Phân tích proteomics mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Nguyễn Thị Ngọc Hà Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. Nhận dạng đƣợc một số protein biểu hiện khác biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng. Keywords. Sinh học thực nghiệm; Proteomics; Mô ung thƣ; Ung thƣ đại trực tràng Content MỞ ĐẦU Ung thƣ đại trực tràng là một trong những bệnh ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới, nó đứng thứ ba chỉ sau ung thƣ phổi và ung thƣ vú. Đây là căn bệnh có tỷ lệ tử vong cao và tỷ lệ mắc bệnh có xu hƣớng ngày càng tăng. Theo thống kê, năm 2008 ƣớc tính có khoảng 1,24 triệu ngƣời trên thế giới đƣợc chẩn đoán là mắc ung thƣ đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thƣ. Số ca tử vong do ung thƣ đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lƣợng tử vong do ung thƣ. Việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thƣ đại trực tràng có ý nghĩa rất quan trọng, giúp làm tăng hiệu quả điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do loại ung thƣ này gây ra. Thực tế cho thấy, nếu phát hiện khối u đại trực tràng ở giai đoạn đầu và chữa trị kịp thời thì tỷ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm sẽ là 80 – 100%. Hiện nay, một số phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng đang đƣợc áp dụng để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này là thƣờng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, cho kết quả có độ chính xác không cao. Nhu cầu đặt ra cho các nhà khoa học là làm thế nào để tìm ra đƣợc các chỉ thị sinh học đặc trƣng để chẩn đoán, phát hiện ung thƣ đại trực tràng ở giai đoạn sớm. Hiện nay, một trong những hƣớng nghiên cứu chỉ thị sinh học cho ung thƣ đại trực tràng đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm là sử dụng công cụ proteomics. Bằng việc phân tích sự biến đổi trong thành phần, số lƣợng các protein có mặt trong huyết thanh, dịch cơ thể, mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ, các nhà khoa học hi vọng tìm ra đƣợc các chỉ thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng ở giai đoạn sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị bệnh một cách hiệu quả. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân tích proteomics mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng“ với mục tiêu: - Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. - Phân tích và so sánh sự biểu hiện khác biệt của các protein ở mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng thông qua biểu hiện của các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. - Nhận dạng đƣợc một số protein biểu hiện khác biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1. Ung thƣ đại trực tràng là gì? Ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ phổ biến nhất trong các loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa, bao gồm ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng đƣợc gọi theo tên của mô, nơi phát sinh ung thƣ. Ung thƣ đại trực tràng xảy ra khi một số tế bào ở lớp lót trong (còn gọi là niêm mạc) của đại tràng hay trực tràng trở nên bất thƣờng và phát triển một cách không kiểm soát đƣợc, tạo thành khối u (còn gọi là polyp). Các khối u này có thể là u lành tính hay u ác tính. U ác tính là chính là ung thƣ đại trực tràng. Khi di căn, các tế bào ung thƣ đại trực tràng thƣờng di căn tới gan. Ung thƣ đại trực tràng là ung thƣ phổ biến thứ ba trên thế giới chỉ sau ung thƣ phổi và ung thƣ vú. Năm 2008 ƣớc tính có khoảng 1,24 triệu ngƣời trên thế giới đƣợc chẩn đoán là mắc ung thƣ đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thƣ. Số ca tử vong do ung thƣ đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lƣợng tử vong do ung thƣ [16, 45]. Tại Việt Nam, ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ đứng thứ năm trong các loại ung thƣ thƣờng gặp, sau ung thƣ dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu hƣớng ngày càng tăng cao. Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bƣớu TPHCM, năm 2007, bệnh viện có 218 ca bệnh ung thƣ đại trực tràng. Năm 2008 con số này là 306 ca và tính đến tháng 9 năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thƣ đại trực tràng [54]. Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc ung thƣ đại tràng là 9% tổng số bệnh nhân ung thƣ [55]. 1.1.2. Nguyên nhân dẫn đến ung thƣ đại trực tràng Nguyên nhân chính xác dẫn đến ung thƣ đại trực tràng vẫn chƣa đƣợc chứng minh rõ ràng. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng đã cho thấy một số yếu tố có khả năng làm tăng nguy cơ mắc ung thƣ đại trực tràng, bao gồm yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền. Yếu tố không di truyền Theo một số nghiên cứu, số lƣợng ngƣời mắc ung thƣ đại trực tràng không liên quan đến các yếu tố di truyền chiếm 75 - 95% tổng số ngƣời mắc bệnh [41]. Các yếu tố này bao gồm: lứa tuổi, giới tính, chế độ ăn uống, thuốc lá, chế độ vận động của cơ thể, các bệnh liên quan đến viêm đại tràng, polyp đại tràng… Các yếu tố di truyền Trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng liên quan đến bệnh sử ung thƣ trong gia đình chỉ chiếm khoảng 20% trong tất cả các trƣờng hợp mắc bệnh. Trong đó, chỉ có 5% các trƣờng hợp là do di truyền các gen gây ung thƣ từ bố, mẹ sang con cái. Các bệnh di truyền liên quan đến việc hình thành ung thƣ đại trực tràng bao gồm hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis – FAP), hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous Polypsis – AFAP), hội chứng ung thƣ đại tràng di truyền không phải đa polyp (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer – HNPCC). 1.1.3. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thƣ đại trực tràng Hệ thống phân loại theo Duke [12] Năm 1932, Cuthbert E. Dukes, một nhà giải phẫu ngƣời Anh đã đƣa ra hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thƣ trực tràng. Theo hệ thống phân loại này, ung thƣ trực tràng đƣợc chia ra thành 4 giai đoạn: Duke A: Khối u bị giới hạn ở thành của trực tràng. Duke B: Khối u xâm lấn qua thành của trực tràng nhƣng chƣa ảnh hƣởng đến các hạch bạch huyết. Duke C: Khối u lan tới các hạch bạch huyết cạnh trực tràng. Duke D: Khối u di căn tới các bộ phận khác trên cơ thể nhƣ thận, gan, phổi… Hệ thống phân loại TNM Hệ thống phân loại ung thƣ đại trực tràng TNM (Tumor – Lympho node – Metastases) là hệ thống đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Hệ thống phân loại TNM phân giai đoạn ung thƣ đại trực tràng dựa vào kích thƣớc khối u (T), mức độ lây lan của khối u tới các hạch bạch huyết (N) và mức độ di căn tới các cơ quan khác của cơ thể (M). Con số đƣợc thêm vào phía sau mỗi chữ cái cho biết kích thƣớc hoặc phạm vi của khối u và mức độ di căn. Ở nhiều loại ung thƣ, các cách phối hợp TNM này tƣơng ứng với một trong 5 giai đoạn (hình 2). Hình 2. Các giai đoạn phát triển của ung thƣ đại trực tràng [50] 1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ Chỉ thị sinh học (Biomarker) đƣợc định nghĩa là các phần tử đƣợc tìm thấy trong máu, trong các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô, đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý. 1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ Chỉ thị sinh học ung thƣ là những phần tử có trong tế bào hoặc mô ung thƣ, trong máu hay dịch cơ thể khác. Chỉ thị sinh học gồm 2 loại chính là chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị ung thƣ dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormone và thụ thể yếu tố tăng trƣởng, những biến đổi ADN, mARN, yếu tố phiên mã của tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm các chất đƣợc phát hiện ở nồng độ bất thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu và các loại dịch khác của cơ thể [2]. Một chỉ thị ung thƣ lý tƣởng là chỉ thị có thể dễ dàng xác định đƣợc, cho kết quả đáng tin cậy, các xét nghiệm sử dụng loại chỉ thị này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, chi phí thấp. 1.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thƣ Hiện nay, có 3 kỹ thuật sinh học phân tử chính đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu chỉ thị sinh học của ung thƣ bao gồm:  Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng những biến đổi gen liên quan đến sự phát sinh ung thƣ.  Sử dụng kỹ thuật proteomics để xác định những biến đổi của các protein liên quan đến quá trình phát sinh, hình thành ung thƣ. Ƣu điểm của kỹ thuật proteomics là có khả năng nghiên cứu đƣợc mức độ biểu hiện của gen thông qua các phân tử protein tạo ra.  Sử dụng kỹ thuật metabolomics để nghiên cứu tất cả những chất chuyển hóa đƣợc tạo ra trong tế bào, trong mô. 1.3. PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.3.1. Proteomic là gì? Proteomics là môn khoa học nghiên cứu các protein đƣợc biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể trong những điều kiện và thời gian xác định [1]. Không chỉ dừng lại nghiên cứu sự tồn tại của protein của một tế bào nào đó, proteomics còn đi sâu nghiên cứu tất cả các dạng protein đã đƣợc cải biến, tƣơng tác giữa các protein, cấu trúc không gian và các phức hệ cao hơn của protein. 