Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis Nguyễn Thành Đạt Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: GS-TS Đỗ Ngọc Liên Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELIS, phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh chuột, kỹ thuật Western Blot … Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp). Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis. Keywords: Sinh học thực nghiệm; Kháng thể; Vi khuẩn than Content I. TỔNG QUAN Trong lịch sử phát triển lĩnh vực công nghệ sinh học, nghiên cứu ứng dụng miễn dịch học đã được đưa vào thực tiễn từ rất sớm. Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong cuộc sống như trong Y học điều trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh, phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc chất, ma túy, khoa học hình sự, phát hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như ELISA, Western Blot, Dot Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng. Ngày nay, các vi sinh vật nguy hiểm trong đó có vi khuẩn than (B. anthracis ) đã và đang được sử dụng để chế tạo vũ khí sinh học nhằm mục đích khủng bố. Hiện nay, trên thế giới đã xuất hiện nhiều test nhanh dạng sắc ký miễn dịch đã được thương mại hóa. Chúng có ưu điểm là thời gian cho kết quả nhanh chóng, độ chính xác cao, nhưng giá thành của các loại test này còn ở mức cao và thời gian nhập khẩu lâu. Mặt khác, ở Việt Nam, các vi sinh vật này chủ yếu được phát hiện qua các phương pháp PCR, ELISA Nhược điểm của các phương pháp này là cần một thời gian lâu để cho kết quả. Do đó, cần phải có công cụ để sàng lọc nhanh nhằm phát hiện sớm sự có mặt các tác nhân vi sinh vật này. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis.” Mục tiêu của đề tài bao gồm:  Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp)  Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis. Đây là bước đầu tiên trên con đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kháng thể đơn dòng tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ -Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật-Bộ Công An. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu - Chuột chủng dòng Swiss Mus musculus, được mua ở Viện Vệ sinh dịch tễ TW. - Chủng vi khuẩn B. anthracis (Viện vệ sinh phòng dịch Quân đội) - Cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP. (Hãng GE Healthcare) - Kháng nguyên: Kháng nguyên là protein BclA tái tổ hợp, được tinh sạch qua cột Talon (Niken) do nhóm nghiên cứu thuộc Phòng 3 Viện H57 Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật thực hiện. - Kháng thể: Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Alkaline Phosphatase antibody produced in goat, Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Peroxidase antibody produced in goat. - BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt), NBT (Nitrotetrazolium Blue chloride) được mua của hãng Sigma. Các hóa chất còn lại đều được đặt mua của các hãng nổi tiếng như: Merck, BCE…đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, Kỹ thuật ELIS, Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột, Kỹ thuật Western Blot…. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch Trước khi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp nhằm tránh khả năng làm giảm hiệu suất tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein quan tâm theo phương pháp điện di SDS-PEGE 12.5%. Mẫu BclA tái tổ hợp được pha theo tỷ lệ 1:2 với hỗn hợp dye (950μl đệm SDS-reducing và 50μl β – mercaptothanol). Mẫu được đun nóng 95 0 C trong 5-10 phút và được đổ vào giếng. Cài đặt máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút. Hình 1: Kết quả điện di protein BclA tái tổ hợp trên gel 12.5% M: Marker prestain (Fermentas) 1: Mẫu BclA tái tổ hợp chưa tinh sạch qua cột Talon (Niken) HP 2: Mẫu rửa qua cột Talon (Niken) HP 3,4,5,6: Các phân đoạn qua cột 116 kDa 66 kDa 45 kDa 35 kDa 25 kDa 18.5 kDa 1 3 4 5 6 M Kết quả điện di SDS-PAGE ở hình 1 cho thấy: ở cột thứ nhất tương ứng với dung dịch protein tổng số có xuất hiện một băng khá đậm có kích thước vào khoảng 35kDa, đây là kích thước của protein BclA, điều đó cho ta thấy trong dung dịch protein tổng số có chứa protein mong muốn. Cột thứ hai tương ứng với dịch rửa qua cột Niken chỉ xuất hiện các băng rất mờ đó là các protein không bám cột được đẩy ra bằng đệm rửa cột, tại vị trí 35kDa hầu như protein đã được giữ lại cột. Từ cột thứ ba đến cột thứ 6, là các phân đoạn tinh sạch chỉ bao gồm một băng duy nhất có trọng lượng 35kDa tương ứng với kích thước trọng lượng phân tử protein BclA được đẩy khỏi cột bằng đệm đẩy Imidazol. Như vậy, protein BclA qua cột Niken có độ tinh sạch và hiệu suất qua cột cao. Kháng nguyên BclA chỉ xuất hiện một băng duy nhất có trọng lượng khoảng 35 kDa đã đảm bảo cho quá trình gây đáp ứng miễn dịch tiếp theo. 3.2. Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch Chuột dùng cho thí nghiệm được kiểm tra miễn dịch trước khi gây đáp ứng miễn dịch để đảm bảo lô chuột gây đáp ứng không bị nhiễm B. anthracis . Chúng tôi tiến hành thu 200µl máu toàn phần của chuột theo phương pháp lấy máu từ tĩnh mạch đuôi chuột, sau đó để đông trong tự nhiên rồi tiến hành thu huyết thanh. Chúng tôi tiến hành cộng hợp huyết thanh của chuột với dung dịch hạt vàng nano có kích thước 40nm, OD 15 để kiểm tra xem sự có mặt của kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp cũng như dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. anthracis theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch. Kết quả thử nghiệm như hình 2. Trên các que thử số 1 và số 2, tại các vị trí T 1 và T 2 , tương ứng với vị trí được trải protein BclA tái tổ hợp và dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than, không thấy xuất hiện vạch mầu đỏ hồng. Điều đó cho thấy trong huyêt thanh của lô chuột thử nghiệm không chứa kháng thể kháng protein BclA dạng tái tổ hợp cũng như dạng tự nhiên. Như vậy, lô chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch đã đảm bảo không bị nhiễm bệnh bởi vi khuẩn B. anthracis, từ đó cho phép chúng tôi tiến hành những bước nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein tái tổ hợp BclA. Hình 2: Kết quả kiểm tra mẫu huyết thanh 1: T 1 được trải với mẫu protein BclA 2: T 2 được trải với dịch phá vỏ bào tử 3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột. Nhằm đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. anthracis, chúng tôi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng BclA tái tổ hợp với quy trình như sau: kháng nguyên BclA sau khi được tinh sạch bằng cột Talon (Niken) được hòa với đệm PBS và tá dược Freund’s (toàn phần và không toàn phần) rồi tiêm dưới da bụng chuột. Việc gây kháng thể ở chuột được thực hiện với hai lần tiêm, trong đó lần tiêm đầu tiên chúng tôi sử dụng tá dược toàn phần, lần tiêm nhắc lại chúng tôi sử dụng với tá dược không toàn phần. Khoảng cách giữa các lần tiêm là 2 tuần. Sau lần tiêm thứ hai 2 tuần chúng tôi tiến hành thu máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể có trong huyết thanh bằng kỹ thuật lai miễn dịch hoặc theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch. Thu nhận kháng huyết thanh từ lô chuột gồm 06 con được gây miễn dịch bằng BclA và kiểm tra hoạt độ của kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA Goat anti mouse (C) T 2 1 2 T 1 Hình 3: Biểu đồ Elisa về quá trình gây đáp ứng miễn dịch Kết quả ở hình 3 cho thấy, lượng IgG của chuột tăng dần theo các tuần gây đáp ứng miễn dịch. Đặc biệt, sau khi tiêm nhắc lại với hỗn hợp tá dược không đầy đủ và kháng nguyên BclA vào tuần thứ 2 thì lượng IgG tăng nhanh và ổn định vào tuần thứ 4 và tuần thứ 5. Điều đó chứng tỏ lô chuột được gây đáp ứng miễn dịch đã có phản ứng tích cực với kháng nguyên đưa vào và từ biểu đồ Elisa cũng cho chúng tôi biết thời điểm tiến hành thu máu tổng số của chuột được gây đáp ứng miễn dịch. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành cộng hợp dung dịch huyết thanh của chuột theo các tuần theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch với dung dịch hạt nano vàng có kích thước hạt là 40nm với OD 15, nhằm kiểm tra khả năng sinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trong quá trình gây đáp ứng miễn dịch. Bằng phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch (Hinh 4) cho thấy kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch và cộng hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein BclA tái tổ hợp với nồng độ 0.3mg/ml và mật độ trải lên màng là 0,1μl/1mm. Hình 4: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng BclA Vị trí C: Trải kháng thể đa