Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase Phan Thị Thu Mai Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan về axit phytic, phytate, phytase. Trình bày các phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase; Tuyển chọn chủng; Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng; Phương pháp phân loại; Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh phytase của chủng vi sinh vật nghiên cứu; Thu hồi enzyme; Nghiên cứu enzyme phytase. Kết quả: Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi Bacillus; Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus amyloliquefaciens. Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử dụng trực tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động vật. Keywords: Vi sinh vật; Chủng vi khuẩn; Sinh học; Axit Content MỞ ĐẦU Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật, phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong các cơ thể sống. Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của phospho trong tự nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu và hạt lấy dầu (axit phytic chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người và động vật. Axit phytic có khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các muối (phytate: muối của axit phytic với Na + , phytin: muối của axit phytic với Ca 2+ , Mg 2+ ) và các hợp chất khác như axit amin, protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản sự hấp thu các chất này của các cơ thể sống. Vì thế axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh dưỡng (an anti-nutrient compound) trong thức ăn và thực phẩm. Phytase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối của axit phytic (phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6-phosphate và các cấp độ 2 thấp hơn của phản ứng phosphoyl hóa. Việc sử dụng phytase không chỉ làm tăng khả năng hấp thu phospho vô cơ mà còn tăng khả năng hấp thu các nguyên tố khoáng và khả năng tiêu hóa các hợp chất khác. Do đó dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần thức ăn là rất cần thiết. Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động vật dạ dày đơn như gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường. Tuy nhiên, bổ sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm tăng chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có trong thức ăn, giải phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh dưỡng và khoáng khác. Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học. Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn về địa hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật, cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm. Những đóng góp của đề tài - Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi Bacillus. - Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus amyloliquefaciens. - Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử dụng trực tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động vật. 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ, không phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật. Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng ―globoid‖ (dạng cầu) và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm 1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol- phosphoic và sau đó năm 1968 được duyệt lại là ‗myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis (dihydrogen) phosphate (IP 6 ) bởi IUPAC-IUB. Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại thực vật khác nhau, chúng chiếm đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa dầu và hạnh nhân. IP 6 có thể được tìm thấy trong nhân hồng cầu ở các loài chim, cá nước ngọt và rùa, cũng như được tìm thấy trong các loại đất hữu cơ. Axit phytic được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound) do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác như tinh bột, protein làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này. 1.2 PHYTASE Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước axit phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (P i ) và các myo-inositol phosphate trung gian (IP 5 , IP 4 , IP 3 , IP 2 , IP 1 ). Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa trừ phytase từ Klebsiella aerogenes có 2 dạng phân tử cảm ứng. Phytase từ eukaryote như nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và động vật. Phytase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và động vật nguyên sinh. Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26), dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate đầu tiên của vòng inositol. Dựa trên pH hoạt động tối ưu, phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa axit, ưa kiềm và trung tính. Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là: histidine axit phosphatase (HAP) phytases, ß-propeller phytase (BPP) và purple axit phosphatase (PAP) phytase. 4 Dựa trên những đặc tính hóa lý và chức năng, phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công nghiệp, là công cụ trong các nghiên cứu hóa sinh. Ngoài ra phytase còn được sử dụng nhiều trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase. 1.3 LÊN MEN XỐP Lên men xốp (Solid-state fermentation) là quá trình lên men của vi sinh vật trên cơ chất không tan ở độ ẩm nhất định, cơ chất này vừa đóng vai trò là chất hỗ trợ cơ học (giá thể) và vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Với đặc điểm độ ẩm thấp, lên men xốp chỉ thích hợp với một lượng giới hạn các loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm, nấm men và một số vi khuẩn. Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong quá trình xử lý sinh học môi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức ăn động vật từ các chất thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm. 1.4 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS Bacillus là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que thuộc ngành Firmicutes, có khả năng sinh nội bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như bầu dục, tròn hay cầu hoặc khúc xạ trụ bên trong tế bào, để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống, đa số các loài vi khuẩn Bacillus là không gây bệnh, tuy nhiên có một số loài được biết đến bởi khả năng gây bệnh cho vật nuôi (như Bacillus anthracis và Bacillus cereus) và gây bệnh cho côn trùng (như Bacillus thuringiensis). Nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B. subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm. Hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA bắt đầu từ những năm 1990. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử cũng như các đặc tính sinh hóa không có khả năng phân tách các loài thuộc nhóm Bacillus. Gần đây, xây dựng cây phát sinh chủng loại trên trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) đã được ứng dụng trong phân loại các loài hoặc dưới loài B. subtilis. 5 Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an toàn (GRAS) do đó B. amyloliquefaciens được biết đến với nhiều ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại như sản xuất enzyme công nghiệp. Enzyme từ Bacillus như amylase, cellulose, protease và lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt. Do đó, enzyme từ Bacillus đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa. B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoă ̣ c nươ ́ c uống nhằm cân bằng hê ̣ vi sinh đươ ̀ ng ruô ̣ t . Phytase của các chủng thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens là β propeller phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao với Ca 2+ . Đây là loại phytase khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng lại biểu hiện rất ít hoặc không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự có mặt của Ca 2+ cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này. 1.5 THU HỒI ENZYME Trong quá trình sản xuất enzyme bằng lên men chìm hay lên men pha rắn sinh ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đặc biệt là lên men pha rắn lượng tạp chất trong enzyme còn lớn hơn rất nhiều và enzyme gắn bám vào các cơ chất xốp gây khó khăn cho việc nghiên cứu. Quá trình thu hồi enzyme nhằm chiết rút được những enzyme nhất định, giữ lại được tối đa hoạt tính enzyme và loại bỏ các hợp chất không tan, cô đặc enzyme nhằm phục vụ cho quá trình tinh sạch enzyme hoặc sản xuất các chế phẩm enzyme. Đặc tính tự nhiên của enzyme, nguồn gốc enzyme (từ nấm sợi hay vi khuẩn) và loại cơ chất sử dụng là 3 yếu tố chính ban đầu đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất enzyme từ cơ chất rắn (cách lựa chọn dung dịch chiết và phương pháp chiết rút), ngoài ra quá trình chiết xuất thu hồi enzyme trong lên men xốp còn phụ thuộc vào yếu tố như thời gian ngâm chiết, dung dịch chiết, nhiệt độ ngâm chiết và tốc độ khuấy. 6 CHƢƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG NGHIÊN CỨU - Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu là các chủng thuộc 3 bộ giống phân lập được từ Sapa (đất rừng Hòang Liên và đất canh tác nông nghiệp xung quanh rừng thuộc Sapa), tỉnh Lào Cai (274 chủng), từ đất nông nghiệp Ba Vì (34 chủng) và từ Phú Quốc (38 chủng), hiện đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học- Đại học quốc gia Hà Nội. - Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt: môi trường thạch dinh dưỡng NA (g/l): cao thịt- 3; peptone-5; agar-16; pH 6,8± 0,2; khử trùng 121 o C trong 15 phút. - Môi trường dịch thể: môi trường NA (g/l): cao thịt-3; pepton-10; NaCl- 5; pH 6,8± 0,2, môi trường thạch thường (g/l): cao thịt- 3; pepton- 5, môi trường thạch thường cải tiến (g/l): pepton- 10g; nước mắm đạm trên 40%- 10ml, môi trường Trypticase soy (hãng BBL), môi trường Jorquera (2008) (g/l): Glucose- 10; Na-phytate- 2; CaCl 2 - 2; NH 4 NO 3 - 5; KCl- 0,5; MgSO 4 .7H 2 O- 0,5; FeSO 4 - 0,01; MnSO 4 - 0,01; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100 o C 15 phút. - Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media) (g/l): Glucose- 10; Na-phytate- 4; CaCl 2 - 2; NH 4 NO 3 - 5; KCl- 0,5; MgSO 4 .7H 2 O- 0,5; FeSO 4 - 0,01; MnSO 4 - 0,01; agar- 16, khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100 o C/15 phút. - Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase: các môi trường dịch thể sàng lọc vi sinh vật sinh phytase được ký hiệu lần lượt là: K1, K2, G, J, H có công thức lần lượt: + Môi trường K (g/l): cám gạo-50; (NH 4 ) 2 SO 4 - 0,4; MgSO 4 .7H 2 O- 0,2; CaCl 2 – 2,2; pH 6; khử trùng 121 o C/15 phút. + Môi trường K2 (g/l): cám gạo-50; (NH 4 ) 2 SO 4 -0,4; MgSO 4 .7H 2 O-0,2; CaCl 2 -2,2; cao men- 7,5; methanol-7,5; pH 6, khử trùng 121 o C/15 phút. + Môi trường G (g/l): bột đậu tương- 5; sucrose-1; Asparagin-0,5; KCl-0,5; FeSO 4 - 0,01; MnSO 4 - 0,01; pH 5, khử trùng 121 o C/15 phút. 7 + Môi trường J (g/l): Glucose-10; CaCl 2 - 2; NH 4 NO 3 - 5; KCl- 0,5; MgSO 4 .7H 2 O- 0,5; FeSO 4 - 0,01; MnSO 4 - 0,01; Na-phytate- 0,2%; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100 o C/15 phút. + Môi trường H (g/l): Glucose- 3; tryptone- 1; CaCl 2 - 0,3; MgSO 4 .7H 2 O- 0,5; MnCl 2 .4H 2 O- 0,04; FeSO 4 .7H 2 O- 0,0025; Na-phytate- 1; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100 o C/15 phút. - Môi trường nuôi xốp với cơ chất là ngô vỡ, gạo lức, bột đỗ tương, cám, dung dịch làm ẩm là môi trường dịch thể Jorquera không bổ sung cơ chất Na- phytate). 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp của Shimizu và cộng sự, 1992 - Tuyển chọn chủng + Sàng lọc các chủng ưa nhiệt: cấy chấm các chủng vi khuẩn trong 3 bộ giống lên đĩa thạch NA và nuôi trong tủ ấm ở 40 o C trong 48 - 72h. + Sàng lọc các chủng có sinh tổng hợp phytase Định tính: Cấy zic zắc các chủng vi khuẩn ưa nhiệt lên môi trường sàng lọc phytase (môi trường PSM) và nuôi ở tủ ấm 37 o C trong 5 ngày, sau khi các khuẩn lạc xuất hiện, tiến hành lấy các khuẩn lạc xuất hiện vòng trong xung quanh. Đây là các khuẩn lạc vi khuẩn sinh enzyme phân giải Na-phytate. Định lượng: + Chủng nghiên cứu được nuôi lắc trong các môi trường dịch thể có bổ sung Na-phytate kích thích sinh phytase là G, H, J, K1, K2 ở 40 o C, 200 vòng/phút, sau 3 ngày dịch nuôi cấy được ly tâm loại bỏ sinh khối và phần dịch trong được dùng để xác định hoạt tính phytase + Tiến hành nuôi xốp các chủng vi khuẩn có sinh enzyme phytase trên môi trường gạo lức + dung dịch làm ẩm, sau đó tách chiết dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme để lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao nhất. - Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng: khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được xác định bằng số lượng tế bào trên ml(g). + Phương pháp phân loại dựa vào đọc trình tự ADN r16S và 5 gen chức năng gyrA, rpoB, purH, polC, groEL. 8 - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh trưởng ở chủng nghiên cứu: lựa chọn môi trường nuôi cấy, lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy, pH thích hợp, lựa chọn thời gian nuôi cấy, lựa chọn chế độ thông khí - Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp phytase ở chủng nghiên cứu: lựa chọn cơ chất, lựa chọn thời gian nuôi cấy, lựa chọn độ ẩm, lựa chọn tỷ lệ cấy giống, lựa chọn nguồn cacbon bổ sung, lựa chọn nguồn nitơ bổ sung, lựa chọn các ion kim loại bổ sung, ảnh hưởng của Ca 2+ ở các nồng độ khác nhau. - Thu hồi enzyme: chiết xuất enzyme sử dụng các loại dung dịch chiết khác nhau: Triton X100 1%, NaCl 50mM, SDS 1%, Tween 20 1%, Tris HCl pH 7, nước cất, nước máy. Tủa enzyme bằng amoniumsulphate và dung môi hữu cơ (cồn, acetone). - Nghiên cứu enzyme phytase + Giải trình tự gen mã hóa phytase và so sánh mức độ tương đồng của gen mã hóa phytase chủng SP1901 với gen mã hóa phytase của các loài khác trên genbank sử dụng chương trình Blast và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen mã hóa phytase. + Các đặc tính của enzyme: khả năng bền nhiệt của enzyme, pH thích hợp cho hoạt động của enzyme, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme, ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ của enzyme, sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme trên cơ chất sấy khô, ảnh hưởng của enyme tiêu hóa đến hoạt độ của enzyme. CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 3.1.1 Lựa chọn chủng ƣa nhiệt Từ tổng số 346 chủng vi sinh vật thuộc 3 bộ giống đã chọn được 91 chủng- trong đó bộ giống từ Sa Pa có 46/274 chủng, bộ giống từ Ba Vì có 29/34 chủng và bộ giống từ Phú Quốc có 16/38 chủng có khả năng sinh trưởng được ở 40 o C. 3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt tính phytase cao Định tính: Từ 91 chủng ưa nhiệt được nuôi trên đĩa thạch sàng lọc phytase (PSM) sau 5 ngày, lựa chọn được 2 chủng xuất hiện vùng phân giải trong là SP1901 và D15 (hình 1). 9 Hìn h 1. Sinh trƣởng và vùng phân giải của phytase chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM Định lượng trên môi trường lên dịch thể và lên men xốp: chúng tôi đã tiến hành lên men dịch thể chủng SP1901, D15 để sản xuất phytase trên 5 loại môi trường khác nhau, sau 3 ngày xác định hoạt tính phytase và lên men xốp trên môi trường chứa gạo lức và bột đỗ tương, sau 3,5 ngày mẫu được chiết xuất để xác định hoạt tính phytase. Bảng 1. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên dịch thể và lên men xốp Chủng Hoạt tính phytase Môi trường lên men dịch thể (U/ml) Môi trường lên men xốp (U/g) G H J K1 K2 SP1901 0 0 0,63 0,35 0,26 3,9 D15 0 0 0,5 0,34 0,19 3,1 Với các kết quả thu được ở bảng 5 môi trường J cho hoạt tính phytase cao nhất ở cả 2 chủng, tuy nhiên lại thấp hơn nhiều khi so sánh với hoạt tính phytase được sinh ra trên môi trường lên men xốp. Mặt khác, môi trường J bổ sung cơ chất Na-phytate tinh khiết rất đắt tiền, trong khi đó môi trường lên men xốp sử dụng các cơ chất tự nhiên, dễ kiếm, rẻ tiền do đó chúng tôi quyết định sử dụng lên men xốp cho các nghiên cứu tiếp theo. Như vậy từ 91 chủng vi sinh vật ưa nhiệt, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng vi khuẩn là: SP1901 và D15 có sinh tổng hợp phytase trên môi trường lên men xốp. Dịch enzyme của 2 chủng này được dùng để xác định khả năng bền nhiệt. 10 3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt Dịch chiết enzyme thô của 2 chủng vi khuẩn SP1901 và D15 được xử lý ở 60 o C trong các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính phytase bằng định lượng, thu được kết quả như sau: Bảng 2. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60 o C STT Chủng Nhiệt độ Thời gian xử lý (phút) Hoạt độ tƣơng đối (%) 1 SP1901 60 o C Đối chứng (0) 100 10 95,3 20 93,95 30 90 2 D15 60 o C Đối chứng (0) 100 10 71,3 20 45,7 30 18,8 Như vậy, chủng SP1901 bền ở 60 o C sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn 90%, trong khi đó chủng D15 hoạt tính chỉ còn 45,7%. Vì thế chúng tôi lựa chọn chủng SP1901 cho các nghiên cứu tiếp theo. [...]... quá trình sản sinh phytase ở nồng độ thích hợp từ 0,1-1%, các môi trường không có mặt Ca2+ đều không có sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901 15 3.4 THU HỒI ENZYME 3.4.1 Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau Hình 18 Chiết xuất enzyme bằng Hình 19 Tủa enzyme bằng cồn và các dung môi khác nhau acetone 3.4.2 Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau Khi tủa enzyme bằng các phân đoạn khác nhau... muối (NH4)2SO4, hoạt tính phytase mất hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn Do đó không thể sử dụng muối (NH 4)2SO4 khi tủa phytase trong trường hợp này Khi tủa bằng cồn và acetone (hình 19) phytase tủa nhiều nhất ở nồng độ cồn và acetone 70% 3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901 3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần gũi Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm... 20 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen mã hóa phytase 17 3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô Hình 21 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901 Hình 22 Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất đƣợc sấy khô ở 50oC trong 24h Hình 23 pH hoạt động thích hợp của Hình 24 Nhiệt độ hoạt động thích hợp phytase chủng... SP1901 của phytase chủng SP1901 18 Hình 25 Ảnh hƣởng của các ion kim loại Hình 26 Ảnh hƣởng của enzyme đến hoạt tính của phytase chủng SP1901 tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901 Hình 27 Ảnh hƣởng của Ca2+ đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60 oC (phải), xử lý ở 70oC (trái) Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho thấy rằng: phytase của... của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsine References TIẾNG VI T 1 Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Vi n Khoa học và Công nghệ Vi t Nam 2 Ngô Thanh Xuân (2011), Nghiên cứu phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong... cả các phân đoạn khi tủa 20 bằng (NH4)2SO4, khi tủa bằng cồn và acetone phytase tủa nhiều nhất ở nồng độ 70% đạt 9195% - Phytase của chủng SP1901 bền ở 60 oC, hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50oC Sự có mặt của Ca2+ và Cu2+ làm tăng hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2 mM làm ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase Ca2+ làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60 oC và 70oC Khả năng bền nhiệt của phytase. .. xuất phytase, độ ẩm 50% và tỷ lệ cấy giống từ 10-20% tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp phytase và hoạt tính phytase đạt được cao nhất sau 84 h nuôi cấy Chủng SP1901 có thể sử dụng nguồn cacbon và nitơ sẵn có trong cơ chất tuy nhiên khi có mặt lactose, glycerol, ure và NH 4NO3 cũng làm tăng nhẹ hoạt tính phytase thu được Ion Ca2+ có vai trò quyết định đối với quá trình sản sinh. .. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của chủng SP1901 14 Hình 14 Nguồn các bon thích hợp cho lên Hình 15 Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 men xốp của chủng SP1901 Hình 16 Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến Hình 17 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng Ca2+ đến khả năng sinh tổng hợp SP1901 phytase của chủng SP1901 Với những... R (2002), Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect Microbiology 148(7): 2097-2109 Igbal TH, Lewis KO, T CB (1994), Phytase activity in the human and rat small intestine Gut 35(9): 1233-1236 Igbasan FA, Männer K, Miksch G, Borriss R, Farouk A SO (2000), Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial... metallobiochemistry of zinc enzymes Adv Enzymol 56: 283-340 148 Vats P, Banerjee UC (2004), Production studies and catalytic properties of phytases (myoinositolhexakisphosphate phosphohydrolase): an overview Enzyme Micob Technol 35: 3-4 149 Vohra A, Satyanarayana T (2003), Phytases: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications Critical Reviews in Biotechnology . đề tài nghiên cứu Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là các. Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase Phan Thị Thu Mai Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật;