Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật Trần Thị Linh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS. Lê Như Kiểu Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón. Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu. Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp). Keywords: Vi sinh vật học; Vi khuẩn Azotobacter; Sản xuất phân bón; Phân bón hữu cơ Content MỞ ĐẦU Một thực trạng chúng ta đang thấy hiện nay là sự lạm dụng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật đã làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng nông sản và cũng là nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hóa đất canh tác. Các sản phẩm hóa học này đã để lại những tồn dư của chúng và đang được tích lũy trong hệ sinh thái, trở thành mối hiểm họa nghiêm trọng đe dọa sức khỏe của con người và môi trường sống. Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật (HCVSV) là giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới cũng như ở Việt Nam đang hướng đến. Đất nước ta có nền kinh tế nông nghiệp là chủ yếu thì việc quan tâm đến năng suất và chất lượng nông sản là mục tiêu hàng đầu vì không những giúp nâng cao đời sống của nông dân mà còn thúc đẩy sự phát triển nền kinh tế quốc gia. Phân bón HCVSV (hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định. Phân bón HCVSV góp phần nâng cao năng suất cây trồng và chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ, đóng góp quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông, lâm nghiệp bền 2 vững. Vì vậy, nghiên cứu và sử dụng nguồn dinh dưỡng tạo ra từ các hoạt động sống của vi sinh vật đã và đang được nhiều nước trên thế giới quan tâm và phát triển. Bên cạnh các sản phẩm phân HCVSV đơn chủng đã được nghiên cứu và sử dụng hiệu quả như: Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin, Azotobacterin một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón tổng hợp bao gồm các nhóm cố định nitơ, phân giải photphat, kích thích sinh trưởng thực vật, đối kháng vi sinh vật gây bệnh (chế phẩm EM, vi sinh vật tổng hợp) có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ. Nhiều kết quả nghiên cứu về phân bón HCVSV đã khẳng định, hiệu quả của phân HCVSV phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với vi sinh vật có sẵn trong đất và khả năng thích ứng với điều kiện môi trường đất của các vi sinh vật sử dụng trong phân bón [13], [14], [15]. Phân vi sinh vật đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các vi sinh vật sử dụng có nhiều hoạt tính sinh học. Azotobacter là nhóm có phổ phân bố khá rộng. Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra nhiều đặc tính quý của Azotobacter như khả năng cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng, đối kháng, sinh polyshacarit v.v. [5], [12]. Để sản xuất phân bón HCVSV tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, đa hoạt tính, khả năng tồn tại lớn. Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là việc làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật [11]. Đây là đề tài nghiên cứu mà chúng tôi đang hướng tới. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn các chủng Azotobacter có hoạt tính sinh học cao (cố định nitơ, kích thích sinh trưởng và đối kháng bệnh héo xanh) để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh cho cây lạc. Nội dung nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter từ đất canh tác. - Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter thích hợp để sản xuất phân bón. - Phân loại và mức độ an toàn của các chủng vi sinh vật nghiên cứu - Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp các chủng Azotobacter lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây lạc (thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng diện hẹp). 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Azotobacter 1.1.1. Đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của Azotobacter. Họ Azotobacteraceae gồm 2 chi Azotobacter (Beijerinck, 1901) và Azomonas (Winogradsky, 1938). Azotobacter được phân lập lần đầu tiên vào năm 1901. Đó là loài Azotobacter chroococcum, về sau người ta tìm thấy nhiều loài khác trong chi Azotobacter (beijerinskii, vinelandii, agllis). Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất, hiếu khí, không sinh bào tử, Gram âm. Khi còn non tế bào thường có dạng hình que, kích thước khoảng 2,0- 7,0 × 10- 2,5 μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành từng đôi chồng chất, tế bào nhuộm màu đồng đều, có khả năng di động nhờ tiên mao mọc khắp cơ thể (chu mao). Khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại trông giống như hình cầu. Nguyên sinh chất xuất hiện nhiều hạt lổn nhổn. Đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan sát dưới kính hiển vi ta còn thấy khi già tế bào Azotobacter được bao bọc bởi một vỏ nhầy khá dày. Vỏ nhầy của vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % là chất hiđrit của axit uronic và chứa khoảng 0,023 % nitơ. Lượng ADN trong tế bào Azotobacter thường thấp hơn so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%) [4]. Azotobacter có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn thức ăn cacbon. Chúng cũng cần nhiều nguyên tố khoáng, đặc biệt là 2 nguyên tố vi lượng bor (B) và molipden (Mo)(Mo cần cho quá trình cố định nitơ). Khi sống trong điều kiện không có nitơ, Azotobacter sẽ dùng nitơ của không khí để biến thành nitơ của cơ thể sống. Khi sống trong môi trường đủ thức ăn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không có. Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Khi nuôi trong môi trường thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan, lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không làm nhuộm màu môi trường. Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng. 4 1.1.2. Nguồn dinh dƣỡng Nguồn cacbon Cacbon chiếm tỷ lệ trên 50% vật chất khô của vi sinh vật. Cacbon là yếu tố đặc biệt quan trọng trong cấu trúc tất cả các hợp chất có mặt trong tế bào. Hợp chất cacbon là nguồn năng lượng quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật. Trong tự nhiên có hai dạng hợp chất cacbon cơ bản là: Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ. Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn cacbon không giống nhau. Tuỳ theo nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO 2 , NaHCO 3 , CaCO 3 …) hoặc hữu cơ Nguồn nitơ Nguồn dinh dưỡng nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật. Nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH 3 và NH 4 + . Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Sau khi vi sinh vật sử dụng hết gốc NO 3 - các ion kim loại còn lại: K + , Na + , Mg 2+ ,… làm kiềm hoá môi trường. Để tránh hiện tượng này người ta sử dụng muối NH 4 NO 3 làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Tuy nhiên gốc NH 4 + thường bị hấp thụ nhanh rồi mới hấp thụ đến gốc NO 3 - Nguồn khoáng Ngoài các chất hữu cơ, vô cơ, nước v.v… trong tế bào vi sinh vật còn chứa nhiều chất khoáng. Lượng chất khoáng trong tế bào thường thay đổi tuỳ loài, tuỳ từng giai đoạn và điều kiện sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật. Mỗi nguyên tố đều có tác dụng nhất định đối với sinh trưởng, phát triển của tế bào mà các nguyên tố khác không thể thay thế được Chất sinh trưởng Muốn phát triển bình thường vi sinh vật không những đòi hỏi phải được cung cấp đầy đủ protein, lipit, gluxit, muối khoáng… mà còn cần tới các chất sinh trưởng. 1.1.3. Ảnh hƣởng các nhân tố sinh thái đến sinh trƣởng và phát triển của Azotobacter. 1.2. Sự phân bố của Azotobacter trong đất. Đất là môi trường thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật. Trong thành phần sinh vật đất, vi sinh vật chiếm tới 90%. Trong thành phần cacbon hữu cơ của đất, vi sinh vật chiếm khoảng 2%. Số lượng vi sinh vật trong mỗi gam đất có tới hàng triệu, hàng tỉ và tới vài chục tỉ tế bào. Vi khuẩn là nhóm chiếm số lượng lớn nhất trong đất (10 6 – 10 10 tế bào/gam đất) nhưng vì kích thước nhỏ (khoảng 1µm) nên chúng chỉ chiếm không quá 20% trọng lượng của vi sinh vật trong đất [23], [29]. 5 1.3. Khả năng cố định nitơ của Azotobacter 1.3.1. Quá trình cố định nitơ sinh học Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử là một bí ẩn đầy hấp dẫn của tự nhiên. Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N 2 thành NH 3 có xúc tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP N 2 + AH 2 + ATP nitrogenaza NH 3 + A + ADP +P Năm 1992 các nhà khoa học đã hoàn thiện được cơ chế của quátrình cố định nitơ phân tử như sau [4] N = N NH = NH H 2 N-NH 2 NH 3 N 2 + 8H + + 8e - + 16 Mg.ATP + 16º nitrogenaza 2NH 3 + H 2 +16 Mg.ADP + 16P 1.3.2. Vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter Azotobacter có tác dụng tăng cường thức ăn nitơ cung cấp cho cây trồng. Trung bình khi tiêu thụ hết 1g các chất sinh năng lượng, Azotobacter có khả năng đồng hoá được khoảng 10 – 15 mg nitơ phân tử [4]. 1.4. Khả năng kích thích sinh trƣởng của Azotobacter. 1.4.1. Chất kích thích sinh trƣởng ở thực vật. Các chất kích thích sinh trưởng của thực vật là những chất ở nồng độ sinh lí có tác dụng kích thích quá trình sinh trưởng của cây. Các chất kích thích sinh trưởng thực vật gồm có các nhóm chất: auxin, gibberellin, cytokinin. 1.4.2. Vi khuẩn sinh AIA: Azotobacter AIA là một hợp chất hóa học có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật. Để điều chế ra AIA có nhiều con đường, trong đó chúng ta có thể sử dụng các vi sinh vật tổng hợp AIA. Đặc điểm nổi bật của con đường này, rẻ tiền nhưng vẫn cho hiệu quả khá cao. 1.5. Tính kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum. 1.5.1. Vi khuẩn R.solanacearum Là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên 200 loài cây cỏ. Halted đã nghiên cứu bệnh này vào năm 1982, đến năm 1986 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả, định tên R.solanacearum. Ở Việt Nam bệnh do vi khuẩn R.solanacearum còn được gọi là bệnh héo xanh, héo rũ. Những 6 năm sau đó, bệnh héo xanh được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu và nghiên cứu một cách toàn diện [26], [25], [8]. 1.5.2. Tính kháng R.solanacearum của Azotobacter Thực tế cho thấy chỉ cần sử dụng thuốc hoá học, con người có thể kiểm soát được hầu hết sâu, bệnh hại cây trồng. Biện pháp này giữ vị trí khá quan trọng trong phòng trừ dịch hại cây trồng. Vì vậy, việc phòng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hoá học ở nhiều nước đã bị lạm dụng, có khi còn khá tuỳ tiện. Dẫn tới sâu bệnh hại có chiều hướng gia tăng bởi vì chúng đã quen dần với thuốc hoá học, bên cạnh đó năng suất cây trồng đã không thể tăng lên được nữa mà bị chững lại [31]. 1.6. Chế phẩm phân bón chứa Azotobacter và hiệu quả trong trồng trọt trong những nghiên cứu ban đầu. Hoạt động của vi sinh vật có ích giúp đẩy nhanh quá trình khoáng hóa các hợp chất hữu cơ trong đất, nâng cao độ phì nhiêu của đất, phù hợp với mọi loại đất. Đặc biệt là làm tăng độ mùn, cung cấp các chất dinh dưỡng và giúp cải tạo đất xám, đất xám bạc màu, đất phèn. Khắc phục hiện tượng chai đất do sử dụng phân bón hóa học lâu ngày, giúp cho đất tơi xốp màu mỡ trở lại. Bảo vệ đất chống rửa trôi xói mòn. Cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết giúp cho cây tăng trưởng, phát triển khỏe mạnh, có khả năng chống chịu tốt với sâu bệnh, nâng cao năng suất cây trồng. Cung cấp các hệ vi sinh vật có ích, khả năng thích ứng cao, cải tạo đất đồng thời có thể kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật gây hại từ đó làm giảm mầm mống sâu bệnh (nấm, mốc ). Bên cạnh đó một số chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hoạt chất có tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển nhanh, tốt, hạn chế sâu bệnh. Giúp bộ rễ phát triển nhanh, sâu rộng, chắc khỏe, nâng cao năng suất, sản lượng cho cây trồng. 1.