dòng Goat anti mouse Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp 1: Huyết thanh thu tuần 1 2: Huyết thanh thu tuần 2 3: Huyết thanh thu tuần 3 4: Huyết thanh thu tuần 4 Kết quả trên cho thấy, trong dịch huyết thanh của chuột thấy có xuất hiện kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp được biểu hiện bằng sự hiện vạch mầu hồng tại vị trí T. Tại vị trí C chúng tôi trải kháng thể đa dòng của dê kháng lại IgG của chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích kiểm tra sự hoạt động của dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano 40nm. Tại que thử nhứ nhất, chúng ta thấy xuất hiện mầu hồng nhạt tại vị trí T cho ta thấy sau khi tiêm kháng nguyên vào lô chuột gây đáp ứng miễn dịch thì ngay tuần thứ nhất chuột đã có phản ứng đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên lạ khi tiêm vào dưới da chuột. Tại que thử thứ 2 vào tuần thứ 2 của quá trình gây đáp ứng miễn dịch đã có sự chững lại về lượng kháng thể sinh ra, bằng chứng 1 2 3 4 Goat anti mouse (C) BclA (T) của của kết luận trên là cường độ màu chỉ thị trên que ở vị trí T hầu như chênh rất ít so với tuần thứ nhất. Tại que thử thứ 3, tại thời điểm này chúng tôi tiến hành tiêm nhắc lại với lô chuột thí nghiệm. Tại que thử này đã thấy rõ sự khác nhau về màu sắc kết quả tại vị trí T với các que thử thứ nhất và thứ 2, cho ta thấy rằng quá trình tiêm nhắc lại đã cho kết quả tốt về đáp ứng miễn dịch với chuột. Ở que thử số 4, qua kết quả chỉ thị màu tại vị trí T, chúng tôi thấy rằng lượng kháng thể có tăng lên nhưng không nhiều. Do đó, chúng tôi tiến hành thu máu lô chuột gây đáp ứng miễn dịch, tiến hành thu huyết thanh chuột và tinh sạch kháng thể để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thay màng cộng hợp có chứa kháng thể kháng protein BclA tái tổ hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 vào que thử multi các loại thuốc gây nghiện là THC, Morphine để kiểm tra đánh giá khả năng phản ứng chéo và khả năng phong bế (block) các hạt vàng của dung dịch kháng thể kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano . Hình 5: Que thử miễn dịch kiểm tra khả năng phản ứng chéo và block hạt vàng Kết quả (Hình 5) thu được cho phép kết luận rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA không phản ứng chéo với các protein khác (ở đây là BSA – Bovine serum albumin). Mặt khác, trên que thử tại hai vạch T 1 và T 2 không xuất hiện vạch màu hồng cũng đồng nghĩa chứng tỏ trong dung dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng đã được block hoàn toàn các liên kết làm cho hạt vàng không còn khả năng phản ứng với các protein nào khác. Goat anti mouse (C) BSA conjugated THC (T 1 ) BSA conjugated Morphine (T 2 ) Từ đó cho phép chúng tôi kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công [...]... ứng của kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của các chủng vi khuẩn B anthracis , B. cereus, B. thuringiensis, B Subtilis 1: Dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> B subtilis 2: Dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> B cereus 3: Dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> B thuringiensis 4: Dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> B anthracis Trên < /b> que thử với dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của vi khuẩn B subtilis, cho kết quả âm tính điều đó chứng tỏ rằng kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> protein BclA tái... phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than Từ kết quả trên < /b> cho chúng tôi thấy rằng, b ớc đầu chúng tôi đã tạo < /b> thành công kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> b t được kháng < /b> nguyên < /b> tự nhiên của vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn B anthracis b ng cách tạo < /b> kháng < /b> nguyên < /b> trên < /b> vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> (BclA) theo con đường tái tổ hợp Để khẳng định một lần nữa kết quả trên < /b> chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng phát hiện của kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với kháng < /b> nguyên < /b> trên < /b> vỏ < /b> b o < /b> tử.< /b> .. nữa có thể < /b> khẳng định chúng tôi đã chế tạo < /b> thành công kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng phản ứng lại được với protein BclA tự nhiên Trên < /b> cơ sở đó, từ việc sản xuất thành công kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> lại protein BclA trên < /b> vỏ < /b> của b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than, chúng ta có thể < /b> tiến hành những nghiên < /b> cứu < /b> tiếp theo để sản xuất kháng < /b> thể < /b> đơn dòng < /b> đặc < /b> hiệu < /b> kháng < /b> lại BclA trên < /b> vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của... dòng < /b> kháng < /b> protein BclA tái tổ hợp trên < /b> chuột b ch đã thành công + Thứ hai: Kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng b t cặp với kháng < /b> nguyên < /b> trên < /b> vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than 3.7 Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của các chủng vi khuẩn B anthracis , B. cereus, B. thuringiensis B subtilis trên < /b> que thử dạng sắc ký miễn dịch Như chúng ta đã biết,... các protein trên < /b> vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của B subtilis Điều đó phù hợp với những khảo sát rằng, vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn B subtilis không có chứa thành phần protein BclA trên < /b> vỏ < /b> b o tử < /b> Mặt khác, thử nghiệm trên < /b> que thử nhanh với các chủng vi khuẩn B anthracis, B cereus, B thuringiensis, chúng tôi đều thu được kết quả phản ứng tốt giữa kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với các dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của các chủng vi khuẩn này Trên < /b> que thử... protein BclA có trong vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> của cả ba chủng vi khuẩn là B anthracis , B. cereus, B thuringiensis (hình 5) và chủng vi khuẩn không có protein BclA là B subtilis Do đó sau khi đã tinh sạch kháng < /b> thể < /b> kháng < /b> lại protein BclA tái tổ hợp b ng cột sắc ký ái lực Hitrap protein G- Sepharose HP, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ b khả năng b t cặp kháng < /b> nguyên < /b> kháng < /b> thể < /b> của kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử.< /b> .. phản ứng kháng < /b> nguyên-< /b> kháng < /b> thể < /b> giữa kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than (BclA tự nhiên) b ng phương pháp western blot Đây là một b ớc quan trọng để có thể < /b> khẳng định được quá trình gây tạo < /b> kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> từ kháng < /b> nguyên < /b> tái tổ hợp có khả năng b t cặp được với kháng < /b> nguyên < /b> tự nhiên từ vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn B anthracis 181kDa 115.5kDa 82.2kDa 64.2kDa 48.8kDa... được protein BclA tự nhiên có trên < /b> vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> B anthracis , chúng tôi tiến hành phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> B anthracis b ng cách cho b o < /b> tử < /b> vi khuẩn B anthracis vào trong đệm PBS pH 7.4 rồi tiến hành siêu âm b ng máy siêu âm Ultrasonic liquid processors trong vòng 15 phút Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi Trải các thành phần bao gồm: Goat anti mouse, BclA tái tổ... B anthracis theo phương pháp Western blot 3.6 Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than b ng phƣơng pháp Western blot Sau khi có kết quả kiểm tra khả năng b t cặp của kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> với dung dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than tự nhiên trên < /b> que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phản ứng kháng < /b> nguyên-< /b> kháng < /b> thể < /b> giữa kháng.< /b> .. Kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> lại protein BclA tái tổ hợp có phản ứng với protein BclA tự nhiên có mặt trong dịch phá vỏ < /b> b o < /b> tử < /b> vi khuẩn than HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Chúng tôi đã thành công trong việc tạo < /b> ra kháng < /b> thể < /b> đa < /b> dòng < /b> kháng < /b> lại protein BclA tái tổ hợp và kháng < /b> thể < /b> này có phản ứng tích cực với protein BclA tự nhiên Do đó, trong hướng nghiên < /b> cứu < /b> tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành sử dụng protein BclA . trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ b o tử B. anthracis. ” Mục tiêu của đề tài bao. Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ b o tử B. anthracis Nguyễn Thành Đạt Trường