Nghiên cứu một số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone Nguyễn Thị Việt Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: TS. Trương Hương Lan Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng quá trình thủy phân -glucosidase thương mại. Nghiên cứusữa đậu tương với chế phẩm enzyme nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng quá trình lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10. Keywords: Sinh học thực nghiệm; Cây đậu tương; Hiệu suất chuyển hóa; Isoflavone; Glycoside; Aglucone Content ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính cấp thiết của luận văn: Từ nhiều thế kỷ nay, đậu tương đã trở thành cây trồng chiếm vị trí quan trọng trong đời sống của con người như một nguồn thực phẩm. Các sản phẩm từ đậu tương đã và đang được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới với diện tích canh tác và sản lượng đậu tương hàng năm liên tục tăng. Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu tương tốt cho sức khỏe con người nhờ có chứa thành phần isoflavone. Một số hoạt tính sinh lý của isoflavone đã được tìm thấy liên quan đến sự điều chỉnh hormone như cải thiện các hội chứng tiền mãn kinh và tăng mật độ xương ở phụ nữ mãn kinh. Isoflavone cũng làm giảm các nguy cơ mắc các bệnh tim mạch mãn tính ở người bằng cách làm giảm nồng độ LDL-cholesterol huyết thanh nhờ hoạt tính chống oxi hóa của chúng. Ngoài ra, trong những nghiên cứu về ung thư, các isoflavone được tìm thấy có khả năng làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư vú và hữu ích trong điều trị ung thư tiền liệt tuyến. Hàm lượng isoflavone trong đậu tương nằm trong khoảng từ 50 – 3,000µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone. Dạng glycoside được cho là hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người do có trọng lượng phân tử lớn nhưng lại chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số. Trong khi đó, dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn với hàm lượng lớn hơn so với dạng glycoside tương ứng nhưng chỉ chiếm nồng độ rất thấp (từ 1 – 5% isoflavone tổng số). Mặc dù, các isoflavone dạng glycoside cũng được thủy phân một phần thành aglucone bởi nước bọt và sau đó bởi vi sinh vật đường ruột nhưng hiệu suất chuyển hóa thấp, phụ thuộc lớn vào tình trạng sức khỏe, chế độ ăn, giới tính,…. Trong khi đó, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng sự chuyển hóa isoflavone dạng glycoside sang aglucone được thực hiện nhờ quá trình 2 nảy mầm đậu tương, thủy phân bằng enzyme thương mại và quá trình lên men với vi sinh vật. Enzyme -glucosidase được coi là enzyme chìa khóa, chịu trách nhiệm cho quá trình chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone. Chính vì vậy, nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglucone trong các sản phẩm từ đậu tương đang trở thành một hướng nghiên cứu mới thu hút nhiều sự quan tâm của ngành công nghiệp thực phẩm. 2. Mục đích nghiên cứu và nhiệm vụ của đề tài Mục đích của luận văn: tạo ra các giải pháp nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglucone có hoạt tính sinh học cao trong sữa đậu tương. Sau đó, sữa đậu tương giàu isoflavone dạng aglucone sẽ được sấy phun tạo thành dạng bột làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng giàu isoflavone có tác dụng giảm nồng độ cholesterol trong máu, cải thiện sắc đẹp và sức khỏe cho phụ nữ đặc biệt phụ nữ ở thời kỳ mãn kinh, NỘI DUNG: 1. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng quá trình thủy phân sữa đậu tương với chế phẩm enzyme  -glucosidase thương mại. 2. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng quá trình lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10. 