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh vật ở trong nƣớc và ngoài nƣớc. Ở trong nước Chiến lược an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng là sử dụng cân đối phân bón hoá học và phân bón sinh học cho cây trồng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện đất đai, khí hậu, trong đó phân bón sinh học có vai trò vô cùng quan trọng Trên thế giới Ðến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất chế phẩm vi sinh vật theo nhiều hướng, nhiều dạng khác nhau. Phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên, kinh tế xã hội, khoa học công nghệ 7 và trình độ dân trí của mỗi nước. Nhưng tất cả đều sản xuất theo hướng tiện cho người sử dụng và cho hiệu quả kinh tế cao nhất. Ưu điểm Tăng năng suất cây trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ô nhiễm của hàm lượng NO 3 . Cải tạo đất, trả lại độ phì nhiêu cho đất bằng cách làm tăng hàm lượng photpho và kali dễ tan trong đất canh tác. Giá thành hạ. Nhược điểm Phân bón có hiệu quả chậm. Điều kiện bảo quản nghiêm ngặt. Phân bón HCVSV thường chỉ phát huy tác dụng trong những điều kiện đất đai và khí hậu thích hợp. Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu đất và vi sinh vật. Các chủng Azotobacter phân lập từ những khu vực đất phù sa sông Hồng chuyên canh rau màu tại một số địa điểm quanh Hà Nội và đất trồng lúa tại Xuân Mai – Hà Nội. 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã sử dụng các dụng cụ và hóa chất của Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ Nhưỡng Nông Hóa. 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Lấy mẫu đất Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995: 2.2.2. Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật 2.2.3. Xác định khả năng sinh tổng hợp AIA của vi sinh vật 2.2.4. Xác định khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh 8 Phương pháp xác định hoạt tinh đối kháng của vi sinh vật với vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum [10TCN 867:2006] 2.2.5. Xác định tên vi sinh vật 2.2.6. Thí nghiệm ở quy mô nhà lƣới và đồng ruộng diện hẹp với cây lạc. Phương pháp bố trí thí nghiệm ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng diện hẹp theo 10TCN 216-2003. Thời gian theo dõi thí nghiệm là một chu kỳ sinh trưởng phát triển của cây trồng (từ khi gieo trồng cho đến khi thu hoạch xong). Số liệu nghiên cứu được xử lý Microsoft Exel 2003 và phần mềm IRRISTAT. Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Azotobacter hữu hiệu Thu được 25 mẫu đất từ những khu vực trồng lúa tại Xuân Mai và khu vực trồng rau màu tại đất phù sa sông Hồng ở Hà Nội. Trước khi phân lập, mẫu lấy về đem hong khô ở nhiệt độ phòng để tăng tính chọn lọc. Việc hong khô đất là rất cần thiết vì các chủng phân lập từ đất khô có khả năng tồn tại tốt hơn trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau một thời gian dài bảo quản và dễ bị nhầm với Azomonas, một loại vi khuẩn cũng cố định nitơ, có hình dạng giống Azotobacter nhưng không hình thành bào nang [5]. Từ 25 mẫu đất này, đã phân lập được 09 chủng Azotobacter với đặc điểm hình thái khuẩn lạc được tổng hợp tại bảng sau: 3.1.1. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng cố định nitơ Các chủng vi khuẩn Azotobacter được cấy truyền trên môi trường Ashby để xác định thuần chủng và ổn định hoạt tính sinh học. Sau đó đánh giá lại khả năng cố định nitơ tự do dựa vào phản ứng màu Nessler. Kết quả ở hình 3.2. Kết quả ở hình 3.2 cho thấy cả 09 chủng đều có phản ứng màu với thuốc thử Nessler. Trong đó, chủng AT10 có phản ứng mạnh nhất với thuốc thử Nessler, sau đó lần lượt là các chủng AT4, AT7, AT2, AT6, AT9 và cuối cùng là 3 chủng AT1, AT3, AT8. Để xác định hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter mới phân lập được, 06 chủng AT10, AT4, AT7, AT2, AT6 và AT9 được cấy vào môi trường bán lỏng AT ở 30 0 C trong 24 giờ, sau đó xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. Kết quả đo hoạt tính khử axetylen của từng chủng được thể hiện ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1. 9 Như vậy, kết quả thử phản ứng màu của các chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler hoàn toàn phù hợp với kết quả xác định hoạt tính khử axetylen trên máy sắc ký khí. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các chủng Azotobacter đều có khả năng cố định nitơ. Khả năng hình thành etylen đạt từ 1071,6 đến 4345,6 mol/ml/ngày. Trong đó chủng AT10 có khả năng cố định nitơ cao nhất, đạt 4345,6 mol/ml/ngày. Các chủng này được chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu sau. 3.1.2. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh tổng hợp AIA . Từ 09 chủng vi khuẩn phân lập được, đã tiếp tục tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp AIA, dựa vào phản ứng với thuốc thử Salkowski. Kết quả ở hình 3.3. Kết quả hình 3.3 cho thấy cả 09 chủng đều phản ứng màu với thuốc thử Salkowski. Dễ dàng nhận thấy, các chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 có phản ứng mạnh với thuốc thử. Để xác định hoạt tính sinh tổng hợp AIA thô của các chủng Azotobacter mới phân lập, 06 chủng AT10, AT9, AT1, AT7 và AT2 được nuôi cấy trong điều kiện kị ánh sáng, trên máy lắc tốc độ 150 vòng / phút ở 30 o C trên môi trường nuôi cấy AT có bổ sung trytophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi lượng AIA sinh ra theo thời gian là: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày. Sau đó xác định hàm lượng AIA thô sinh ra bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530nm với đồ thị chuẩn AIA. Kết quả thể hiện tại bảng 3.3 và biểu đồ 3.2. 3.1.3. Tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh Từ các chủng vi khuẩn phân lập được, đã tiếp tục tuyển chọn các chủng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh. Kết quả thu được 03 chủng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh, đó là : AT2, AT7, AT10. Bảng 3.5: Hoạt tính sinh học của các chủng Azotobacter lựa chọn Ký hiệu chủng Cố định nitơ (nmol etylen/ml/ngày) Sinh AIA (  gAIA/ml) Ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc (vòng vô khuẩn D-d, mm) AT2 2148,7 430 28 10 AT4 3281,6 39 - AT7 2706,2 280 26 AT9 1071,6 410 - AT10 4345,6 317 + Ghi chú: (+): Vòng phân giải nhỏ (< 0,1 cm) (-): Không có hoạt tính 3.2. Lựa chọn tổ hợp chủng Azotobacter để sản xuất chế phẩm Qua các thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học của 09 chủng Azotobacter phân lập được, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn các chủng Azotobacter tối ưu nhất để sản xuất phân bón HCVSV là: AT2, AT4, AT7, AT9 và AT10. 3.2.1 . Mối quan hệ của các chủng lựa chọn Đã tiến hành xác định mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn lựa chọn theo phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu. Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường dịch thể Ba chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy riêng rẽ và hỗn hợp trên môi trường dịch đặc hiệu. Sau 48 giờ đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng theo phương pháp đã nêu ở trên. Khả năng sinh trưởng và phát triển của tổ hợp chủng lựa chọn trong chất mang Ba chủng vi khuẩn lựa chọn được cấy theo tỷ lệ 1% vào các túi than bùn đã khử trùng. Nuôi ở 30 0 C, tiến hành kiểm tra mật độ tế bào các chủng sau 15, 30 và 45 ngày. Kết quả ở bảng 3.8 ỗn hợp và riêng rẽ trong điều kiện cơ chất vô trùng đều tăng trong 15 ngày đầu. Sau 30 ngày mật độ tế bào của các chủng lựa chọn giảm dần. Tốc độ giảm mật độ tế bào khi nuôi riêng rẽ nhanh hơn so với khi nuôi hỗn hợp. 3.2.1. Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi cấy ở dạng riêng rẽ và hỗn hợp trong dịch thể và trong chất mang Hoạt tính của các chủng được kiểm tra sau 2 ngày nuôi cấy, còn trong cơ chất khử trùng thì được kiểm tra sau 15 ngày. [...]... R.solanacearum, vòng phân giải ức chế đạt 26 – 28mm Đây là một đặc tính quý, có tính ứng dụng thực tiễn trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh rất cao 3 Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 đảm bảo an toàn sinh học, thích hợp với điều kiện sản xuất chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh vật và điều kiện áp dụng ra đồng ruộng Vi t Nam 4 Trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiễm dịch AT2, AT7 và AT10 cho hiệu quả năng... Tiến sĩ Sinh hoc, Trường Đại học Khoa học tự nhiên 3 Nguyễn Lân Dũng (1978),Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, 2, 3, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật nông nghiệp 4 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục 5 Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Thị Minh Đức (2001), Phân lập, tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật ,... kinh tế của vi c sử dụng chế phẩm vi sinh vật cố định nitơ, kích thích sinh trưởng và đối kháng bệnh cho cây trồng References Tài liệu Tiếng Vi t 1 Ngô Thế Dân (1987), Ổn định quy trình sản xuất và sử dụng phân vi khuẩn nốt sần, Vi n Khoa học KTNN Vi t Nam 2 Bùi Thị Ngọc Dung (1999), Đặc điểm phân bố của vi sinh vật trong các hệ thống sử dụng đật chính ở 1 số vùng sinh thái nông nghiệp Vi t Nam, Luận... nghiên cứu kĩ về tất cả các vấn đề liên quan đến chế phẩm phân bón vi sinh vật Đề xuất: - Mở rộng thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp cho nhiều loại cây trồng khác nhau ở các thời vụ khác nhau và điều kiện sinh thái khác nhau - Tiếp tục thử nghiệm khả năng sử dụng phân vi sinh vật hỗn hợp trong điều kiện có bổ sung các nền phân khoáng N, P khác nhau để tìm ra được lượng phân khoáng cho phép thay thế... hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức năng cho một số cây trồng nông nghiệp, công nghiệp và lâm nghiệp”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 127-131 15 Phạm Văn Toản, Trương Hợp Tác (2004), Phân bón vi sinh vật trong nông nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp 13 16 Phạm Văn Toản (2005), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón, Nhà xuất bản nông nghiệp 17 Lê Văn Tri (1998), Chất điều hòa sinh trưởng... Phụng (1982), “Nghiên cứu về đặc điểm vi sinh vật đất trong các hệ sinh thái nông nghiệp Vi t Nam”, Tạp chí Khoa học nông nghiệp, 7, tr 294-300 10 Lê Xuân Phương (2009), Vi sinh vật học môi trường, Nhà xuất bản Đà Nẵng 11 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003), “Giáo trình công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường”, Nhà xuất bản nông nghiệp 12 Ngô Tự Thành,... Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Thu Hà (2003), “Đặc tính sinh học của một số chủng Azotobacter , Tạp chí Di truyền học ứng dụng 4 31-37 13 Phạm Văn Toản (2002), “Đề tài KHCN 02.06: Nghiên cứu áp dụng công nghệ mới nhằm mở rộng vi c sản xuất, ứng dụng phân vi sinh vật cố định đạm và phân giải lân phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững”, Hội nghị tổng kết các chương trình khoa học và công nghệ cấp Nhà nước... hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây lạc ngoài đồng ruộng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận 1 Ba chủng Azotobacter AT2, AT7 và AT10 thuộc loài Azotobacter beijerinckii Có hoạt tính cố đinh nitơ thông qua khả năng hình thành etylen đạt từ 1071,6 – 4345,6 µmol/ml/ngày Có hoạt tính sinh tổng AIA đạt tới 335µg/ml trong 7 ngày 2 Hai chủng AT2 và AT7 có khả năng ức chế vi khuẩn. .. Thị Minh Đức (2001), Phân lập, tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật , Hội thảo Quốc tế sinh học 2 144 – 148 12 6 Nguyễn Minh Hưng Và cộng sự (2007), Phân bón vi sinh vật, Nxb nông nghiệp 7 Phạm Xuân Lân (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng của 1 số loại phân hữu cơ vi sinh tới năng suất, hàm lượng NO3 của rau cải bắp và hóa tính đất trồng rau tại thị xã Hà Giang, Đại học Nông Lâm...3.3 Xác định tên các chủng lựa chọn 3.4 Đánh giá tác động của chế phẩm Azotobacter đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất của cây lạc 3.4.1 Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với cây lạc ở điều Hình 3.5: Ảnh hưởng của dịch hỗn hợp các chủng Azotobacter đến khả năng sinh trưởng phát triển và ức chế bệnh héo xanh cây lạc 3.4.2 Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm Azotobacter đối với . Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter cho sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật Trần Thị Linh Trường Đại học. vậy, vi c phân lập, tuyển chọn đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là vi c làm không thể thiếu trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh