ng thang alen ch th hunh quang cho 05 locus penta E, D18S51, c v nh i i hc Khoa hc T  LuDi truyn hc: 60 42 70 ng dn:   o v: 2012 Abstract.  d th  v c s dng trong nhn d  hiu ch to thang alen ch th hunh qu  u kt qu t AND, kt qu kim tra sn ph agrose, kt qu n di kht qu la chn mu tinh sch sn phi. Keywords. Di truyn hnh; M Content MỞ ĐẦU Nhi th k ng kin s a k thut di truyn k t n ra ci xo i ADN t mng ADN rt nh u trong ng nghi    c ng dng ru v y, sinh h s nhm m  i.  k n nhng ng d  c tii Anh u cng s  i. H t  bao gm nhc lp li mt s ln lp    n lc m quan tr bit s . Vi s n ca k thut gen, nhin lp l hi vi lp li b dng enzyme gii hn lp li ngu   lp l lp li ngn, ch t 2-t hp k thun d th t tm cao m   c phc nhng hn ch ct thanh h  c quan h huyt thng cha-con, m-con,  d lii phm.    ng thi u ch t KIT phc v cho mc nhi sinh h i ting dng ln. Ngay t gia nha th k  sn xu phm sinh hng nhiu b  t ra i. Mi b  n, mn quan tr thiu. t hn hp bao gm tt c  xut hin trong mt qun th i nhnh. S t cnu gen ca mt k m u cn s d   t cao, th tc nhp khi th tr ngi cho ving r Vit Nam.  ch ng v ng thi phc v  i Vic khoa h n t trin khai r  t  Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định. M h tc thang alen ch th gn hunh quang cho 05  d  dng phc h  s d t b scan gel hunh quang phc v . CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phƣơng pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN 1.1.1. Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể Vi s u cn ra bn cht di truyn n t chui nucleotide gm 4 loi bp xp k tip nhau, s  ca 4 lo ADN cm sc th  trong mi t a m   . u v cn thy nhiu gen ca sinh v   t s sinh v         n phm (protein) xen gic gi  lp l c i: -  lp li nhiu ln chim 10-15% b ng vng  lp li khong 10-ng tp trung  ng hoc  u nhim sc th. -   ln lp lm khong 25-40% b  c l- lp li nhiu ln,   h gen. 1.1.2. Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN 1.1.2.1. K thut RFLP  thut dn ng chup (PCR) 1.2. Đại cƣơng về các locus STR đƣợc sử dụng trong nhận dạng cá thể ngƣời Nhc lp l dng rc khoa h u sau:   d hp t cao, n  D i h ng thi (multiplex PCR)  t bin gen thp.  c ng y b c t nhng m y mt phn. 1.2.1. Các locus STR ứng dụng trong phân tích cá thể người Hình 1. Cu trc phn t ADN 1.2.2. Các locus sử dụng trong nghiên cứu Bảng 1.  u TT Locus Vị trí Đơn vị lặp Số đoạn lặp Kích thƣớc sản phẩm PCR 1 Penta E  NST s 15 [AAAGA] 5 - 26 379  484 bp 2 D18S51  NST s 18 [AGAA] 7 - 27 286 - 373 bp 3 D21S11  NST s 21 [TCTA], [TCTG] 12, 24 - 41.2 203 - 273 bp 4 TH01 n NST s 11 [AATG] 3 - 14 152 - 196 bp 5 D3S1358 n NST s 3 [TCTG], [TCTA] 8 - 20 115 - 147bp 1.3. Các phƣơng pháp phát hiện ADN 1.3.1. Phương pháp nhuộm Ethidum bromide 1.3.2. Phương pháp đánh dấu phóng xạ 1.3.3. Phương pháp nhuộm bạc 1.3.4. Phương pháp đánh dấu huỳnh quang Đánh dấu huỳnh quang sản phẩm PCR  thc hin b   Kt hp mt thuc nhum hun phi bng mc u hunh quang.  S du hunh quang khi thc hin PCR.  S dng thuc nhum hu g S dng mu hunh quang s khc ph  mt sa sn ph n c x  liu, mu hui nhing tht phn t qu vc lp. Tuy vic gn xen hunh n ca sn phm PCR trong gel hoc mao qun, v  khc phc bn ma kiu gen ca m n b thang alen ch th  i vi thit k c hi ng bng ca vic gn thuc nhu ADN. Sự phát hiện huỳnh quang: Nguc chic nhum hunh quang c gn  cu  p th ng t ngun laser ng thc s d ghi nhi m th hoc m ng quang t hoc mt thit b n s thu thu t  n t. Nhu hin m nh cn di mao qun hon di. 1.4. Đại cƣơng các về chất huỳnh quang và ứng dụng trong phân tích ADN 1.4.1. Khái niệm về chất huỳnh quang 1.4.2. Ứng dụng chất huỳnh quang trong phân tích ADN Hin nay, ht c  u  dng mu hunh quang. Bng 5 tng kt mt s thuc nhum huc s d u sn phi vi thuc nhuc sp x  c Bảng 3. a mt s thuc nhum hunh quang s dng trong  i Thuốc nhuộm Tên hóa học Ánh sáng kích thích cực đại (nm) Ánh sáng phát ra cực đại (nm) 5-FAM 5- carboxy fluorescein 493 522 JOE 6- carboxy--dim eoxy-- dichl orofluor escein 528 554 VIC Độc quyền của Applied Biosystems 538 554 NED Độc quyền của Applied Biosystems 546 575 PET Độc quyền của Applied Biosystems 558 595 LIZ Độc quyền của Applied Biosystems 638 655 ROX (CXR) 6-carboxy-X-rhodamine 587 607 Fluorescein (FL) Fluorescein 490 520 TMR (TAMRA) -tetramethyl-6 carboxyfluorescein 560 583 TET -hexachloro-6- carboxyfluorescein 522 538 HEX -hexachloro-6- carboxyfluorescein 535 553 Rhodamine Red -X (Molecular Probes) 580 590 Texas Red -X (Molecular Probes) 595 615 SYBR Green (intercalator) Độc quyền của Molecular Probes 497 520 Mi b thuc nhum huc s dng php vt b quang hc, nguy, khm b  dng mi gn huu cht ch v t b s dng  1.5. Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước  Vit Nam, trong kho lc ng d thu ch th  t th tu.          dp mi hunh quang trong ch to thang alen ch th ti Vi n  ng thang alen ch th hunh quang vi mm   cu. Nu g u. m tra sn ph thu nhn mu s dng cho ch to thang alen 3. Ch ti locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 4. Ch to thang alen phc ht phn ng PCR. CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu u s d  gng 50 mu), 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358. Mn K562 c 2.1.2. Thiết bị, vật tư nghiên cứu 2.1.3. Mồi cho ca ́ c locus nghiên cư ́ u Bảng 4. u TT Primer Trình tự mồi 1 D3-1 5'- ACT GCA GTC CAA TCT GGG T -3' 2 D3-2 5'-[FL]-ATG AAA TCA ACA GAG GCT TGC -3' 3 TH-1 5'-[FL]-GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC -3' 4 TH-2 5'- ATT CCT GTG GGC TGA AAA GCT C -3' 5 D21-1 5'- ATA TGT GAG TCA ATT CCC CAA G-3' 6 D21-2 5'-[FL]-TGT ATT AGT CAA TGT TCT CCA GAG AC -3' 7 D18-1 5'-[FL]-TTC TTG AGC CCA GAA GGT TA -3' 8 D18-2 5'-ATT CTA CCA GCA ACA ACA CAA ATA AAC -3' 9 Penta E-1 5'-ATT ACC AAC ATG AAA GGG TAC CAA TA -3' 10 Penta E-2 5'-[FL]-TGGGTTATTAATTGAGAAAACTC CTTACAA TTT-3' 2.1.4. Hoá chất  Hóa chất tách chiết ADN    n di 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Chn mu th FTA  c lu gi v bo qun Mồi huỳnh quang đã được lựa chọn Tch chit mu bng Chelex PCR Định lượng các mẫu khuôn ADN in di acrylamide Điện di Agarose kiểm tra sản phẩm PCR Chn sn phm PCR mang alen Tinh sch sn phm PCR Phi trn to thang alen n Phi trn to thang alen phc Nhn bi thang alen nhiu cp Kiểm tra tỷ lệ phối trộn Kiểm tra tỷ lệ phối trộn Định lượng sản phẩm PCR Hình 3. M hnh th nghim 2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN 2.2.2. Phương pháp định lượng ADN 2.2.3. Phương pháp nhân bội ADN 2.2.4. Kỹ thuật điện di ADN Điện di trên gel agarose Điện di trên gel Poly acrylamide 2.2.5. Phương pháp phát hiện ADN sau điện di ng Ethidium bromide ng k thut soi gel hunh quang 2.2.6. Phương pháp chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang  Chế tạo thang alen đơn  Chế tạo thang alen phức 2.2.7. Thu thập và xử lý dữ liệu CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN Kt qu kim tra b         m Ethidium c th hin  . Kt qu n di cho thy mc ADN tng s. Mu  chu tip theo. Kt qu u t cho thng t 20 ng/ tinh sch OD t 1,4 tr u t y m  tinh sch cn thi s dng cho k thut PCR. Hình 4. Kt qu n di agarose mt s mng s Ging 1  u ADN tng s 1 2 3 4 ADN tổng số 3.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm nhân bội trên gel agarose Locus Penta E n di cho thn phm c t chng t   u su   c sn phm nm trong khong 400  p v khi s dng cp mi cho locus Penta E. Locus D18S51 500bp 250bp Hình 5. Kt qu in di sn phm PCR locus Penta E ca mt s mu kho st Ging 1-6: Cc mu nhn bi locus Penta E (+): mu i chng dng, (-): Mu i chng m M50: Marker 50 - Thang kch thc ADN 50bp 1 2 3 4 5 M50 6 (+) (-) 500bp 250bp Hình 6. Kt qu in di sn phm PCR locus D18S51 ca mt s mu kho st Ging 7-11: Cc mu nhn bi locus D18S51 (+): Mu i chng dng M50: Marker 50 - Thang kch thc ADN 50bp 7 8 9 10 11 M50 (+) n di, sn phm PCR cc nm khong g. Locus D21S11 D thc sn ph c nm trong khong 250  300bp. Locus TH01 500bp 250bp Hình 8. Kt qu in di sn phm PCR locus TH01 ca mt s mu kho st Ging 2,3,7,9: Cc mu nhn bi locus TH01 (+): mu i chng dng, (-): Mu i chng m M50: Marker 50 - Thang kch thc ADN 50bp 2 3 7 9 (-) (+) M50 500bp 250bp Hình 7. Kt qu in di sn phm PCR locus D21S11 ca mt s mu kho st Ging 1-6: Cc mu nhn bi locus D21S11 (+): mu i chng dng, (-): Mu i chng m M50: Marker 50 - Thang kch thc ADN 50bp 1 2 3 4 5 6 M50 (+) (-) [...]... Thang alen locus D21S11 gồm 11 alen: từ alen số 29 đến alen số 34  Thang alen locus TH01 gồm 8 alen: từ alen số 5 đến alen số 11 (có alen số 9.3)  Thang alen locus D18S51 gồm 7 alen: từ alen số 13 đến alen số 19 2 Đã chế tạo thành công thang alen chỉ thị huỳnh quang phức hơ ̣p 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 sử dụng trên hệ thống scan huỳnh quang So với thang alen đơn lẻ, thang alen. .. sự và giải quyết nhu cầu dân sinh như xác định huyết thống CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.1 Kết luận 1 Đã chế tạo thành công thang alen chỉ thị huỳnh quang cho mỗi locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 sử dụng trên hệ thống scan huỳnh quang  Thang alen locus Penta E gồm 13 alen: alen số 5, từ alen số 9 đến alen số 20  Thang alen locus D18S51 gồm 10 alen: từ alen số 12 đến alen số 21  Thang. .. hợp nên thang alen thu được có các băng (các alen) đồng đều, có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo 3.6 Kết quả chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus Kết quả chế tạo thang alen phức như sau: LD LD K562 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 25 Kết quả chế tạo thang alen phức 05 locus LD: Thang alen phức hợp 05 locus hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn Thang alen phức hợp sau khi nhân bội được điện di... và một số mẫu khuôn khác Kết quả cho thấy, thang alen có thể sử dụng để định danh được kiểu gen của các mẫu Bên cạnh đó, theo tỷ lệ trộn mẫu D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E là 1: 1: 1: 1: 1, chúng tôi nhận thấy các thang alen thành phần chưa có sự tương đồng Hình ảnh cho thấy, thang alen D21S11 đậm nhất, sau đó đến thang alen D18S51, thang alen Penta E và D3S1358 tương đương nhau còn thang TH01. .. lệ Locus TH01 K562 3 LD 9.3 11 22 7 15 10 8 9 7 6 5 Hình 23 Kết quả chế tạo thang alen locus TH01 LD: Thang alen đơn được chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 3,22,7,15: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang 5-11: Các alen thu được sau khảo sát Thang alen locus TH01 thu được bao gồm các alen từ 5 đến 11, bao gồm một alen lẻ 9.3 Các băng ADN (các alen) của thang sau chế tạo có sự tương đồng cao cho. .. hợp cho phép xác định được kiểu gen của cá thể người cùng lúc 05 locus, do đó nâng cao hiệu quả phân tích giám định 1.2 Kiến nghị Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu và xác định được các điểm còn chưa giải quyết được, chúng tôi kiến nghị: 1 Giải trinh tự mô ̣t số alen của từng locus để kiểm tra tính chinh xác khi định từng alen ̀ ́ 2 Tiếp tục nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thi ̣huỳnh quang. .. TH01 cho hình ảnh mờ hơn so với các thang alen còn lại Do đó, chúng tôi điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn (thang alen đơn) D3S1358: TH01: D21S11: D18S51: Penta E ban đầu từ 1: 1: 1: 1: 1 thành 2: 4: 1: 2: 3 sử dụng cho phản ứng PCR, chúng tôi thu được kết quả điện di như sau: LD LD K562 Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 26 Kết quả điều chỉnh tỷ lệ trộn khuôn chế tạo thang alen phức 05 locus LD: Thang alen. .. K562 116 LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 28 Kết quả thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức được chế tạo trong nghiên cứu K562: Mẫu chuẩn - Giếng 101-116: Các mẫu nhân bội 05 locus 117 118 120 119 LD 122 121 LD 124 123 LD 126 K562 125 LD Penta E D18S51 D21S11 TH01 D3S1358 Hình 29 Kết quả thử nghiệm sử dụng thang alen phức cho phân tích LD: Thang alen phức được... phù hợp Locus D3S1358 6 12 18 LD 18 4 K562 19 17 16 15 16 14 13 Hình 24 Kết quả chế tạo thang alen locus D3S1358 LD: Thang alen đơn được chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 6,12,18,4: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang Thang alen locus D3S1358 thu được bao gồm các alen từ 13 đến 19 Tỷ lệ trộn mẫu 13-19: Các alen thu được sau khảo sát trong quá trình chế tạo thang phù hợp nên thang alen thu được... 22 Kết quả chế tạo thang alen locus D21S11 LD: Thang alen đơn được chế tạo hoàn chỉnh K562: Mẫu chuẩn; Giếng 9,11,4,21,7,3: Các mẫu lựa chọn cho chế tạo thang Sử dụng các mẫu đã lựa chọn để chế tạo thang alen locus D21S11, chúng tôi thu được 29-34: Các alen thu được sau khảo sát thang alen bao gồm các alen từ 29 đến 34 Kết quả cho thấy thang alen thu được có chất lượng tốt, các alen đồng đều, không . t   Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định. M. 1.5. Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 