Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não tại bệnh viện Bạch Mai từ năm 2008 đến 2010 Khƣơng Thị Doanh Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Đoàn Mai Phƣơng Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Xác định căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não. Mô tả đặc điểm dịch tễ học của các tác nhân thƣờng gặp gây viêm màng não. Xác định mức độ đề kháng với các kháng sinh của loài vi khuẩn thƣờng gặp. Keywords. Vi sinh vật học; Sinh học; Vi khuẩn; Nấm; Bệnh viêm màng não Content Viêm màng não là tình trạng viêm nhiễm màng não. Bệnh có nguy cơ tử vong cao hoặc để lại những di chứng nặng nề ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe và sự phát triển tâm thần kinh ở ngƣời lớn và trẻ em Trên thế giới, khi không có các vụ dịch, khoảng một triệu trƣờng hợp viêm màng não do vi khuẩn và khoảng 200.000 ngƣời chết hàng năm. Ở nƣớc ta, theo thống kê của Viện Vệ sinh dịch tễ TW, tỷ lệ mắc/chết năm 1994 là 3,15 và 0,09/100.000 ngƣời dân mắc bệnh dịch này Căn nguyên gây viêm màng não rất đa dạng, có thể do vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký sinh trùng… Định hƣớng sơ bộ cũng nhƣ xác định chính xác căn nguyên gây viêm màng não rất cấp thiết và quan trọng giúp bs lâm sàng đƣa phác đồ điều trị tiến hành điều trị cho bn qua cơn nguy kịch Tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán viêm màng não do vi khuẩn hay nấm là tìm thấy sự có mặt chúng trong dịch não tủy.Vì vậy chẩn đoán căn nguyên gây viêm màng não từ dịch não tủy có ý nghĩa quyết định. Bên cạnh đó: VMN có liên quan đến các yếu tố dịch tễ học. Tuy nhiên các yếu tố này thay đổi khác nhau theo từng khu vực, từng giai đoạn cụ thể. Bởi vậy, nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ học của viêm màng não cũng nhƣ cơ cấu căn nguyên, tình hình nhạy cảm và kháng kháng sinh có ý nghĩa quan trọng trong công tác xây dựng chiến lƣợc điều trị chotừng khu vực trong từng giai đoạn nhất định giúp bác sỹ lâm sàng có thêm cơ sở đƣa ra những quyết định sử dụng kháng sinh trƣớc khi có kết quả nuôi cấy và kháng sinh đồ về vi khuẩn và vi nấm Ngoài ra: Hàng năm có rất nhiều bệnh nhân VMN đến điều trị tại Bạch Mai. Các bệnh nhân đƣợc chuyển từ khắp mọi nơi, bệnh thƣờng nặng và đã diễn biến kéo dài. Hầu hết bệnh nhân đã dùng kháng sinh ở tuyến dƣới. Vì vậy, việc chỉ định kháng sinh đúng cho các bệnh nhân viêm não là nhu cầu cấp thiết đối với bác sỹ lâm sàng trong bệnh viện. Chỉ định kháng sinh không hợp lý sẽ làm cho tốc độ đề kháng của vi khuẩn ngày càng gia tăng, xuất hiện nhiều chủng đa kháng gây không ít khó khăn cho điều trị. Cho đến nay chƣa có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên gây viêm màng não ở ngƣời lớn và tính nhạy cảm kháng sinh các căn nguyên thƣờng gặp Chính vì lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não tại bệnh viện Bạch Mai từ năm 2008 đến 2010” Đề tài đƣợc tiến hành với 3 mục tiêu: 1. Xác định căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não 2. Mô tả đặc điểm dịch tễ học của các tác nhân thƣờng gặp gây viêm màng não 3. Xác định mức độ đề kháng với các kháng sinh của loài vi khuẩn thƣờng gặp I. TỔNG QUAN II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 3110 mẫu bệnh phẩm dịch não tủy của bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh Bạch Mai trong 3 năm 2008-2010 2.2 Địa điểm nghiên cứu Khoa Vi sinh - Bệnh viện Bạch Mai 2.