3. Những đóng góp mới của luận văn - Đã đưa ra được giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glucoside sang dạng aglucone trong sữa đậu tương bằng phương pháp thủy phân với chế phẩm enzyme thương mại với các thông số công nghệ tối ưu cho nguyên liệu đậu tương Việt Nam. Dịch sữa đậu tương được thủy phân trực tiếp với Sumizyme FP có hàm lượng cao của isoflavone dạng aglucone và protein. - Đã nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang aglucone bằng phương pháp lên men với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10. Khác với các nghiên cứu trước, quá trình lên men đậu tương với Bacillus hầu hết đều được tiến hành theo phương pháp lên men bề mặt với cơ chất đậu tương ở dạng rắn. Còn trong các nghiên cứu lên men sữa đậu tương thì chỉ có các chủng vi sinh vật sinh axit lactic như Lactobacillus, bifidobacterium được sử dụng. Đây là luận văn đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu quá trình lên men sữa đậu tương với Bacillus subtilis theo phương pháp lên men chìm với các ưu điểm như dễ dàng kiểm soát các yếu tố công nghệ và sản phẩm lên men và sản phẩm không tạo ra vị chua. Cả hai giải pháp đều đạt được hiệu suất chuyển hóa isoflavone cao. Tuy nhiên, phụ thuộc vào điều kiện thiết bị và mục đích sản xuất, chúng ta có thể lựa chọn một trong hai giải pháp này. 4. Bố cục của luận văn Luận văn dày 90 trang được bố cục như sau: Mở đầu 2 trang, tổng quan 30 trang, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 9 trang, kết quả và thảo luận 25 trang, kết luận 1 trang. Có 19 hình, 21 bảng, 78 tài liệu tham khảo và 4 phụ lục. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đậu tương 1.1.1. Nguồn gốc và sản lượng 1.1.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng 1.2. Isoflavone trong đậu tương 1.2.1. Cấu trúc 1.2.2. Hàm lượng isoflavone trong các thực phẩm từ đậu tương 1.2.3. Quá trình trao đổi chất và hấp thụ của isoflavone ở người 1.2.4. Lợi ích của isoflavone đối với sức khỏe 1.2.5. Tính an toàn của isoflavone đậu tương 1.3. Sự chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglucone trong đậu tương 3 1.3.1. Sự chuyển hóa isoflavone bằng kiềm và axit 1.3.2. Sự chuyển hóa isoflavone bằng bằng enzyme  – glucosidase 1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.4.1. Nguồn gốc và phân loại 1.4.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong lên men đậu tương 1.5. Một số thực phẩm giàu isoflavone trên thị trường thế giới và Việt Nam CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu - Đậu tương giống ĐT84 do Viện Khoa học Nông nghiệp cung cấp. - Chế phẩm Enzyme Lactozym (công ty Novo Nordisk, Đan Mạch), Novozyme 188 (công ty Novozymes, Đan Mạch) và Sumizyme FP (công ty Shin-nihon Kagaku, Nhật Bản). - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 phân lập từ sản phẩm natto vùng Nagoya (Nhật Bản). - Các hóa chất phân tích sử dụng của Merck (Đức), Sigma (Mỹ), BDH (Anh) và A.R (Trung Quốc). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu - Các phương pháp công nghệ: Phương pháp chuẩn bị sữa đậu tương, phương pháp thủy phân sữa đậu tương bằng chế phẩm enzyme thương mại, phương pháp lên men sữa đậu tương - Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn - Các phương pháp phân tích lý hóa: Phương pháp đo pH, xác định nồng độ chất khô, xác định hàm lượng protein, xác định hàm lượng lipid, xác định hàm lượng carbohydrate, xác định hàm lượng isoflavone bằng sắc kí lỏng cao áp (HPLC), xác định hoạt tính enzyme - glucosidase, xác định hiệu suất chuyển hóa isoflavone. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong đậu tƣơng từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng chế phẩm enzyme 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm enzyme thích hợp Sử dụng ba chế phẩm enzyme rất phổ biến trong công nghiệp thực phẩm là enzyme Novozyme 188 có hoạt tính -glucosidase , enzyme Sumizyme FP có hoạt tính -glucosidase và protease, enzyme Lactozym có hoạt tính -galactosidase để nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone trong dịch sữa đậu tương. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng isoflavone tổng số trong mỗi mẫu dịch sữa đậu tương thủy phân không khác nhau nhiều. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone thay đổi giữa các mẫu xử lý enzyme khác nhau. Trong đó, chế phẩm enzyme Sumizyme FP có khả năng chuyển hoá isoflavone cao nhất đạt 78,51%. Do vậy, chúng tôi lựa chọn enzyme Sumizyme FP để nâng cao hàm lượng aglucone của sữa đậu tương trong những nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu của enzyme Sumizyme FP thủy phân sữa đậu tương 3.1.2.1. Xác định nồng độ tối ưu của enzyme Sumizyme FP Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme Sumizyme FP đến sự chuyển hoá isoflavone Nồng độ enzyme (%) Hàm lƣợng aglucone (mg/100g) Daidzein Genistein 0 0,62 1,06 0,5 4,56 6,33 1,0 7,84 8,27 4 1,5 7,88 8,51 2,0 7,63 8,18 Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy mặc dù nồng độ daidzein và genistein đạt được cao nhất ở nồng độ enzyme 1,5% theo trọng lượng (là 7,88 mg/100g và 8,51 mg/100g tương ứng), nhưng giá trị aglucone này không khác nhau nhiều so với nồng độ enzyme 1,0% (là 7,84 mg/100g và 8,27 mg/100g tương ứng). Tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên 2,0% thì hàm lượng các aglucone lại giảm xuống. Do vậy, chúng tôi lựa chọn nồng độ chế phẩm Sumizyme FP sử dụng là 1,0% để quá trình thủy phân sữa đậu tương đạt được hiệu suất chuyển hoá isoflavone cao. 3.1.2.2. Xác định pH tối ưu của chế phẩm enzyme Sumizyme FP Các giá trị pH từ 3,5 – 7,0 được khảo sát để xác định khả năng chuyển hoá tối ưu isoflavone từ dạng glucoside sang dạng aglucone trong dịch sữa đậu tương bằng chế phẩm enzyme Sumizyme FP. Kết quả phân tích hàm lượng isoflavone trong sữa đậu tương cho thấy sự chuyển hoá isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone đạt được cao nhất ở pH bằng 5,0 (daidzein có hàm lượng là 8,11 mg/100g và genistein có hàm lượng là 8,45 mg/100g). Ở khoảng trên và dưới pH 5, hàm lượng genistein và daidzein đều giảm. Như vậy, giá trị pH sữa đậu tương thích hợp cho enzym Sumizyme FP là 5,0. 3.1.2.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của enzym Sumizyme FP Các mẫu sữa đậu tương sau khi thuỷ phân tại những điều kiện nhiệt độ khác nhau trong thời gian 180 phút được phân tích hàm lượng daidzein và genistein. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng daidzein và genistein đạt được cao nhất ở nhiệt độ 50 0 C (8,11mg/100g và 8,45mg/100g tương ứng). Nhiệt độ cao hơn 50 o C có thể đã bất hoạt một phần enzyme khiến hàm lượng các aglucone giảm xuống. Như vậy, nhiệt độ 50 0 C là tối ưu cho hoạt tính thuỷ phân của enzyme -glucosidase trong chế phẩm Sumizyme FP. 3.1.2.4. Xác định thời gian tối ưu cho quá trình thủy phân sữa đậu tương bằng chế phẩm enzyme Sumizyme FP Hình 3.2. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone trong sữa đậu tƣơng thủy phân bởi enzyme Sumizyme FP theo thời gian Kết quả trong hình 3.2 cho thấy hiệu suất chuyển hóa isoflavone đều tăng lên theo tỷ lệ thuận với thời gian thủy phân từ 1 đến 8 h. Tuy nhiên, khi kéo dài thủy phân kéo dài thời 49.63 65.78 88.25 89.26 92.61 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hiệu suất chuyển hóa isoflavon (%) 1 2 4 6 8 Thời gian (h) 5 gian thủy phân hơn 4h thì sữa đậu tương xảy ra hiện tượng đông tụ và phân lớp, một biểu hiện của sữa đậu tương bị hư hỏng. Do vậy, thời gian thủy phân sữa đậu tương thích hợp là 4h. Sữa đậu tương thủy phân bởi enzyme Sumizyme FP với các điều kiện tối ưu có hàm lượng các aglucone là 17,67 mg/100g (daidzein và genistein tương ứng là 8,52mg/100g và 8,87mg/100g) với hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 88,25%. 3.2. Nghiên cứu nâng cao hàm lƣợng isoflavone aglucone trong sữa đậu tƣơng bằng phƣơng pháp lên men 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất dịch sữa đậu tương đến sự chuyển hóa isoflavone Hình 3.4. Hiệu suất chuyển hóa glycoside sang aglucone ở các nồng độ cơ chất lên men ban đầu khác nhau Hình 3.4 cho thấy ở nồng độ cơ chất ban đầu là 4, 6 và 8% thì tỷ lệ chuyển hóa tương ứng là 51,4%; 60,1% và 65,7%. Điều đáng lưu ý là ở nồng độ cơ chất ban đầu 10%, hiệu suất chuyển hóa của cả daidzin và genistin đều rất thấp, chỉ đạt 32,5%, mặc dù số lượng tế bào trong quá trình lên men không có sự khác biệt nhiều so với các mẫu có nồng độ cơ chất ban đầu là 4,6, 8 và 10 0 Bx Từ những kết quả trên, lựa chọn nồng độ cơ chất 8 0 Bx cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn đến khả năng chuyển hóa isoflavone Hình 3.5. Hàm lƣợng isoflavone glucoside và isoflavone aglucone sau khi lên men với các tỷ lệ giống khác nhau Căn cứ vào kết quả minh họa ở hình 3.5 cho thấy rõ ràng là trong các mẫu lên men với tỷ lệ giống khác nhau, hàm lượng isoflavon dạng aglucone thấp nhất ở mẫu cấy giống 0,5% (7,20mg/100g). Khi tăng tỷ lệ giống cấy lên 1%, hàm lượng aglucone tăng lên 11,31mg/100g. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỷ lệ cấy giống lên 1,5% thì hàm lượng aglucone không tăng lên lên nhiều (11,45mg/100g) và khi tăng tỷ lệ tiếp giống lên 2% thì hàm lượng aglucone không những không tăng lên mà còn giảm đi, xuống còn 10,50mg/100g. Điều này chứng tỏ rằng tỷ lệ cấy giống thấp hoặc cao hơn giá trị 1,0-1,5% đều ảnh hưởng không tốt đến khả năng chuyển hóa glycoside sang aglucone của vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 trong quá trình lên men dịch sữa đậu tương. 3.2.3. Ảnh hưởng của pH dịch lên men đến khả năng chuyển hóa isoflavone 51.34 60.01 65.69 32.5 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4 6 8 10 Nồng độ cơ chất (oBx) Hiệu suất chuyển hóa (%) 12.85 7.94 7.07 9.26 7.2 11.31 11.45 10.5 2 4 6 8 10 12 14 16 0.5 1.0 1.5 2.0 Tỷ lệ giống (%) Hàm lƣợng isoflavon (mg/100g) Glycoside Aglucone 6 Kết quả minh họa trong hình 3.6 cho thấy khả năng chuyển hóa isoflavone từ glycoside sang aglycone của vi khuẩn B.subtilis LH10 đạt hiệu quả cao trong khoảng pH dịch lên men ban đầu từ 6,0-7,0, tuy nhiên, hàm lượng aglucone đạt được cao nhất tại pH 6,5, là 11,92mg/100g. Tại giá trị pH bằng 7,0, mặc dù số lượng tế bào đạt được cao nhất (18,5 x 10 8 CFU/ml) nhưng hàm lượng isoflavone aglucone lại thấp hơn so với hàm lượng aglucone tại pH bằng 6,5 (chỉ đạt 10,73mg/100g). Do vậy, pH bằng 6,5 là giá trị tối ưu cho quá trình lên men sữa đậu tương để nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone. Ghi chú: * giá trị pH của mẫu đối chứng, không điều chỉnh pH Hình 3.6. Hàm lƣợng isoflavone glycoside, aglucone và số lƣợng tế bào sau khi lên men ở các giá trị pH ban đầu khác nhau 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa isoflavone Hình 3.7. Hàm lƣợng isoflavone dạng glycoside và dạng aglucone của dịch sau khi lên men ở điều kiện nhiệt độ khác nhau Hình 3.7 cho thấy yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng rất quan trọng đến hàm lượng aglucone tạo thành trong quá trình lên men. Nhiệt độ 40 - 42 o C cho kết quả lên men rất tốt, với hàm lượng aglucone trong dịch sau lên men là 12,16 mg/100g và 12,47mg/100g tương ứng. 