Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Streptokinase tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes trong E. coli. Nguyễn Thị Thƣơng Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Sinh học Luận văn ThS Chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Quyền Đình Thi Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Tổng quan các vấn đề cần nghiên cứu: chứng tắc nghẽn mạch máu; Streptokinase; Streptococcus pyogenes. Trình bày vật liệu (nguyên liệu và thiết bị) và phƣơng pháp nghiên cứu (phƣơng pháp vi sinh vật, sinh học phân tử; hóa sinh). Đƣa ra một số kết quả nghiên cứu: Nhân dòng gên mã hóa mSK-nonhis; Thiết kế plasmid biểu hiện mSK; Biểu hiện streptokinase nonhis; Tinh sạch streptokinase nonhis; Hoạt hóa SK Keywords: Vi sinh vật học; Sinh học; Chủng Streptococus pyogenes Content I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong xã hội hiện đại, khi nền kinh tế ngày một phát triển cộng với áp lực về công việc và thời gian khiến cho chế độ ăn của con ngƣời trở nên mất cân đối là một trong những nguyên nhân lớn dẫn đến bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các nƣớc phát triển. Bệnh tim mạch đang là nguyên nhân gây tử vong số 1 trên thế giới [50]. Trong đó chứng tắc nghẽn mạch máu có thể dẫn tới đột quỵ, nhồi máu cơ tim thƣờng để lại hậu quả nghiêm trọng hơn. Trên thị trƣờng hiện nay có một số thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu nhƣ Durakinase, Streptase, Alteplase, Tenecteplase Tuy nhiên đây hầu hết là các sản phẩm của nƣớc ngoài với giá thành rất đắt. Ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về các thuốc tan huyết. Đề tài KC10.28 có thể coi là công trình nghiên cứu cấp Bộ đầu tiên về lĩnh vực này. Trong đề tài này các nhà nghiên cứu đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch thành công streptokinase. Streptokinase đƣợc biểu hiện cả ở dạng có signal và không có signal (mSK), trong đó mSK với hoạt tính cao. Streptokinase tái tổ hợp bƣớc đầu đƣợc thử nghiệm trên đối tƣợng thỏ thí nghiệm cho kết quả tốt. Để hạn chế thấp nhất các biến chứng của chứng tắc nghẽn mạch máu thì thời gian xử lý huyết khối trong mạch là một yếu tố vô cùng quan trọng. Thuốc tan huyết khối dạng tiêm đƣợc sử dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên, thuốc dạng tiêm đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao. Các enzyme tái tổ hợp thông thƣờng thƣờng dung hợp đuôi 6xhistidine để thuận tiện cho quá trình tinh sạch, nhƣng việc dung hợp đuôi 6xhistidine đƣợc xem là có thể gây tác dụng phụ cho con ngƣời. Trên cơ sở đó, trong khuôn khổ đề tài KC10.28 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị” tôi thực hiện đề tài luận văn “Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch streptokinase tái tổ hợp trong Escherichia coli” tiến tới sản xuất dƣợc phẩm sinh học điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao. III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SK SK đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới trong điều trị chứng tắc nghẽn mạch máu. Tuy nhiên các chủng tổng hợp SK tự nhiên là những chủng gây độc cho con ngƣời và hiệu suất tổng hợp thấp. Do đó việc nghiên cứu SK trên thế giới chủ yếu đi theo hƣớng nghiên cứu sản xuất SK tái tổ hợp. Streptococcus pyogenes, S. equisimilis, S. uberis là ba loài đƣợc sử dụng phổ biến trong nhân dòng và biểu hiện gene SK. Hiện nay đã có 142 trình tự gene mã hóa SK (sk) đƣợc đăng kí trong GeneBank, trong đó có 115 gene từ các chủng S. pyogenes, 23 gene từ các chủng S. equisimilis và 4 gene từ các chủng S. uberis. Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli Năm 1984, Malke et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng S. equisimilis H46A, biểu hiện trong E. coli và S. sanguis thu đƣợc SK có hoạt tính sinh học nhƣ chủng tự nhiên. Tác giả sử dụng vector pACYC184 và pBR322 để biểu hiện trong E. coli thu đƣợc hoạt tính từ 8 đến 100 U/ml dịch nuôi cấy. Năm 1989, Walter et al. đã nhân dòng thành công gene mã hóa SK từ chủng S. pyogenes type 1. Sau đó đến năm 1992, Esrtrada et al. đã biểu hiện gene này trong E. coli W3110 cho SK có hoạt tính nhƣ tự nhiên với năng suất biểu hiện đạt 25% protein tổng số. Năm 1995, Ko et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis. Tác giả thay thế trình tự peptide tín hiệu của sk bằng tín hiệu ompA, sử dụng vector pKK223-3 biểu hiện trong E. coli JM109. Hoạt tính thu đƣợc đạt 5000 U/ml dịch nuôi cấy sau 12 giờ cảm ứng bằng IPTG. Cũng năm 1995, Kubo et al đã nghiên cứu hoạt hóa SK tái tổ hợp từ E. coli. Các tác giả xử lý bằng nhiệt độ để tái cuộn xoắn cấu trúc SK bị biến tính bởi guanidine hydrochloride. Hoạt hóa ở 50°C làm tăng 10% hoạt tính enzyme và 25% hoạt tính riêng, cao hơn xử lý ở 20°C. Năm 1997, Avilan et al. đã nhân dòng sk từ chủng S. equisimilis và biểu hiện trong E. coli JM105. SK thu đƣợc giống với dạng tự nhiên. Ba sản phẩm SK thu đƣợc có khối lƣợng phân tử lần lƣợt tƣơng ứng là 47,5; 45 và 33 kDa. Năm 1999, Johnsen et al. Nhân dòng sk từ chủng S. uberis NCTC 3858 và đọc trình tự cho thấy SK này tƣơng đồng khoảng 26% với SK của S. pyogenes và S. equisimilis. Protein suy diễn có 286 amino acid, trong đó peptide tín hiệu dài 25 amino acid. Trình tự amino acid của SK này bị thiếu các amino acid đầu C so với trình tự amino acid của SK từ chủng S. pyogenes và S. equisimillis Năm 1999, Caballero et al. sử dụng vector pQE30 để biểu hiện SK trong E. coli cho hoạt tính tƣơng đƣơng với SK tự nhiên [10]. Đồng thời Pupo et al. đã biểu hiện nội bào đối với sk từ S. equisimilis sử dụng vector biểu hiện pTrp. Hiệu suất biểu hiện đạt 15% protein tổng số (thấp hơn của Estrada). Tuy nhiên SK tái tổ hợp ở dạng hòa tan nên tinh sạch dễ dàng hơn Năm 2007, Reza et al. đã sử dụng vector pGEX để biểu hiện SK trong E. coli với năng suất biểu hiện đạt 50% protein tổng số. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng 3 dòng tế bào E. coli BL21 để biểu hiện là E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) plysS, E. coli BL21 CodonPlus. Các dòng tế bào này thiếu hụt các sản phẩm gene protease trong bào tƣơng nhƣ Lon, OmpT, DegP và HtpR với mục đích tạo năng suất biểu hiện cao cho protein hội nhập. Kết quả cho thấy tế bào E. coli BL21 (DE3) physS cho năng suất cao nhất đạt 15000 U/ml dịch nuôi cấy. Năm 2008, Babu et al. Tinh sạch SK đạt độ sạch là 99%. Các tác giả cũng nghiên cứu hoạt hóa SK sau khi xƣ lý bằng guanidine. Theo đó một số chất hoạt động bề mặt không gây ion hóa nhƣ Trixton X-100, Tween 20, Tween 80 có tác dụng hoạt hóa SK. Việc bổ sung 10% glycerol làm tăng độ bền của enzyme Năm 2009, Goyal et al. đã nghiên cứu phƣờng pháp nuôi lắc có bổ sung dƣỡng chất kết hợp với tối ƣu các điều kiện nuôi cấy để biểu hiện SK tái tổ hợp trong E. coli cho năng suất cao. Theo đó, nồng độ oxy hòa tan từ 30% đến 50% không ảnh hƣởng đáng kể đến điều kiện nuôi lắc; bổ sung dƣỡng chất năng suất biểu hiện tăng vƣợt bậc, từ 188 mg/L lên 720 mg/L. Việc bổ sung cao nấm men và kiểm soát pH môi trƣờng làm năng suất biểu hiện tăng gấp 2 lần. Tổng hợp các điều kiện nuôi cấy, năng suất biểu hiện đạt 1120 mg/L, tăng gấp 14 lần so với ban đầu. Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris Năm 1989, Hagenson et al. sử dụng promoter của alcohol oxidase từ P. Pastoris để biểu hiện sk trong nấm men cho năng suất đạt 77 mg/L và hoạt tính đạt 3000 U/ml. Năm 2000, Pratap et al. đã nhân dòng sk từ S. equisimilis và biểu hiện trong Pichia pastoris. SK thu đƣợc có khối lƣợng phân tử là 55 kDa, cao hơn SK gốc nhƣng có hoạt tính tƣỡng đƣơng. Các tác giả chỉ ra rằng SK có khối lƣợng cao hơn là do hiện tƣợng glycosyl hóa. Hoạt tính SK đạt 3200 U/ml dịch nuôi cấy. Năm 2009, Vellanki et al. sử dụng gene sk nối ghép xuôi chiều với promoter glyceraaldehyde -3- phosphate dehydrogenase và biểu hiện trong P. pastoris với hoạt tính đạt 1120 U/ml. Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus Năm 1986, Klessen et al. biểu hiện sk trong Bacillus subtilis, hoạt tính SK bị giảm ở cuối pha sinh trƣởng do các protease của chính B. subtilis tiết ra làm bất hoạt. Năm 1994, Wong et al. sử dụng gene nhân dòng sẵn có để biểu hiện trong B. subtilis WB600 (đã gây đột biến mất 6 protease ngoại bào). Kết quả cho thấy 10-20% SK tiết ra ngoài môi trƣờng bị thoái hóa từ dạng 47 kDa thành 44 kDa, làm giảm hoạt tính sinh học của SK. Sự thoái hóa này là do một số gốc amino acid kị nƣớc trong phân tử SK là đích của chymotrypsin (protease do tế bào tiết ra). Do đó các tác giả đã tạo chủng đột biến pSKC-27 có glutamate tại vị trí 29 đƣợc thay bằng lysine, SK thu đƣợc có hoạt tính tăng 2,5 lần. Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác Năm 1985, Dao và Ferretti sử dụng vector pSA3 (kháng ery, chlo, tet) để biểu hiện SK trong S. sanguis thu đƣợc protein có khối lƣợng phân tử 42 kDa nhƣng có hoạt tính sinh học nhƣ SK tự nhiên. Kích thƣớc protein thấp hơn có thể là do kết quả của quá trình sau dịch mã. Năm 2004, Kumar và Singh biểu hiện SK trong nấm men Sz. pombe đã bị đột biến mất protease ngoại bào. Kết quả thu đƣợc SK biểu hiện ở dạng ngoại bào với năng suất 50-100%, đạt 2450 U/ml dịch nuôi cấy. Hiệu suất biểu hiện đạt 24,5 mg/L và hoạt tính riêng đạt 1581 U/mg protein. Năm 2006, Sriraman et al biểu hiện SK trong L. lactic với promoter P170. SK thu đƣợc bị thủy phân do tác động của môi trƣờng nuôi cấy. Ở môi trƣờng nuôi cấy có pH thấp, có glucose, acid lactic sẽ tích tụ gây đáp ứng kháng acid cho tế bào làm giảm khả năng sản xuất streptokinase. Khi cải thiện môi trƣờng nuôi cấy, tăng pH và nồng độ phosphate ban đầu làm tăng khả năng tổng hợp SK lên 2,5 lần Tại Việt Nam Năm 2001-2002, Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: “Nghiên cứu ứng dụng điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cấp bằng Streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng” (Sở khoa học và Công nghệ Hải Phòng). Năm 2003, Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung đã nghiên cứu cách điều trị khối huyết trong tai biến mạch máu não. Các tác giả đã đƣa ra công thức và phác đồ điều trị khối huyết. Các thuốc làm phân hủy huyết khối đƣợc thành lập trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số hoạt động theo cở chế kích hoạt plasmin, plasmin sẽ phân giải huyết khối. Các thuốc làm tan huyết khối gồm streptokinase, urokinase, scu-PA, rTPA. Năm 2004, Trần Minh Tâm et al. đã thực hiện đề tài nghiên cứu:“Điều trị tiêu sợi huyết bằng streptokinase trong nhồi máu cơ tim thấp”. Tác giả nên nhận xét bƣớc đầu về sử dụng thuốc streptokinase để điều trị tiêu sợi huyết cho 27 ca bị nhồi máu cơ tim ở Bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Yên từ 5/2001 đến 12/2004 cho tỷ lệ thành công là 63%. Theo dõi trong 30 ngày, bệnh nhân phục hồi tốt, ít biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận đƣợc. Các nghiên cứu về các chất có bản chất tƣơng tự nhƣ nattokinase, lumbrokinase cũng rất hạn chế. II. PHƢƠNG PHÁP - Các phƣơng pháp vi sinh vật. - Các phƣơng pháp sinh học phân tử. - Các phƣơng pháp hóa sinh. IV. KẾT QUẢ. 1. Nhân dòng thành công gene mã hóa streptokinase nonhis từ DNA tổng số của chủng Streptococcus pyogenes DT7. 2. Biểu hiện gene msk-nonhis với vector biểu hiện pET21a(+) trong tế bào E. coli JM109. Protein biểu hiện đạt năng suất 72% protein tổng số, hoạt tính đạt khoảng 10200 U/mg tế bào tƣơi. 3. Tinh sạch mSK-nonhis bằng phƣơng pháp phá siêu âm, dịch enzyme tinh sạch có hoạt tính cao nhất đạt 11318 U/mg protein. Dịch enzyme đƣợc hoạt hóa bằng Tween 20 (1,5%) có bổ sung 10% glycerol ở 4°C trong 6 sau khi xử lý bằng guanidine có hoạt tính tăng 8 lần; hoạt tính cao nhất đạt 95463 U/mg protein. References Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Văn Nam and Lê Thị Cẩm Dung, Điều trị chống huyết khối trong tai biến mạch máu não. Tạp chí Y học TP HCM, 2003. 7(1): p. 14-19. 2. Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn Thị Hiền, and Quyền Đình Thi, Biểu hiện gene mã hóa streptokinase từ Streptococcus pyogenes DT17 trong Bacillus subtilis. Hội nghị 35 năm thành lập Viện Công nghệ sinh học, 2010: p. 262-267. 3. Trần Minh Tâm, Lê Phải, Châu Khắc Toàn, Cao Văn Diệu, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, and Nguyễn Thành Huy, Điều trị tiêu sợi huyết bằng Streptokinase trong nhồi máu cơ tim cấp. Tạp chí Y học thực hành, 2005. 8: p. 15-18. 4. Vũ Hồng Diệp, Nghiên cứu biểu hiện Streptokinase. Luận án tiến sĩ, Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, 2010. 5. Vũ Hồng Diệp, Nguyễn Thị Ngọc Dao, and Quyền Đình Thi, Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa streptokinase từ chủng Streptococcus pyogenes DT7. Tạp chí CNSH, 2008. 6(4A): p. 757-763. Tài liệu tiếng Anh 6. Avilan L, A Yarzabal, and C Jurgensen, Cloning, expression and purification of recombinant streptokinase: partial characterization of the protein expressed in Escherichia coli. Braz J Med Biol Res, 1997. 30(12): p. 1427-1430. 7. Babu PVC, VK Srinivas, VK Mohan, and E Krishna, Renaturation, purification and characterization of streptokinase expressed as inclusion body in recombinant E. coli. J Chromatogr, 2008. 861: p. 218-226. 8. Bajaj AP and FJ Castellano, Activation of human plasminogen by equimolar levels of streptokinase. J Biol Chem, 1977. 252: p. 492–498. 9. Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-254. 10. Burket MW, MR Smith, TE Walsh, PS Brewster, and TD Fraker, Relation of effectiveness of intracoronary thrombolysis in acute myocardial infarction to systemic thrombolytic state. Am J Cardiol, 1985. 55: p. 1453-8. 11. Caballero AR, R Lottenberg, and K Johnston, Cloning, expression, sequence analysis, and characterization of streptokinase secreted by porcine and equine isolates of Streptococcus equisimilis. Infect Immun, 1999. 67(12): p. 6478-6486. 12. Christensen LR, Streptococcal fibrinolysin: a proteolytic reaction due to serum enzyme activated by stretococcal fibrinolysin. J Gen Physiol, 1945. 28: p. 363-383. 13. Colin DM and L Dejan, Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PloS Med, 2006. 3(11): p. 442. 14. Craven LL, Acetylsalicylic acid: possible preventive of coronary thrombosis. Ann West Med Surg, 1950. 4: p. 95-99. 15. Dao ML and JJ Ferretti, Streptococcus Escherichia coli shuttle vector pSA3 and its use in the cloning of streptococcal genes. Appl Environ Microbiol, 1985. 49(1): p. 115-119. 16. Estrada MP, L Hernandez, A Perez, P Rodriguez, R Serrano, R Rubiera, A Pedraza, G Padron, W Antuch, DLJ Fuente, and L Herrera, High level expression of streptokinase in Escherichia coli. Bio Technology, 1992. 10: p. 1138-1142. 17. Fletcher AP, N Alkjaersig, A Davies, M Lewis, J Brooks, W Hardin, W Landau, and ME Raichle, Blood coagulation and plasma fibrinolytic enzyme system pathophysiology in stroke. Stroke, 1976. 7: p. 337-348. 18. Fletcher AP, N Alkjaersig, and S Sherry, The maintenance of a sustained thrombolytic state in man. I. Induction and effects. Clin Invest J 1959. 38: p. 1096-1110. 19. Fletcher AP, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Sherry, Treatment of patients suffering from early myocardial infarction with massive and prolonged streptokinase therapy. Trans Assoc Am Physicians, 1958. 71: p. 287-296. 20. Fletcher AP, S Sherry, N Alkjaersig, FE Smyrniotis, and S Jick, The maintenance of a sustained thrombolytic state in man.II. Clinical observations on patients with myocardial infarction and other thromboembolic disorders. Clin Invest J 1959. 38: p. 1111-1119. 21. Frans VW, B Jeroen, A Betriu, C Blomstrom, F Crea, V Falk, G Filippatos, K Fox, K Huber, A Kastrati, A Rosengren, PG Steg, M Tubaro, F Verheugt, F Weidinger, and M Weis, Management of acute myocardial infarction in patients presenting with persistent ST- segment elevation. Eur Heart J, 2008. 29(23): p. 2909-2945. 22. Goyal D, G Sahni, and DK Sahoo, Enhanced production of recombinant streptokinase in Escherichia coli using fed-batch culture. Bioresour Technol, 2009. 100(19): p. 4468-4474. 23. Hagenson MJ, KA Holden, KA Parker, PJ Wood, JA Cruze, M Fuke, TR Hopkins, and DW Stroman, Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast. Enzyme Microb Technol, 1989. 11: p. 650-656. 24. Hager K. Prevent Heart Attack and Stroke with Potent Enzyme that Dissolves Deadly Blood Clots in Hours, http://www.dnavitamins.co.uk. 2002. 25. Hermentin P, T Cuesta-Linker, J Weisse, K Schmidt, M Knorst, M Scheld, and e al., Comparative analysis of the activity and content of different streptokinase preparations. Eur Heart J 2005. 26(9): p. 933-40. 26. Hernandez L, P Rodriguez, A Castro, R Serrano, MP Rodriguez, R Rubiera, MP Estrada, A Perez, J de la Fuente, and L Herrera, Determination of streptokinase activity by quantitative assay. Biotecnol Apl, 1990. 7(2): p. 153-160. 27. Hoffman R, EJ Benz, SJ Shattil, B Furie, and HJ Cohen, Hematology: Basic Principles and Practice 1991: Churchill Livingstone New York 28. Hubbard WN, The systemic toxic responses of patients to treatment with streptokinase streptodornase. J Clin Invest, 1951. 30: p. 1171-4. 29. Ichinose A, K Takio, and K Fujikawa, Localization of the binding site of tissue-type plasminogen activator to fibrin. J Clin Invest 1986. 78(1): p. 163-169. 30. Johnsen LB, K Poulsen, M Kilian, and TE Petersen, Purification and cloning of a streptokinase from Streptococcus uberis. Infect Immun, 1999. 67: p. 1072-1078. 31. Johnson AJ, The lysis in rabbits of intravascular blood clots by the streptococcal fibrinolytic system (streptokinase). Exp Med J, 1952. 95: p. 449-494. 32. Ju J, I Kheterpal, JR Scherer, C Ruan, CW Fuller, AN Glazer, and RA Mathies, Design and synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for DNA sequencing and analysis. Anal Biochem, 1995. 231(1): p. 131-40. 33. Klessen C and H Malke, Expression of the streptokinase gene from Streptococcus equisimilis in Bacillus subtilis. J Basic Microbiol, 1986. 26(2): p. 75-81. 34. Ko JH, DK Park, IIC Kim, SH Lee, and SM Byun, High level expression and secretion of streptokinase in Escherichia coli. Biotechnol Lett 1995. 17: p. 1019-1024. 35. Kubo M and A Nishi, Improved method for prourokinase refolding with inclusion body from recombinant Escherichia coli. J Ferment Bioeng, 1995. 80(6): p. 622-624. 36. Kumar R and J Singh, Expression and secretion of a prokaryotic protein streptokinase without glycosylation and degradation in Schizosaccharomyces pombe. Yeast, 2004. 21(16): p. 1343-1358. 37. Kunamneni A, TT Abdelghani, and P Ellaiah, Streptokinase the drug of choice for thrombolytic therapy. J. Thromb Thrombolysis, 2007. 23: p. 9-23. 38. Kuppusamy M, VK Srinivas, S Lahiri, K Ella, and GS Khatri, Recombinant streptokinase, 2006, Bharat Biotech International, Ltd.: USA. p. 1-14. 39. Lizano S and KH Johnston, Structural diversity of streptokinase and activation of human plasminogen. Infect Immun, 2005. 73(7): p. 4451-4453. 40. Malke H and JJ Ferretti, Streptokinase: cloning, expression and excretion by Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1984. 81: p. 3557-3561. 41. Mathers CD, T Boerma, and DM Fat, Global and regional causes of death. Br Med Bull., 2009. 92: p. 7-32. 42. Nikhil S and B Amit, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction. Tex Heart Inst J, 2007. 34(3): p. 318-27. 43. Pratap J, G Rajamohan, and KL Dikshit, Characteristics of glycosylated streptokinase secreted from Pichia pastoris: enhanced resistance of SK to proteolysis by glycosylation. Appl Microbiol Biotechnol, 2000. 53(4): p. 469-475. 44. Pupo E, BA Baghbaderani, V Lugo, J Fernandez, R Paez, and I Torrens, Two streptokinase genes are expressed with different solubility in Escherichia coli W3110. Biotechnol Lett, 1999. 21: p. 1119-1123. 45. Reddy KN, Streptokinase-biochemistry and clinical application. Enzyme, 1988. 40: p. 79-89. 46. Reza NM, MM Hossein, B Mohammad, and C Mahmood, Cloning and overexpression of active recombinant fusion streptokinase: A new approach to facilitate purification. Pakistan J. of Bio. Sci, 2007. 10(13): p. 2146-2151. 47. Sanger F, S Nicklen, and AR Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977. 74(12): p. 5463-7. 48. Schmutzler R, F Heckner, P Kortge, J van der Loo, A Pezold, and H Poliwoda, Thrombolytic therapy of recent myocardial infarction. I. Introduction, plan of trial, general clinical results. Ger Med Mon, 1966. 11: p. 308-14. 49. Sherry S, A Titchener, L Gottesman, P Wasserman, and W Troll, The enzymatic dissolution of experimental arterial thrombi in the dog by trypsin, chymotrypsin and plasminogen activators. J Clin Invest, 1954. 33: p. 1303-1313. 50. Shi GY, BI Chang, SM Chen, DH Wu, and HL Wu, Function of streptokinase fragments in plasminogen activation. Biochem J, 1994. 304(1): p. 235-241. 51. Sikri N and A Bardia, A history of streptokinase use in acute myocardial infarction. Tex Heart Inst J, 2007. 34(3): p. 318-327. 52. Smith RAG, RJ Dupe, and J Green, Fibrinolysis with acyl-enzymes: a new approach to thrombolytic therapy. Nature, 1981. 290: p. 505-508. 53. Sriraman K and G Jayaraman, Enhancement of recombinant streptokinase production in Lactococcus lactis by suppression of acid tolerance response. Appl Microbiol Biotechnol, 2006. 72: p. 1202-1209. 54. Sumi H, H Hamada, and H Mihara, A novel strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese "natto" International 5. J Thromb Thrombolysis, Amsterdam, 1988. 2: p. 67. 55. Thomas A, Gaziano, A Bitton, S Anand, SA Gessel, and A Murphy, Growing epidemic of coronary heart disease in low- and middle- income countries. Curr Probl Cardiol., 2010. 35(2): p. 72-115. 56. Tillett W and S Sherry, The effect in patients of streptococcal fibrinolysin (streptokinase) and streptococcal desoxyribonuclease on fibrinous, purulent, and sanguinous pleural exudations. Clin Invest J 1949. 28: p. 173-190. 57. Tillett WS and RL Garner, The fibrinolytic activity of hemolytic streptococci. J Exp Med, 1933. 58: p. 485–502. 58. Tillett WS, AJ Johnson, and WR McCarty, The intravenous infusion of the streptococcal f ibrinolytic principle (streptokinase) into patients. J Clin Invest, 1955. 34: p. 169-185. 59. Tollefsen D, Blood coagulation. http://tollefsen.wustl.edu/projects/ coagulation, 2009. 60. Vellanki RN, R Potumarthi, and LN Mangamoori, Constitutive expression and optimization of nutrients for streptokinase production by Pichia pastoris using statistical methods. Appl Biochem Biotechnol, 2009. 158(1): p. 25-40. 61. Vermeer F, ML Simoons, FW Bar, JGv Tijssen, RT Domburg, PW Serruys, and e al., Which patients benef it most from early thrombolytic therapy with intracoronary streptokinase. Circulation, 1986. 74: p. 1379-1389. 62. Wakeham N, S Terzyan, P Zhai, LA Loy, J Tang, and XC Zhang, Effects of deletion of streptokinase residues 48-59 on plasminogen activation. Protein Eng, 2002. 15: p. 753-761. 63. Walley T, Y Dundar, R Hill, and R Dickson, Superiority and equivalence in thrombolytic drugs: an interpretation. QJM, 2003. 96(2): p. 155-160. 64. Walter F, M Siegel, and H Malke, Nucleotide sequence of the streptokinase gene from a group-G Streptococcus. Nucleic Acids Res, 1989. 17(3): p. 1261-1262. 65. Wang X, J Tang, B Hunter, and XC Zhang, Crystal structure of streptokinase beta-domain. FEBS Lett, 1999. 459: p. 85-89. 66. Wong SL, R Ye, and S Nathoo, Engineering and production of streptokinase in a Bacillus subtilis expression-secretion system. Appl Environ Microbiol, 1994. 60(2): p. 517-523. . Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch Streptokinase tái tổ hợp từ chủng Streptococcus pyogenes trong E. coli. Nguyễn Thị Thƣơng. gene mã hóa SK (sk) đƣợc đăng kí trong GeneBank, trong đó có 115 gene từ các chủng S. pyogenes, 23 gene từ các chủng S. equisimilis và 4 gene từ các chủng