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/01/2008 đến 31/12/2010 2.4 Vật liệu nghiên cứu Môi trƣờng nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và nấm gây bệnh Vật liệu – trang thiết bị định danh + Máy định danh tự động Phoenix + Các bộ tính chất sinh vật hóa học API + Vật liệu làm kháng sinh đồ 2.5 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang Quy trình tiến hành: xét nghiệm các trƣờng hợp có chỉ định nuôi cấy của bệnh nhân vào điều trị tại các khoa lâm sàng tại Bệnh viện Bạch Mai trong thời gian nghiên cứu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả nhuộm soi KQ nhuộm soi phát hiện vi khuẩn và nấm gây bệnh là 95 trƣờng hợp. Trong đó nhóm cầu khuẩn Gram dƣơng chiếm tỷ lệ 74,6%, nhóm trực khuẩn Gram âm chiếm 13,7% và nấm chiếm 11,6%. Kỹ thuật nhuộm soi phát hiện hình thể VK và nấm có ý nghĩa thực tiễn. Đây là khâu quan trọng và cần thiết cấp bách. Khi đứng trƣớc bệnh nhân nghi ngờ viêm màng não, việc chọc hút dịch não tủy của bệnh nhân để quan sát màu sắc, xét nghiệm sinh hóa và tế bào học phải tiến hành ngay kỹ thuật nhuộm Gram. Khi đã phát hiện hình thể vi khuẩn trong dịch não tủy của bệnh nhân có thể căn cứ vào lứa tuổi và một số yếu tố yếu tố dịch tễ khác cần lựa chọn kháng sinh hợp lý và tiến hành điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Đây là phƣơng pháp đơn giản, nhanh, ít tốn kém [2]. Hơn nữa, kết quả thƣờng đƣợc thông báo sau khi gửi bệnh phẩm khoảng 30 phút đến 1h. Do vậy, kết quả dƣơng tính càng quan trọng và có ý nghĩa. Kết quả nhuộm soi ban đầu của chúng tôi cho thấy, nhóm căn nguyên vi khuẩn Gram dƣơng chiếm tỷ lệ 74,6%. Nhóm vi khuẩn này chiếm ƣu thế hơn hẳn so với hai nhóm căn nguyên vi khuẩn Gram âm và nấm. Dựa trên kết quả nhuộm soi sơ bộ này cho phép dự báo khuynh hƣớng căn nguyên gây bệnh viêm màng não gần đây. Giúp các bác sỹ lâm sàng lựa chọn kháng sinh phủ đầu hợp lý và kịp thời cho bệnh nhân. Tuy nhiên kết quả này cũng chỉ gợi ý dùng kháng sinh điều trị theo nhóm Gram âm hay Gram dƣơng không cho phép làm kháng sinh đồ thử độ nhạy cảm của kháng sinh. Vì vậy vừa điều trị vừa chờ kết quả nuôi cấy và kháng sinh đồ sẽ rất hữu ích đối với các trƣờng hợp điều trị kháng sinh phủ đầu thất bại. 3.2 Kết quả nuôi cấy dương tính. Trong 3110 bệnh phẩm dịch não tủy đƣợc nuôi cấy, chúng tôi đã phân lập đƣợc 192 chủng vi khuẩn và nấm, với 127 chủng cầu khuẩn Gram dƣơng, 33 chủng trực khuẩn Gram âm, 29 chủng nấm, 3 chủng trực khuẩn Gram dƣơng. Tỷ lệ dƣơng tính 6,2%. So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới về tỷ lệ dƣơng tính, thì hầu hết các báo cáo không đề cập tới. Nhƣng khi so sánh với số lƣợng chủng vi khuẩn và nấm trong DNT ở hầu hết các báo cáo cũng đều ko cao. Nhƣ vậy, tỷ lệ dƣơng tính cao hay thấp phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó các yếu tố sau đây có ý nghĩa quan trọng: bệnh nhân đến sớm hay muộn, đã đƣợc hay chƣa dùng kháng sinh. Bên cạnh đó, thời gian và cách bảo quản bệnh phẩm cũng rất quan trọng. Nếu bệnh phẩm bảo quản lạnh sẽ ảnh hƣởng đến sức sống của vi sinh vật hoặc bệnh phẩm để quá lâu không đƣợc vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm hoặc vận chuyển bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm nhƣng chậm trễ trong khâu xử lý sẽ gây hiện tƣợng âm tính