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chuyển hóa isoflavone 0 2 4 6 8 10 12 14 37 40 42 45 Nhiệt độ lên men (oC) Hàm lƣợng isoflavone (mg/100g) Glycoside Aglucone 0 2 4 6 8 10 12 14 6.0* 6.5 7.0 7.5 8.0 pH dịch lên men Hàm lƣợng isoflavone (mg/100g) 9.10 9.15 9.20 9.25 9.30 Log (tế bào/ml) Glycoside Aglucone Log (tế bào/ml) 7 Theo dõi sự chuyển hóa của isoflavone thông qua hàm lượng aglucone tạo thành và hàm lượng glycoside giảm xuống trong suốt quá trình lên men ở các điều kiện đã xác định như nồng độ cơ chất 8 o Bx, pH bằng 6,5, tỷ lệ tiếp giống 1,0% và nhiệt độ lên men 42 0 C. Kết quả được trình bày ở hình 3.8. Hình 3.8. Hàm lƣợng isoflavone glycoside và aglucone sau khi lên men ở thời gian khác nhau Kết quả minh họa trên hình 3.8 cho thấy hàm lượng aglucone tăng nhanh trong giai đoạn từ 4-12h của quá trình lên men. Hàm lượng aglucone tăng từ 1,49 mg/100g lên 7,15 mg/100g, gấp gần 5 lần. Tuy nhiên, sau thời điểm 12h thì hàm lượng aglucone tăng chậm hơn và đạt 12,18mg/100g sau 28h lên men. Đặc biệt sau 28h thì hàm lượng algucone tăng không đáng kể, chỉ tăng 0,13mg/100g ở thời điểm 32h. Chính vì vậy, chúng tôi cho rằng chỉ nên kéo dài thời gian lên men của vi khuẩn B.subtilis LH10 đến 28 h với hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 79,95% là phù hợp. 3.2.6. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí vô trùng đến khả năng chuyển hóa isoflavone Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của sục khí vô trùng đến hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang aglucone trong quá trình lên men Tốc độ sục khí vô trùng (v.v.m) Số lƣợng tế bào sau 12 h lên men (tế bào/ml) Hiệu suất chuyển hóa isoflavone (%) 0 8 x10 5 37,2 0,5 16 x 10 7 56,4 1,0 19,1 x 10 7 69,8 1,5 14,5 x 10 8 80,5 2,0 16,9 x 10 8 74,9 Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone của tất cả các mẫu có sục khí vô trùng trong quá trình lên men đều cao hơn nhiều so với mẫu đối chứng không sục khí. Hiệu suất chuyển hóa đạt được cao nhất ở mẫu có tốc độ sục khí 1,5 v.v.m (là 80,5%). Ở điều kiện này, số lượng tế bào sau 12 h lên men cũng đạt được khá cao, là 14,5 x 10 8 tế bào/ml. Tốc độ sục khí cao 2,0 v.v.m dịch tuy có làm tăng số lượng tế bào sau 12h lên men đến 16,9x10 8 tế bào/ml nhưng lại không làm tăng hiệu suất chuyển hóa isoflavone, do vậy lựa chọn tốc độ cấp khí cho quá trình lên men là 1,5 v.v.m. Tiến hành lên men trên cơ chất sữa đậu tương 8 o Bx bởi vi khuẩn B.subtilis LH10 trên thiết bị lên men 5 lít Labo-controller MDL-8C với các điều kiện tối ưu đã được xác định. Dịch sữa đậu tương lên men giàu isoflavone thu được có hàm lượng isoflavone tổng số và aglucone là 17,03 mg/100g và 12,34 mg/100g, tương ứng. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone đạt 79,91%. Dịch sữa lên men đậu tương này có thể sấy 23.5 21.84 16.9 12.89 12.76 9.03 6.82 4.71 4.52 1.49 1.6 4.94 7.15 8.9 10.21 11.54 12.45 12.58 0 5 10 15 20 25 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Thời gian (h) Hàm lƣợng isoflavon (mg/100g) Glycoside Aglucone 8 phun tạo thành Bột đậu tương lên men giàu isoflavone dạng aglucone phục vụ cho công nghiệp chế biến thực phẩm hoặc công nghiệp dược phẩm như sản xuất thực phẩm chức năng giàu isoflavone có hoạt tính sinh học cao với tác dụng chống loãng xương, giảm cholesterol trong máu,… CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu thu được, đề tài đã đưa ra được 2 giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone từ dạng glycoside sang dạng aglucone như sau: 1. Thủy phân sữa đậu tương với chế phẩm enzyme Sumizyme FP. Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân được xác định là pH của sữa đậu tương: 5,0; Nhiệt độ thủy phân: 50 0 C; Nồng độ enzyme: 1,0% và thời gian thuỷ phân: 4 h. Hiệu suất chuyển hóa isoflavone sau qúa trình thủy phân đạt 88,25%. Dịch sữa đậu tương thủy phân thu được có hàm lượng protein cao (7,84%) và hàm lượng isoflavone dạng aglucone là 17,67 mg/100g. 2. Lên men sữa đậu tương với chủng vi khuẩn B.subtilis LH10. Điều kiện lên men tối ưu được xác định là nồng độ cơ chất: 8 o Bx; tỷ lệ cấy giống: 1,0%; pH sữa đậu tương ban đầu: 6,5; tốc độ khuấy: 150 vòng/phút; tốc độ sục khí vô trùng: 1,5 v.v.m, nhiệt độ lên men 42 o C trong thời gian 28h. Sữa đậu tương lên men thu được đạt hàm lượng isoflavone dạng aglycone là 12,34mg/100g và hiệu suất chuyển hóa isoflavone đạt 79,91%. Tùy theo điều kiện thiết bị và mục đích sản xuất mà chúng ta có thể lựa chọn một trong hai giải pháp. Sữa đậu tương giàu isoflavone dạng aglucone có thể chế biến thành dạng bột để làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm. Kiến nghị Do thời gian thực tập có hạn, đề tài nghiên cứu một số giải pháp nâng cao hàm lượng isoflavone dạng aglucone bằng lên men với vi khuẩn Bacillus subtilis LH10 mới chỉ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm. Nếu có thêm điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục thực hiện nghiên cứu xác định các điều kiện lên men tối ưu cho quá trình lên men sữa đậu tương bởi chủng Bacillus subtilis LH10 trên quy mô pilot. References Tài liệu tiếng Việt 1. Niên giám thống kê (2011), Nhà xuất bản thống kê, Tổng cục thống kê. 2. Trương Hương Lan, Trần Thị Minh Hà, Lại Quốc Phong, Dương Văn Đồng, Ngô Anh Tuấn (2006), Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm isoflavon có hoạt chất sinh học cao, ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng, Báo cáo Đề tài cấp Bộ. 3. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Xây dựng Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 9 4. Adlercreutz H., Fotsis T., Heikkinen R., et al. (1982), “Excretion of the lignans enterolactone, enterodiol and equol in omnivorous and vegetarian women and in women with breast cancer”, Lancet, 2, pp. 1295-9. 5. Adlercreutz H., Van der Wildt J., Attalla H., Wahala K., Makela J., Hase T., & Fotsis T. (1995), ”Lignan and isoflavonoid conjugates in human urine”, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 52, pp. 97 – 103. 6. AOAC (1990), Official Methods of Analysis, Arling ton, VA. 7. Arijmandi B.H., Alekel L., Hollis B.W., et al. (1996), “Dietary soybean protein prevents bone loss in an ovariectomized rat model of osteoporosis”, J. Nutr., 126, pp.161-167. 8. Axelson M., Kirk D.N., Fairant R.D., Cooley G., Lawsin A.M., & Setchell K.D.R. (1982), “The identification of the weak oestrogen equol 7-hydroxyl-3-(4’-hydroxyphenyl) chroman in human urine”, Biochem. J., 201, pp. 353-357. 9. Bannwart C., Adlercreutz H., Fotsis T., Wahala K., Hase T., Brunow G. (1984), “Identification of O-desmethylangolensin, a metabolite of daidzein, and of matairesinol, one likely plant precursor of the animal lglycosidnan enterolactone, in human urine”, Finn. Chem. Lett., 4-5, pp. 120-5. 10. Bayer T.A., Wirths O., Majtenyi K., Hartmann T., Multhaup G., Beyreuther K., Crech C. (2001), “Key factors in Alzheimer’s disease:  – amyloid presursor protein processing metabolism and intaneuronal transport”, Brain Pathol., 11, pp. 1-11. 11. Bhathena S.J., Valasquez M.T. (2002), “Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes”, Am. J. Clin. Nutr., 76, pp. 1191 – 1201. 