vic nh lng flavonoid chớnh trong n v lỏ vi Xỏc nh c khong tuyn tớnh (0,1 275 g/ml) v lp ng chun ca flavonoid Xỏc nh c gii hn phỏt hin (LOD = 0,031 g/ml) v gii hn nh lng ca phộp o (LOQ = 0,1023 g/ml) ỏnh giỏ c sai s v lp li ca phộp o 18 ó xỏc nh c hm lng ca 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone trong mt s mu lỏ (4,3272 4,7924 mg/g) v n... mt s hp cht t n v hoa cõy vi (Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry) Ngh An Tp chớ Dc hc 405, tr 44-46 19 T Th Tho, giỏo trỡnh mụn hc, Thng kờ trong húa phõn tớch, i hc Khoa hc T Nhiờn-HQGHN 20 Trn Quang Vinh (2009), S thay i hm lng flavonoid trong lỏ ca cõy chựm ngõy (Moringa oleifera Lam.) theo cỏc giai on phỏt trin, Lun vn thc s Trng i hc hoa Khc T Nhiờn - HQG HCM 21 Vin Dc liu (2008), Chit... Chun-Lin Ye, Yan-Hua Lu, Dong-Zhi Wei (2004), Flavonoids from Cleistocalyx operculatus, Phytochemistry 65(4), pp 445447 32 C-L Ye, Y-H Lu, X-D Li, D-Z Wei (2005), HPLC analysis of a bioactive Chalcone and tritecpence in the buds of Cleistocalys operculatus South African Journal of Botany, 71 (3&4) pp 312-315 33 Dao Trong Tuan et al (2010), C-Methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus and their... gia, Thm nh phng phỏp trong phõn tớch húa hc v vi sinh vt, NXB khoa hc v k thut H ni II Ting anh 25 Arvouet A., B Vennat, A Pourrat and Legret (1994), Sandardisation of an extract of Propolis and identification of the major compounds, J Pharm Belgg., Vol 49 pp 462-468 26 Brỏs H de Oliveira , Tomoe Nakashima ,Josộ D de Souza Filho and Fabiano L Frehse (2001), HPLC Analysis of Flavonoids in Eupatorium . chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lượng flavonoid. 2 • Xây dựng được quy trình định tính và định lượng flavonoid trong. định lượng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối. 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối 3.2.1 Định tính bằng phản