giả Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi mới dừng lại ở nuôi cấy tìm các căn nguyên ƣa khí, ƣa/kỵ khí tủy tiện và nấm, còn các căn nguyên kỵ khí vẫn chƣa đƣợc tiến hành. Một phần nữa, có thể do chỉ định rộng rãi của bác sỹ lâm sàng gây ảnh hƣởng đến tỷ lệ nuôi cấy dƣơng tính. 3.3 Kết quả phân lập theo độ đục của dịch não tủy. Sau khi đã có kết quả nuôi cấy, chúng tôi tiến hành đối chiếu tỷ lệ nuôi cấy dƣơng tính theo phân loại màu sắc dịch não tủy ban đầu có kết quả nhƣ sau: Theo nhận định độ đục dịch não tủy, tỷ lệ dƣơng tính sau khi nuôi cấy dịch não tủy đục là 52,5%, dịch não tủy lẫn máu là 2,3%, dịch não tủy vàng chanh là 0%, dịch não tủy trong là 1,1%. Kết quả trên cho thấy: tỷ lệ dƣơng tính ở bệnh phẩm DNT đục rất cao. Cứ cứ 1,9 bệnh phẩm dịch não tủy đục đƣợc gửi tới nuôi cấy thì dƣơng tính một trƣờng hợp. Tỷ lệ dƣơng tính tới 52,5% rất cao so với 6,2% dƣơng tính trong thời gian nghiên cứu 3 năm. Rõ ràng sự chỉ định rộng rãi từ bác sỹ lâm sàng rất ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy dƣơng tính cũng nhƣ tổn thất về mặt kinh tế cho bệnh nhân. Từ 128 bệnh phẩm dịch não tủy lẫn máu chúng tôi cũng phân lập đƣợc 3 chủng vi khuẩn chiếm tỷ lệ 2,3%. Kết quả dƣơng tính này có thể do viêm màng não mủ có xuất huyết màng não hoặc có thể do lỗi kỹ thuật khi chọc dò dịch não tủy [16] hoặc dịch não tủy lờ đục nhƣng lẫn máu nên chúng tôi không quan sát rõ đƣợc màu sắc chính xác đƣợc độ đục của bệnh phẩm Đối với dịch não tủy màu vàng chanh, chúng tôi không phân lập đƣợc chủng vi khuẩn nào. Có thể hiện tại chúng tôi chƣa triển khai đƣợc kỹ thuật cấy tìm vi khuẩn lao tại phòng xét nghiệm. Chúng tôi cũng phân lập đƣợc 29 chủng vi khuẩn và nấm từ bệnh phẩm dịch não tủy trong. Kết qủa này, có thể bệnh đang ở giai đoạn sớm hoặc màu sắc đục nhẹ nên không quan sát chính xác đƣợc hoặc do bệnh nhân đã dùng kháng sinh phủ đầu, lƣợng vi khuẩn giảm trong dịch não tủy. Đối với bệnh phẩm này thƣờng đƣợc nghĩ đến căn nguyên virus do vậy tỷ lệ dƣơng tính rất thấp, chỉ chiếm 1,1% 3.4 Kết quả phân lập theo nhóm vi khuẩn gây bệnh Trong số 163 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trong thời gian nghiên cứu 3 năm, có 130 chủng vi khuẩn Gram dƣơng, chiếm tỷ lệ 79,8% so với 20,2% nhóm vi khuẩn Gram âm. Đối với các nhiễm trùng khác nhƣ viêm phổi, viêm đƣờng tiết niệu hay nhiễm khuẩn huyết căn nguyên chủ yếu là nhóm trực khuẩn Gram âm. Tuy nhiên đối với viêm màng não, nhóm gây bệnh chiếm ƣu thế là nhóm cầu khuẩn Gram dƣơng. Lý giải căn nguyên khác nhau ở các vị trí nhiễm trùng khác nhau trên, do thời gian gần đây, tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng Gram dƣơng đã tăng nhanh dẫn đến sự chọn lọc gây bệnh của chúng 3.5 Kết quả phân lập VK Gram dương Trong 130 chủng vi khuẩn Gram dƣơng phân lập đƣợc trong thời gian nghiên cứu, đặc biệt lƣu ý căn nguyên Streptococcus suis 85 chủng (chiếm 65,4%). Đây là căn nguyên gây dịch liên cầu lợn đáng báo động hiện nay. Một trong những di chứng đặc biệt mà S. suis gây viêm màng não ở ngƣời là mất khả năng thính giác (trong khi nguyên nhân vẫn chƣa đƣợc giải thích) Bên cạnh đó chúng tôi cũng phân lập đƣợc 4,7% S. Pneumoniae. Đây là căn nguyên gây viêm màng não phổ ở trẻ em, trong khi bệnh viện Bạch Mai có số giƣờng bệnh ở khoa Nhi ít. Do vậy tỷ lệ phân lập chủng phế cầu của chúng tôi thấp. 3.5 Kết quả phân lập VK Gram âm Theo kết quả của một số công trình nghiên cứu, vai trò gây viêm màng não do vi khuẩn thì nhóm vi khuẩn Gram âm xếp ở vị trí thứ 2 so với nhóm cầu khuẩn Gram dƣơng [16]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tƣơng tự nhƣ vậy. Trong đó, E. coli chiếm 30,3%, tiếp đến là A. baumannii chiếm 24,3% và K. pneumoniae chiếm 18,2%. 