12. Buchanan R.E., et al. (1974), Bergey’ manual of determinative bacteriology (Eighth edition), Waverly press, USA, pp. 529 – 551. 13. Cassidy A. (1996), “Physiological effects of phytoestrogens in relation to cancer and other human health risks”, Proc. Nutr. Soc., 55, pp. 399 – 417. 14. Carmignani L.O., Pedro A.O., Costa-Paiva L.H., Pinto-Neto A.M. (2010), “The effect of dietary soy supplementation compared to estrogen and placebo on menopausal symptoms: a randomized controlled trial”, Maturitas, 67(3), pp.262-269. 15. Chien H.L., Huang H.Y., & Chou C.C. (2006), “Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentations of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria”, Food Microbiol., 23, pp.772-778. 10 16. Chiou T.Y., Lin Y.H., Su N.W., Lee M.H. (2010), “Beta-glucosidase isolated from soybean okara shows specificity toward glucosyl isoflavones”, J. Agric. Food Chem., 58(15), pp. 8872-8. 17. Choi Y.B., Kim K.S., Rhee J.S. (2002), “Hydrolysis of soybean isoflavone glycosides by lactic acid bacteria”, Biotechnol. Lett., 24, pp. 2113 – 2116. 18. Chun J., Kim G.M., Lee K.W., Choi I.D., Kwon G.H., Park J.Y., Jeong S.J., Kim J.S., & Kim J.H. (2007), “Conversion of isoflavone glucosides to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria”, J. Food Sci., 72, pp.39-44. 19. Chun J., Kim J.S., & Kim J.H. (2008), “Enrichment of isoflavone aglycones in soymilk fermented with single and mixed cultures of Streptococcus infantarius 12 and Weissella sp.4, Food Chem., 109, pp.278-284. 20. Delmonte P., Perry J., Rader J.I. (2006), “Determination of isoflavones in dietary supplements containing soy, Red Clover and kudzu: extraction followed by basic or acid hydrolysis”, J. Chromatogr. A., 1107(1-2), pp. 59-69. 21. Donkor O.N., Nilmini S.L. I., Stolic P., et al. (2007), “Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type yoghurt during cold storage”, Int. Dairy J., 17, pp.657- 665. 22. Elkind-Hirsch K. (2001), “Effect of dietary phytoestrogens on hot flushes can soy based proteins substitute for traditional estrogens replacement therapy”, Arch. Int. Med., 161, pp. 1161 – 72. 23. Food and Agriculture Organization, 2011. 24. Fundamental Concepts in the safety assessment of foods containing soy isoflavones for purpose of specified health use. Food Safety Commission of Specified Health Use, Food Safety Commission Novel Foods Expert Commitee, May, 2006. 25. Hammond E.G., Johnson L.A., et al. (2005), Composition of Soybean: Soybean Oil, Iowa State University Ames, Iowa, pp. 579. 26. Han Y., C.M. Parsons, and T. Hymowitz (1991), “Nutrional Evaluation of Soybeans Varying in Trypsine Inhibitor Content”, Poultry Sci., 70, pp. 896-906. 27. Hemion S.M., et al. (2002), “Metabolism of isoflavones in human subjects”, Phytochem. Rev., 1, pp.175-182. 28. Howes J.B., Sullivan D., Lai N., Nestel P., Pomeroy S., West L., Eden J.A., & Howes L.G. (2000), “The effects of dietary supplementation with isoflavones from [...]... D., et al (1991), “Malonyl isoflavone glycosides in soybean seeds (Glycine max MERILL)”, Agric Biol Chem., 55, pp 2227-33 35 Kumar S., Rekha and Sinha L.K (2010), “Evaluation of quality characteristics of soy based millet biscuits”, Adv Appl Sci Res., 1(3), pp 187-196 36 Kuo L.C., Cheng W.Y., Wu R.Y., Huang C.J and Lee K.T (2006), “Hydrolysis of black soybean isoflavone glycosides by Bacillus subtilis... M., Onga T (2001), “Production of natto which contains a hglycosidh level of isoflavone aglucones”, Nipp Shok Kag Kog Kai., 48, pp 27 – 34 30 Izumi T., Piskula M.K., Osawa S., Obata A., Tobe K., Saito M., Kataoka S., Kubota Y., Kikuchi M (2000), “Soy