1.3.2. Công cụ nghiên cứu proteomics Để phân tích cả hệ gồm nhiều protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ của 4 công cụ phân tích sau: Công cụ đầu tiên là cơ sở dữ liệu. Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện đƣợc đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn lọc cho tất cả các protein biểu hiện trong các cơ thể. Công cụ thứ hai là khối phổ, đây là bộ phận trung tâm và cơ bản của phân tích proteomics. Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ đƣợc lựa chọn để phân tích hệ protein. Kỹ thuật này phân tích các protein hay các mảnh peptide theo tỷ số m/z (khối lƣợng/độ tích điện). Công cụ thiết yếu thứ ba là hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ liệu khối phổ với các trình tự protein đặc trƣng trong cơ sở dữ liệu. Công cụ thiết yếu thứ tƣ trong nghiên cứu proteomic là các kỹ thuật phân tách protein. Công việc phân tách protein nhằm hai mục đích chính. Thứ nhất, nó làm đơn giản các phức hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hay nhóm nhỏ protein độc lập. Thứ hai, việc phân tách này cho cái nhìn tổng quan về sự khác biệt của hệ protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác định đƣợc các protein đặc trƣng để phân tích. Ngày nay, hai dạng phân tích proteomics chủ đạo đƣợc sử dụng là: điện di hai chiều kết hợp với khối phổ và sắc ký hai chiều kết hợp với khối phổ. 1.3.3. Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng Trên thế giới, sự phát triển của nghiên cứu proteomics đƣợc đánh dấu bằng sự ra đời của tổ chức nghiên cứu hệ protein ngƣời (Human Proteome Organisation–HUPO) tại Pháp năm 2002. Bên cạnh đó còn có các tổ chức khu vực, trong đó có tổ chức AOHUPO (Asia Oceania Human Proteome Organisation) thuộc châu Á-châu Đại Dƣơng. Một trong những ứng dụng quan trọng đầu tiên của proteomics là trong lĩnh vực nghiên cứu ung thƣ. Việc tìm ra những biến đổi trong hệ protein của bệnh nhân ung thƣ có thể giúp các nhà khoa học tìm hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử. Các protein biến đổi cũng có thể trở thành các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh. Phân tích proteomics huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Huyết tƣơng tách từ máu ngƣời là một hệ protein tuyệt vời cho phân tích proteomics. Nó tập hợp các protein từ các mô khác nhau trong cơ thể. Những hiểu biết về hệ protein huyết tƣơng mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể. Chỉ thị sinh học đƣợc tìm thấy trong huyết tƣơng là chỉ thị lý tƣởng cho chẩn đoán ung thƣ do rất dễ dàng thu thập mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân và việc chẩn đoán sẽ dễ dàng hơn. Hiện nay, chỉ thị CEA có mặt trong máu đang đƣợc ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng. Tuy nhiên, nhƣ đã đề cập ở trên, sử dụng chỉ thị CEA chỉ có khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV). Hơn nữa, chi phí cho xét nghiệm CEA tƣơng đối cao. Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm thêm các chỉ thị sinh học trong máu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ đại trực tràng là hết sức cần thiết. Năm 2004, Yu và cs đã tiến hành phân tích proteomics huyết tƣơng của 182 mẫu khác nhau gồm 55 mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, 35 mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân u tuyến đại trực tràng và 92 mẫu huyết tƣơng của ngƣời bình thƣờng. Nghiên cứu đã chỉ ra 4 protein khác biệt giữa bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng và ngƣời bình thƣờng. Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 92% và độ nhạy là 89% [39]. Năm 2005, với kỹ thuật SELDI-TOF/MS, Albrethsen và cs đã so sánh các protein có trong mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ đại tràng với huyết tƣơng của ngƣời khỏe mạnh và protein có trong mô ung thƣ đại tràng với mô đại tràng bình thƣờng. Nghiên cứu này cho thấy hàm lƣợng các protein HNP- 1, HNP- 2 và HNP- 3, còn đƣợc gọi là α- defensin-1, α-defensin-2, α-defensin-3 tăng lên trong huyết tƣơng của ngƣời bệnh và trong mô tại vị trí khối u. Một phần của protein HNP 1-3 sẽ kết hợp với loại protein khối lƣợng lớn chƣa xác định trong huyết tƣơng. Nhóm nghiên cứu đề xuất rằng HNP 1-3 có thể đƣợc coi nhƣ chỉ thị sinh học trong máu của bệnh nhân ung thƣ đại tràng [4Error! Reference source not found.]. Ngoài các nghiên cứu nhằm tìm kiếm chỉ thị sinh học để chẩn đoán bệnh trong giai đoạn sớm, các nhà khoa học còn tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc trƣng cho tình trạng di căn của ung thƣ đại trực tràng. Năm 2010, Xue và cs đã tiến hành nghiên cứu với mục đích nhƣ vậy. Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, các nhà khoa học đã so sánh mức độ thay đổi lƣợng các chất tiết vào trong máu từ các dòng tế bào ung thƣ ban đầu và dòng tế bào đã di căn đƣợc lấy trên cùng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. 6 protein khác biệt đặc trƣng đã đƣợc xác nhận bằng kỹ thuật Western blot. Trong đó, yếu tố trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trƣởng 15 là 2 protein có biểu hiện tăng ở các dòng tế bào đã di căn. Sử dụng kỹ thuật ELISA bánh kẹp cũng chỉ ra rằng 2 protein này có mức độ biểu hiện tăng lên đáng kể trong huyết tƣơng ở ung thƣ đại trực tràng đã di căn tới hạch bạch huyết. Kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này có thể cho thấy trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trƣởng 15 có trong huyết tƣơng có thể ứng dụng đƣợc để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng đã di căn [37]. Phân tích proteomics mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Với mục đích nghiên cứu, tìm kiếm chỉ thị sinh học cho ung thƣ đại trực tràng, năm 2005, Alfonso và cs đã tiến hành phân tích proteomics ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng nhờ kỹ thuật 2D-PAGE kết hợp MS. Nghiên cứu đƣợc tiến hành với mẫu mô tại vị trí khối u và đối chứng là mẫu mô tại vị trí cận khối u của 7 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Nghiên cứu đã chỉ ra 72 protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ và mô bình thƣờng. Nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt bằng phân tích khối phổ đã xác định đƣợc 41 protein. Các protein khác biệt liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã, các protein tín hiệu (annexins IV và V, relaxin, APC), các protein tham gia tổ chức khung xƣơng tế bào (vimentin, cytokeratins, beta actin) và các protein liên quan đến quá trình tổng hợp và cuộn gập protein (HSP 60, cathepsin D, RSP4, calreticulin) [6]. Nghiên cứu của Bai và cs sƣ ̉ du ̣ ng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với khối phổ, thƣ ̣ c hiê ̣ n trên mẫu mô tại vị trí khối u đại trực tràng và mẫu mô tại vị trí gần khối u trên cùng một bệnh nhân. Mẫu mô đại trực tràng từ 12 bệnh nhân đã đƣợc sử dụng cho nghiên cứu này. Kết quả điện di 2 chiều cho thấy có 60 protein biểu hiện khác biệt (hàm lƣợng chênh lệch 1,5 lần) giữa mô ung thƣ và mô thƣờng. Tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ để nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt, 10 protein đã đƣợc nhận dạng, bao gồm 2 protein biểu hiện giảm và 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thƣ. 2 protein biểu hiện giảm ở mô ung thƣ bao gồm carbonic anhydrase II và protein disulfide isomerase. 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thƣ bao gồm APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor, phosphoglycerate kinase 1, fumarate hydratase, aldolase A, activator protein 2B, glutathione S-transferase A3, Arginase và zinc finger protein 64 homolog [8]. Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là 10 mẫu mô của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc lấy tại vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5 – 10 cm). Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội cung cấp. Mẫu mô đƣợc đựng trong ống đựng mẫu, đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng để vận chuyển từ bệnh viện về phòng thí nghiệm. Các mẫu mô sau đó đƣợc bảo quản trong tủ âm sâu (- 80C) cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo. 2.1.2. Hóa chất Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc đề cập ở bảng 2. Bảng 2. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu STT Tên hóa chất Nhà cung cấp 1 Bio–Lyte 4-7 ampholyte, Bio–Lyte 3-10 ampholyte GE Health Care, Mỹ 2 Các peptide chuẩn Insuline B (Mw = 3494,65 Da), Angiotensine II (Mw = 1046,5423 Da) Sigma – Aldrich, Mỹ 3 Chất nền CHCA (α–Cyano–4- hydroxycinnamic acid) Sigma – Aldrich, Mỹ 4 Enzyme trypsin Sigma – Aldrich, Mỹ 5 CHAPS, DTT, IAA, Tris – base Biorad, Mỹ 6 Agarose low melting, Glycine, Urea Sigma, Mỹ 7 SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia - Mỹ 8 Acetone, Acetonitrile, Methanol Merk, Đức Tất cả các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ sạch phân tích. 2.1.3. Thiết bị Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các thiết bị, dụng cụ trong Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xử lý mẫu mô đại trực tràng Mẫu mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đƣợc lấy ra từ tủ -80 o C, rã đông. Cân 2 mẫu mô với lƣợng tƣơng đƣơng (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng biệt để trên đá. Quy trình xử lý mẫu mô đại trực tràng đƣợc thực hiện nhƣ sau: Bước 1. Thu các phân đoạn dịch chiết protein  Mẫu mô đƣợc cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ. Bổ sung 100 µl đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4. Chuyển toàn bộ mẫu mô đã cắt và dịch đệm vào ống eppendorft để trong 30 phút, ở 4 o C. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1.  Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 1 đƣợc bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4 để ở 4 o C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 2.  Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 2 đƣợc hòa tan bằng 100 µl đệm lysis (Urea 7M, Tris 30mM, CHAPS 4% và DTT 65mM), để ở 4 o C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1.  Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 3 đƣợc hòa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4 o C trong 30 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 2.  Cặn thu đƣợc sau ly tâm lần 4 đƣợc hòa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4 o C trong 60 phút. Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 3. Bước 2. Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2 và lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C và hút loại lớp mỡ phía trên. Bƣớc loại mỡ đƣợc lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa. Bước 3. Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu đƣợc sau quá trình loại mỡ ở tốc độ 60.000g trong 30 phút ở 4 o C, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn. Bƣớc này đƣợc lặp lại 2 lần để đảm bảo loại cặn tối đa. Bước 4. Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ sạch của mẫu Dịch chiết protein thu đƣợc từ các phân đoạn sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ sạch của mẫu. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100%. Các dịch chiết của cùng một mẫu đƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều. 2.2.2. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford Để đảm bảo hàm lƣợng protein tổng số giữa các mẫu nghiên cứu là tƣơng đƣơng nhau, trƣớc khi điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành định lƣợng protein trong mẫu dịch chiết protein từ mô ung thƣ và mô bình thƣờng bằng phƣơng pháp Bradford. Sau khi đã xác định hàm lƣợng protein có trong mẫu, chúng tôi tiến hành tính toán sao cho hàm lƣợng protein có trong dung dịch sử dụng cho điện di hai chiều của mẫu bệnh và mẫu đối chứng là tƣơng đƣơng nhau. 2.2.3. Điện di hai chiều Quá trình này đƣợc bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip có gradient pH cố định bằng đệm trƣơng gel có chứa protein. Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip. Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm đƣợc là 400µg. Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bƣớc đƣợc trình bày trong bảng 3. Bảng 3. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm Bƣớc Hiệu điện thế V Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng U Bƣớc 1 50 12 giờ … Trƣơng gel Bƣớc 2 125 2 giờ … Tuyến tính Bƣớc 3 250 15 phút … Nhanh Bƣớc 4 10.000 2 giờ … Chậm Bƣớc 5 10.000 … 40.000 Vh Nhanh Tổng ≈ 20 giờ ≈ 60.000 Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh strip đƣợc ngâm trong đệm cân bằng I (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; DTT 0,1%) ở nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM, pH 8,8; Urea 6M; glycerol 30%; SDS 2%; IAA 0,25%) thực hiện trong bóng tối cũng ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần, thời gian mỗi lần theo thứ tự là: 5 phút, 10 phút, 10 phút. Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết thúc điện di chiều hai, các protein đƣợc cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít phosphoric 1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250 qua đêm theo phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phƣơng pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [43]. 2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều Đầu tiên bản gel điện di hai chiều đƣợc quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản). Bƣớc đầu phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ tự cho các spot. Tiếp đó, phần mềm Phoretix sẽ xác định vị trí, thể tích của từng spot và giá trị cƣờng độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel từ đó giúp chỉ ra các spot tƣơng ứng trên từng bản gel và các spot có biểu hiện khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng. 2.2.5. Cắt và thủy phân spot Các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi bản gel. Trƣớc tiên cần phải loại bỏ chất màu Coomassie từ các spot protein. Protein trong các spot đƣợc thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ. Loại enzyme đƣợc sử dụng để thủy phân protein là trypsin. Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt thành các mảnh peptide có kích thƣớc từ 6 – 20 acid amin, thích hợp cho phân tích khối phổ về sau [1]. 2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein Tiến hành phân tích khối phổ MALDI – TOF MS để xác định khối lƣợng của tập hợp các peptide thu đƣợc sau quá trình thủy phân các spot protein bằng enzyme trypsin. Mẫu peptide đƣợc phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide Angiotensin II (Mw 1046,54 Da) và Insulin B (Mw 3494,65 Da). Hỗn hợp peptide đƣợc trộn với chất nền CHCA, để khô và đƣa vào máy phân tích khối phổ AXIMA – CRF PLUS . Protein đƣợc nhận dạng bằng phƣơng pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint). Phƣơng pháp này nhận dạng protein bằng việc so sánh khối lƣợng của tập hợp các peptide thu sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu có sẵn, sử dụng phần mềm Mascot. Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG Kết quả tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di SDS - PAGE (hình 4). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 4. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên cùng bản gel polyacrylamide 10% có SDS Giếng 1, 2, 3, 4, 5: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô đại trực tràng bình thường. Giếng 6, 7, 8, 9, 10: Lần lượt là các phân đoạn dịch chiết PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis 2, lysis 3 thu được từ mô ung thư đại trực tràng. Hình 4 cho thấy kết quả điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết thô protein từ mẫu mô đại trực tràng. Nhìn vào kết quả điện di chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dƣới chứng tỏ đã tách chiết thành công protein từ mô đại trực tràng và thành phần protein thu đƣợc trong mẫu là đa dạng và phong phú. Trong các mẫu, phân đoạn PBS 2, lysis 2 và lysis 3 (giếng số 2, 4, 5 và 7, 9, 10) có các băng vạch rõ nét và không có hoặc ít có vệt kéo dài từ trên xuống dƣới. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này là tƣơng đối sạch, ít bị lẫn các thành phần phi protein. Bên cạnh đó, các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 (giếng số 1, 3 và 6, 8) của các mẫu có các băng protein hiện lên chƣa rõ ràng và xuất hiện hiện tƣợng kéo vệt dọc theo chiều dài giếng. Điều này chứng tỏ các phân đoạn này có thể lẫn các thành phần phi protein trong mẫu. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu của các phân đoạn PBS 1 và lysis 1 bằng dung dịch acetone theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100% ở -20 o C. Protein sau khi tủa đƣợc hòa tan lại bằng chính đệm lysis và đƣợc điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide 10% có SDS. Kết quả điện di kiểm tra mẫu tủa đƣợc cho trong hình 5. 1 2 3 4 Hình 5. Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1 từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng trên bản gel polyacrylamide 10% có SDS Giếng 1, 2,: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu được từ mô đại trực tràng bình thường. Giếng 3, 4: Lần lượt là mẫu tủa của các phân đoạn dịch chiết PBS 1, lysis 1 thu được từ mô ung thư đại trực tràng. Kết quả điện di kiểm tra cho thấy các mẫu dịch chiết phân đoạn PBS 1 và lysis 1 sau khi tủa bằng acetone đã xuất hiện những băng vạch rõ nét, không còn các vệt dọc kéo dài trên bản gel. Điều này chứng tỏ mẫu sau khi tủa đã loại đƣợc đáng kể các thành phần phi protein trong mẫu dịch chiết thô ban đầu. Mẫu sau khi tủa có thể sử dụng cho các phân tích tiếp theo. Các phân đoạn khác nhau của mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đƣợc trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô đại trực tràng dùng để tiến hành bƣớc thí nghiệm tiếp theo. 3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU Protein trong dịch chiết mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đƣợc phân tách thành các spot protein riêng rẽ bằng kỹ thuật điện di hai chiều. Chiều thứ nhất là điện di đẳng điện trên thanh IPGstrip, pH 3-10, dài 17cm. Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS. [...]... mẫu mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 A - Mô đại trực tràng bình thƣờng B - Mô ung thƣ đại trực tràng Hình 8 Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều mẫu mô đại trực tràng bình thƣờng so với mẫu mô ung thƣ của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng mã 11781 ↑ + O : Biểu hiện tăng ở mô ung thƣ O : Chỉ có ở mô ung thƣ ↓ O : Biểu hiện giảm ở mô ung thƣ O : Chỉ có ở mô bình... biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng trên số lƣợng bệnh nhân lớn hơn nhằm tìm ra các protein đặc trƣng cho ung thƣ đại trực tràng 2 Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics mô đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng ở các giai đoạn ung thƣ khác nhau nhằm phân tích sự biến đổi thành phần các protein liên quan đến bệnh References Tiếng... bình thƣờng của các bệnh nhân thành các spot riêng rẽ trên các bản gel điện di hai chiều 2 Đã xác định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thƣờng của từng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Trong đó có 43 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 16 spot biểu hiện tăng, 17 spot biểu hiện giảm và 10 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ 4... protein trong mẫu đƣợc phân tách thành các spot riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến sau phiên mã hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lƣợng phân tử tƣơng tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau (hình 6) 3 10 3 10 A - Mô đại trực tràng bình thƣờng B - Mô ung thƣ đại trực tràng Hình 6 Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên... gel mô ung thƣ đại trực tràng so với bản gel mô đại trực tràng bình thƣờng của các bệnh nhân, chúng tôi nhận thấy có 43 spot biểu hiện khác chung bao gồm 16 spot biểu hiện tăng, 17 spot biểu hiện giảm và 10 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ đại trực tràng 3.4 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS chúng tôi đã xác định đƣợc các peptide trong mẫu thủy phân. .. hiện khác biệt của các spot protein tƣơng ứng giữa các cặp bản gel điện di mẫu protein mô đại trực tràng A - Mô bình thƣờng B - Mô ung thƣ Hình 7 Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thƣ so với mô bình thƣờng Tiến hành phân tích độc lập từng cặp bản gel điện di hai chiều, chúng tôi đã xác định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ so với mô đại trực tràng bình... biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng nhƣ Zinc finger protein 658, cytokeratin-1 biểu hiện tăng ở mô ung thƣ; các protein MHC class I antigen, HSP27, Creatine kinase chain B, profilin-4 biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung thƣ và Suppressor of tumorigenicity 20 protein chỉ xuất hiện ở mô đại trực tràng bình thƣờng mà không xuất hiện trong mô ung thƣ KIẾN NGHỊ Từ... này, chúng tôi đã phân tách đƣợc các protein mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ của 5 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng trên bản gel điện di hai chiều, sử dụng thanh strip dài 17 cm, pH 3-10 3.3 PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU Sử dụng phần mềm phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều Phoretix, bƣớc đầu chúng tôi đã xác định đƣợc tổng số spot protein đƣợc phân tách trên mỗi... biệt giữa mô ung thƣ và mô đại trực tràng bình thƣờng Các protein này bao gồm: TAF2 RNA polymerase II, Zinc finger protein 658, Transcription factor IIIA, Myc- binding factor Max và Translational activator GCN1 KẾT LUẬN Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1 Bằng kỹ thuật điện di hai chiều đã phân tách đƣợc các protein trong mô ung thƣ đại trực tràng và mô đại trực tràng bình... trên bản gel điện di hai chiều của cả 5 bệnh nhân Kết quả đƣợc đƣa ra trong bảng 5 Bảng 5 Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai chiều của 5 bệnh nhân Mã bệnh nhân Biểu hiện 11781 10608 10483 10597 17 6 10 12 Tăng ở mô ung thƣ (↑) 5 22 1 9 Giảm ở mô ung thƣ (↓) 11 0 0 1 Chỉ xuất hiện ở mô ung thƣ (+) 11812 15 19 5 0 8 0 14 1 Chỉ xuất hiện ở mô thƣờng (-) Tổng số khác biệt . Abstract. Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Phân tích và. trực tràng với mục tiêu: - Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng và mô ung thƣ đại trực tràng của bệnh nhân ung thƣ đại trực