3.6 Kết quả phân lập các loài nấm Trong thời gian nghiên cứu 3 năm, chúng tôi phân lập đƣợc 28 chủng nấm, trong đó C. neoformans (14,6%) và 1 chủng C. albicans Candida gây viêm màng não thƣờng ít gặp, thƣờng chỉ gặp ở những bệnh nhân suy kiệt, có bệnh mãn tính hoặc dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài và nhất là giai đoạn cuối của bệnh Cryptococcus neoformans là căn nguyên nấm gây viêm màng não thƣờng gặp nhất. Khi nhiễm loại nấm này bệnh cảnh lâm sàng rất nặng, bệnh nhân đau đầu dữ dội, cứng gáy rối loạn trí nhớ, liệt dây thần kinh, hôn mê có thể dẫn đến tử vong. 3.7 Một số đặc điểm dịch tễ học liên quan đến căn nguyên thường gặp gây viêm màng não S. suis Giới tính : Tỷ lệ mắc viêm màng não do căn nguyên S. suis theo giới tính nam chiếm 78,8%, nữ chiếm 21,2%. Tuổi : Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ tuổi mắc viêm màng não do căn nguyên S. suis đều đƣợc ghi nhận ở ngƣời lớn trên 30 tuổi (dao động từ 30 đến -84). Bệnh tập trung nhiều nhất ở nhóm tuổi 50-59 với 40 trƣờng hợp. Sau đó đến nhóm tuổi 40-49 chiếm 27,1%. Mùa vụ Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tƣơng tự, bệnh xuất hiện quanh năm nhƣng đáng chú ý nhất vào các tháng nắng nóng, bắt đầu từ tháng 4 cho đến tháng 10. 4.8 Mức độ đề kháng kháng sinh của chủng S. suis Theo khuyến cáo của CLSI, các kháng sinh điều trị liên cầu nhóm viridians bao gồm: Penicillin, cephem (bao gồm cephalosporin thế hệ 1, 2, 3, và 4), carbapenem, macrolide, glycopeptides, tetracyclines, phenicol, oxazolidinones (linezolid)…Trong đó penicillin đƣợc xếp vào nhóm A, là những kháng sinh ƣu tiên hàng đầu luôn cần đƣợc thử nghiệm và báo cáo kết quả [38] Penicillin thấm tốt vào màng não.Tuy nhiên, không thể đo đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu của penicillin với nhóm Streptococcus spp bằng phƣơng pháp khoanh giấy khuếch tán. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đo nồng độ ức chế tối thiểu của penicillin G bằng phƣơng pháp E-test Trong 40 chủng thử nghiệm có 38 chủng kháng trung gian với ở nồng 0,23 µg/ml, 2 chủng kháng trung gian ở nồng độ MIC 0,32 µg/ml. Nhƣ vậy, 100% các chủng S. suis hoàn toàn kháng trung gian với penicillin. Penicillin G là loại kháng sinh có độ an toàn cao (tính độc thấp), giá thành rẻ. Điều trị thành công những KS cổ điển sẽ làm giảm sự đề kháng KS của VK. Nhƣ vậy, theo thời gian tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng tăng. trong khi đây vẫn đƣợc coi là chủng mới xuất hiện ở nƣớc ta Ngoài penicillin, ceftriaxone cũng đƣợc lựa chọn để điều trị viêm màng não do S. suis [48], [67]. Đây là một cephalosporin thế hệ 3, có độ khuếch tán tốt, thuộc kháng sinh nhóm B có thể đƣợc lựa chọn để bổ sung trong trƣờng hợp bệnh nhân không dung nạp thuốc, không đáp ứng với kháng sinh nhóm A và đƣợc chỉ định trong các trƣờng hợp nhiễm khuẩn nặng. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, chủng S. suis đề kháng tƣơng đối cao với ceftriaxone tới 40%, chỉ có 29,3% chủng còn nhạy cảm Erythromycin là kháng sinh đƣợc chỉ định thay thế khi bệnh nhân bị dị ứng với kháng sinh nhóm β-lactam. Nghiên cứu của chúng tôi cũng ghi nhận S. suis đã đề kháng với erythromycin tới 38,2%[38], [39]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng chỉ ra rằng 97.1% kháng tetracycline. Cloramphenicol cũng là kháng sinh thấm tốt qua màng não, là thế hệ kháng sinh ra đời sau nhƣng trong nghiên cứu của chúng tôi, S. suis đã đề kháng với tỷ lệ 28%. Với vancomycin và linezolid vẫn còn là các kháng sinh còn có tác dụng tốt, nhạy cảm 100%. Tuy nhiên phải rất cân nhắc khi dùng vancomycin. Đôi khi đây là loại kháng sinh duy nhất để điều trị nhiễm khuẩn nặng do liên cầu gây ra. Do vậy rất hạn chế chỉ định đối với loại kháng sinh này. Linezolid là kháng sinh mới và chƣa đƣợc sử dụng rộng rãi ở Việt Nam. Nên kháng sinh này vẫn còn nhạy cảm tốt. KẾT LUẬN Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não trong thời gian từ 2008 đến 2010, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não trong thời gian nghiên cứu  Tỷ lệ nhuộm soi dƣơng tính: Cầu khuẩn Gram dƣơng là 71 chủng, trực khuẩn Gram âm là 13 chủng, nấm men là 11 chủng.  Tỷ lệ nuôi cấy dƣơng tính là 192 chủng chiếm tỷ lệ 6,2% trong đó cầu khuẩn Gram dƣơng là nhóm gây bệnh chiếm ƣu thế với tỷ lệ là 66,2%  Tỷ lệ nuôi cấy dƣơng tính theo độ đục DNT là : 52,5% đối với DNT đục, 2,3% với DNT lẫn máu, 1,1% với DNT trong và 0% với DNT vàng chanh. 2. Đặc điểm dịch tễ học của các tác nhân thường gặp  Streptococcus suis o Tỷ lệ mắc viêm màng não do căn nguyên S. suis chủ yếu ở nam giới và thƣờng ở nhóm tuổi trên 30 trong đó cao nhất là ở nhóm tuổi 50-59 với tỷ lệ 40%. o Tỷ lệ mắc viêm màng não do căn nguyên S. suis theo mùa vụ ghi nhận quanh năm, nhƣng có xu hƣớng tăng từ tháng 4 đến tháng 10 khi thời tiết nắng nóng đặc biệt là tháng 6 có 19 trƣờng hợp mắc bệnh.  Cryptococcus neoformans o Tỷ lệ mắc viêm màng não do Cryptococcus neoformans ở bệnh nhân HIV chiếm tỷ lệ 71,4% ở bệnh nhân HIV là 20-58, bệnh nhân không nhiễm HIV chiếm 28,6% ở nhóm tuổi 31-72. 3. Mức độ đề kháng với kháng sinh của các chủng S. suis  100% các chủng kháng trung gian với penicillin G trong đó 95% các chủng kháng trung gian với nồng độ MIC là 0,23 µg/ml và 5% các chủng kháng trung gian ở nồng độ MIC 0,32µg/ml  Tỷ lệ S. suis đề kháng kháng sinh: ceftriaxone 40%, chloramphenicol 28%, tetracycline 97,1%, KIẾN NGHỊ Dựa vào kết quả nghiên cứu đã tiến hành tại bệnh viện Bạch Mai, chúng tôi xin đề xuất một số kiến nghị sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu sự phân bố các vi khuẩn hiếu khí và nấm; triển khai nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn kỵ khí gây viêm màng não tại bệnh viện 2. Tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ học các tác nhân thƣờng gặp 3. Hằng năm, thông báo tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây viêm màng não tới bác sỹ lâm sàng trong toàn bệnh viện 4. Triển khai kỹ thuật kháng sinh đồ nấm các chủng nấm gây viêm màng não tại bệnh viện Bạch Mai . Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây vi m màng não tại bệnh vi n Bạch Mai từ năm 2008 đến 2010 Khƣơng Thị Doanh . LUẬN Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây vi m màng não trong thời gian từ 2008 đến 2010, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Căn nguyên vi khuẩn