isoflavone aglucones are absorbed faster and in higher amounts than theirs glycosides in humans”, J Nutr., 130, pp 1695-1699 31 Katekan D., Enkachai C.,... menopausal symptoms in relation to soy product intake in Japanese women”, Climateric, 6, pp 6 – 12 48 Nestel P (2003), “Isoflavones: their effects on cardiovasculas risk and functions”, Cur Opinion Lipodol, 14, pp 3 – 8 49 Obata A, et al (2001), Process for production isoflavone aglycone – containing composition, United States Patent No 0010930, Aug.2, 2001 50 Orf J.H (1988), Modifying Soybean Composition... “Hydrolysis of isoflavone glycosides in soymilk by galactosidase and -glucosidase”, J Food Biochem., 33, pp.38-60 54 Piskula M.K., Yamakoshi J., & Iwai Y (1999), “Daidzein and genistein but not their glucosides are absorbed from the rat stomach”, FEBS Lett., 447, pp 287 – 291 55 Potter S M., Baumm J A., Teng H., Stillman R J., Shay N.F., and Erdman J W Jr (1998), “Soy protein and isoflavones: their... P., Zimmer – Nechemias L., Wolfe B E., Brasheas W T., Kirschner A S., Cassidy A., & Heubi J E (2001), “Bioavailability of pure isoflavones in healthy humans and analysis of commerial soy isoflavone supplements”, J Nutr., 131, pp.1362 – 1375 58 Shen J.L, et al (1994), Aglucone isoflavone enriched vegetable protein fiber, United States Patent No.5,352,384, Oct.4, 1994 59 Simopoulos A.P., Leaf A., Salem... – 60 65 Tsanglis D., Ashton J.F., Mc Gill A.E.J., & Shah N.P (2002), “Enzymic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by beta-glucosidase producing Bifidobacteria”, J Food Sci., 67, pp 3104-3113 66 USDA National Nutrient Database for Standard Reference Release 22 Nutrient Data Laboratory home page, USDA, Agricultural Research Service; 2009 67 Wang H.J., Murphy P.A (1994), Isoflavone. .. varieties on the content and composition of isoflavone in ria-koji miso”, Food Chem., 100, pp 369-374 76 Yin, L J., Li, L T., Li, Z G., Tatsumi, E., & Saito, M (2004) “Changes in isoflavone contents and composition of sufu (fermented tofu) during manufacturing”, Food Chem., 87(4), pp 587-592 77 Zhang Y., Wang G., et al (1999), “Urinary disposition of the soybean isoflavones daidzein, genistein and glycitein... isoflavone glycosides by Bacillus subtilis natto”, Appl Microbiol., 73, pp 314 – 320 37 Kurzer M.S (2000), “Hormonal effects of soy isoflavones: Studies in premenopausal and postmenopausal women”, J Nutr., 130, pp 660-661 38 Lim J.S., Jang C.H., et al (2009), “Biotransformation of Free Isoflavones by Bacillus species isolated from traditional Cheonggukjang”, Food Sci Biotechnol., 8(4), pp.1046-1050 39 Liu K.S.,... Press., Champaign, Illinois, USA 42 Ma D.F., Quin L.Q., Wang P.Y., Katoh E (2008), “Soy isoflavones intake increases bone mineral density in the spine of menopausal women: meta-analysis of randomized controlled trials”, Clin Nutr., 27, pp 57-64 43 Miura T., Yuan L., Sun B., Fujii H., Yoshida M., Wakame K., Kosuna K (2002), Isoflavone aglucone produced by culture of soybean extracts with Basisiomycetes and... fatty acids”, Ann Nutr Metab., 43, pp 127 – 130 60 Song T., Barua K., Buseman G., Murphy P.A (1998), “Soy isoflavones analysis: Quality control and a new internal standard”, Am J Clin Nutr., 68, pp 1474 – 1479 61 Raimodi S., Roncaglia L., De Lucia M., Amaretti A., et al (2009), “Bioconversion of soy isoflavones daidzin and daidzein by Bifidobacterium strains”, Appl Microbiol Biotechnol., 81, pp.943-950 . Nghiên cứu một số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone Nguyễn Thị. DUNG: 1. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglucone bằng quá trình thủy phân sữa đậu tương với